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摘要：建立了植物甾醇酯的分析方法，包括植物甾醇酯中的总甾醇、游离甾醇和甾醇酯含量的分析。样品通过与KOH皂化，提取出植物甾醇，进行气相分析。采用内标法测定总甾醇和游离甾醇含量，通过计算得到甾醇酯含量。结果表明，此方法经济简单，分离度和重复性较好，准确度高。
关键词：植物甾醇酯 总甾醇 内标法
中图分类号：TQ645.9 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2013）18-0016-03
植物甾醇是从植物油工业副产物中得到的一种具有多种生理活性的天然活性物质，主要功效在于可降低人体低密度脂蛋白水平[1]并有抗癌、抗动脉粥样硬化、抗氧化和抗炎等功能[2]。但是由于植物甾醇的疏水性和弱油溶性导致了其在人体内的溶解性和生物利用性较差[3]。研究发现，不饱和脂肪酸和植物甾醇结合形成的不饱和脂肪酸植物甾醇酯可以提高植物甾醇的油溶性，并且安全性更高[4]，应用范围更广。由于植物甾醇酯的应用越来越广泛，传统的一些甾醇分析方法并不能够满足应用的需求，因此建立方便快捷的植物甾醇酯分析方法日趋重要。传统对甾醇的分析方法主要是毛地黄皂甙法、酶法、薄层色谱法、高效液相色谱法[6]、气相色谱[7]等方法，其中气相色谱分析法对各甾醇组分分离度较好，但需要经过衍生化处理导致步骤比较繁琐，另外，植物甾醇酯的沸点很高需要采用高温色谱柱来分析[8]，这对设备的要求很高且色谱柱损耗大进一步提高了分析成本。鉴于此，本文中采用的方法的优势在于植物甾醇酯样品经处理后，不需衍生化，可直接用气相色谱分析植物甾醇酯中总甾醇含量和游离甾醇含量并且对设备要求低，重复性好，操作简单，准确度高。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
无水乙醇（AR）、KOH（AR）、硫酸（AR）、丙酸酐（AR）、吡啶（AR）购于天津市科密欧化学试剂有限公司；植物甾醇（95）购于江苏春之谷生物制品有限公司；植物甾醇酯（95）购于cognis生物制品有限公司；胆固醇（95）购于湖南湘原植物生化有限公司；N，0一双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（简称BSTFA）（98）购于上海益民化工有限公司。
1.2 主要仪器
Agilent 6820气相色谱仪，Agilent Technol-ogies Inc；
氢火焰离子化检测器，Agilent Technologies Inc；
DB-5高温色谱柱（0.32*30），Agilent Technologies Inc；
PL203电子精密天平，梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司；
水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司。
1.3 气相色谱分析条件
检测器：FID，温度300℃；
气体流量：氢气30mL/min，空气300mL/min，载气：氮气，25mL/min；
进样温度300℃；
分流进样，分流比为50：1；
柱温（程升）：起始温度180℃，保持1min，以5℃/min升温至260℃，保持20min；
进样量0.6 L，柱压10psi。
1.4 样品的处理
1.4.1 植物甾醇95的标准曲线绘制
称取0.05 g植物甾醇95配成25mL浓度为2mg/mL的标准品溶液；称取0.05g内标物配成25mL浓度为2 mg/mL的内标物溶液；分别取标准品1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、4mL加入1mL内标物溶液后稀释到5mL，进样量为0.6μL。
1.4.2 总植物甾醇含量的测定
在250ml锥形瓶中加入0.3500g植物甾醇酯样品、 0.06g胆固醇内标物、5g氢氧化钾和50ml无水乙醇，在79℃下回流搅拌30分钟后向反应瓶中加入25ml水并用25ml正己烷萃取静置分层。最后，取2mL的上层液稀释4倍后进行气相检测（进样量为0.6μL），测定样品中总甾醇含量。
1.4.3 游离植物甾醇含量的测定
称取样品0.5000g，加入0.01g胆固醇内标物以及10mL正己烷，稀释3倍后进行气相检测，测定样品中游离甾醇的含量。
2 结果与讨论
2.1 气相色谱分析条件的选择
2.1.1 色谱柱的选择
植物甾醇属于高沸点、热稳定性好的物质，必须选择能耐高温、有良好惰性的柱子。本文采用具有以上特性的DB-5色谱柱（30m×0.32mm×0.10μm）。
2.1.2 程序的选择
程序升温速度应该适当，过快会使植物甾醇中各组份无法完全分离而过慢会使分析时间变长，峰型也较差。起始温度考查了160℃-210℃，最终确定的最适合温度为180℃，保持1min。另外，升温速率考查了3℃/min、5℃/min和10℃/min，并确定了5℃/min的最佳升温速度，在此升温程序下的植物甾醇分离效果好，出峰时间适合。最后当程序升温至260℃时保持20min。
2.2 衍生化方法的选择
分别考查了用丙酸酐酰化衍生化法、MSTFA硅烷化衍生化法及直接进样法对分析结果的影响。
丙酸酐衍生化法在吡啶溶剂下进行，回流10分钟，最终的气相色谱分析表明衍生化不完全（如图1），且溶剂用吡啶污染大；
MSTFA硅烷化试剂衍生化在正己烷溶剂下进行，70℃衍生化35分钟，气相色谱分析表明其衍生化也不完全（如图2）；
最后，在不衍生化直接进样条件下的分析结果显示（如图3），植物甾醇的分离度良好，峰型较好，重复三次的结果基本一致，表明直接进样的方式适用于植物甾醇的气相色谱分析。
2.3 内标物的选择 总植物甾醇定量分析采用内标标准曲线法，选用与植物甾醇性质相同的胆固醇作内标物。在气相色谱分析中胆固醇的出峰与其它峰能完全分开，峰型好，不拖尾而且试剂价格便宜，因此相比较而言胆固醇是一种理想的内标物。
2.4 标准曲线的绘制
以标准品溶液中植物甾醇与加入内标物质量之比（ΣM/Ms）作为横坐标（X），植物甾醇各组分峰面积之和与内标物峰面积之比（ΣA/As）作为纵坐标（Y），从而得到植物甾醇与内标物的相关曲线，其线性回归方程为：Y=1.2168X+0.0127，R=0.9988，具有良好的现性关系。
2.5 样品分析
2.5.1 总植物甾醇的计算
按1.4.2中的方法处理样品，测得Y=3.162，计算得出X=3.488，根据总植物甾醇含量（C）=X×Ms/m，得出C=59.8%；其中：C为总植物甾醇含量；m为甾醇酯样品的质量
2.5.2 游离植物甾醇的计算
按1.4.3中的方法处理样品，测定Y=0.589，计算得出X=0.065，因此，游离植物甾醇含量（c）=1.3%其中：c为游离植物甾醇含量。
2.5.3 植物甾醇酯含量的计算
由于植物甾醇酯转化来的植物甾醇含量W=C-c= 59.8%-1.3%=58.5%；则植物甾醇酯含量Z=W×672/410 ×100%=95.9%，结果与样品提供的检测报告相符。其中：672为植物甾醇酯的平均分子量，410为植物甾醇的平均分子量。
3 结语
本实验对植物甾醇酯样品的分析方法进行了系统的研究，最终确定了选择DB-5色谱柱，采用程序升温的方法，不需要衍生化，并确定了以胆固醇为内标物的标准曲线法定量分析样品中总植物甾醇和游离植物甾醇，计算得出植物甾醇酯的含量。该方法条件温和，准确度高，重复性好适用于植物甾醇酯样品的分析。
参考文献
[1]CHOI Y H，KONG K R，KIM Y A，et a1.Induction of bax and activation of caspases during beta-sitosterol-mediated apoptosis in human colon cancer cells[J].Int J Oncol，2003，23：1657—1662.
[2]NASHED B，YEGANEH B，HAYGLASS K T，et a1.Antiatherogenic efects of dietary plant sterols are associated with inhibition of proinflammatory cytokine production in Apo E—KO mice[J].J Nutr，2005，135：2438—2444.
[3]ENGEL R，SCHUBERT H.Formulation of phytosterols in emulsions for increased dose respo nse in functional foods [J].Innov Food Sci Emerging Technol，2005，6（2）：233—237.
[4]BYUNG H，CASIMIR C.Modeling and optimization of lipase-catalyzed synthesis of phytosterol esters of oleic acid by response surface methodo1ogy[J].Food Chemistry，2007，10（2）：336—342.
[5]顾欣.植物甾醇的气相色谱分析.宁波化工，2001，（2）：30-32.
[6]K.Warner.HPLC结合蒸发光散射检测法分析植物油中的维生素E和植物甾醇。国外分析仪器，2001，4：53-57.
[7]吴时敏，裘爱泳.植物甾醇及其制品分析.粮食与油脂，1999，（3）：41-44.
[8] 姜媛媛.高温GC-FID法分析植物甾醇酯.大连工业大学学报.
关键词：植物甾醇酯 总甾醇 内标法
中图分类号：TQ645.9 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2013）18-0016-03
植物甾醇是从植物油工业副产物中得到的一种具有多种生理活性的天然活性物质，主要功效在于可降低人体低密度脂蛋白水平[1]并有抗癌、抗动脉粥样硬化、抗氧化和抗炎等功能[2]。但是由于植物甾醇的疏水性和弱油溶性导致了其在人体内的溶解性和生物利用性较差[3]。研究发现，不饱和脂肪酸和植物甾醇结合形成的不饱和脂肪酸植物甾醇酯可以提高植物甾醇的油溶性，并且安全性更高[4]，应用范围更广。由于植物甾醇酯的应用越来越广泛，传统的一些甾醇分析方法并不能够满足应用的需求，因此建立方便快捷的植物甾醇酯分析方法日趋重要。传统对甾醇的分析方法主要是毛地黄皂甙法、酶法、薄层色谱法、高效液相色谱法[6]、气相色谱[7]等方法，其中气相色谱分析法对各甾醇组分分离度较好，但需要经过衍生化处理导致步骤比较繁琐，另外，植物甾醇酯的沸点很高需要采用高温色谱柱来分析[8]，这对设备的要求很高且色谱柱损耗大进一步提高了分析成本。鉴于此，本文中采用的方法的优势在于植物甾醇酯样品经处理后，不需衍生化，可直接用气相色谱分析植物甾醇酯中总甾醇含量和游离甾醇含量并且对设备要求低，重复性好，操作简单，准确度高。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
无水乙醇（AR）、KOH（AR）、硫酸（AR）、丙酸酐（AR）、吡啶（AR）购于天津市科密欧化学试剂有限公司；植物甾醇（95）购于江苏春之谷生物制品有限公司；植物甾醇酯（95）购于cognis生物制品有限公司；胆固醇（95）购于湖南湘原植物生化有限公司；N，0一双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（简称BSTFA）（98）购于上海益民化工有限公司。
1.2 主要仪器
Agilent 6820气相色谱仪，Agilent Technol-ogies Inc；
氢火焰离子化检测器，Agilent Technologies Inc；
DB-5高温色谱柱（0.32*30），Agilent Technologies Inc；
PL203电子精密天平，梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司；
水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司。
1.3 气相色谱分析条件
检测器：FID，温度300℃；
气体流量：氢气30mL/min，空气300mL/min，载气：氮气，25mL/min；
进样温度300℃；
分流进样，分流比为50：1；
柱温（程升）：起始温度180℃，保持1min，以5℃/min升温至260℃，保持20min；
进样量0.6 L，柱压10psi。
1.4 样品的处理
1.4.1 植物甾醇95的标准曲线绘制
称取0.05 g植物甾醇95配成25mL浓度为2mg/mL的标准品溶液；称取0.05g内标物配成25mL浓度为2 mg/mL的内标物溶液；分别取标准品1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、4mL加入1mL内标物溶液后稀释到5mL，进样量为0.6μL。
1.4.2 总植物甾醇含量的测定
在250ml锥形瓶中加入0.3500g植物甾醇酯样品、 0.06g胆固醇内标物、5g氢氧化钾和50ml无水乙醇，在79℃下回流搅拌30分钟后向反应瓶中加入25ml水并用25ml正己烷萃取静置分层。最后，取2mL的上层液稀释4倍后进行气相检测（进样量为0.6μL），测定样品中总甾醇含量。
1.4.3 游离植物甾醇含量的测定
称取样品0.5000g，加入0.01g胆固醇内标物以及10mL正己烷，稀释3倍后进行气相检测，测定样品中游离甾醇的含量。
2 结果与讨论
2.1 气相色谱分析条件的选择
2.1.1 色谱柱的选择
植物甾醇属于高沸点、热稳定性好的物质，必须选择能耐高温、有良好惰性的柱子。本文采用具有以上特性的DB-5色谱柱（30m×0.32mm×0.10μm）。
2.1.2 程序的选择
程序升温速度应该适当，过快会使植物甾醇中各组份无法完全分离而过慢会使分析时间变长，峰型也较差。起始温度考查了160℃-210℃，最终确定的最适合温度为180℃，保持1min。另外，升温速率考查了3℃/min、5℃/min和10℃/min，并确定了5℃/min的最佳升温速度，在此升温程序下的植物甾醇分离效果好，出峰时间适合。最后当程序升温至260℃时保持20min。
2.2 衍生化方法的选择
分别考查了用丙酸酐酰化衍生化法、MSTFA硅烷化衍生化法及直接进样法对分析结果的影响。
丙酸酐衍生化法在吡啶溶剂下进行，回流10分钟，最终的气相色谱分析表明衍生化不完全（如图1），且溶剂用吡啶污染大；
MSTFA硅烷化试剂衍生化在正己烷溶剂下进行，70℃衍生化35分钟，气相色谱分析表明其衍生化也不完全（如图2）；
最后，在不衍生化直接进样条件下的分析结果显示（如图3），植物甾醇的分离度良好，峰型较好，重复三次的结果基本一致，表明直接进样的方式适用于植物甾醇的气相色谱分析。
2.3 内标物的选择 总植物甾醇定量分析采用内标标准曲线法，选用与植物甾醇性质相同的胆固醇作内标物。在气相色谱分析中胆固醇的出峰与其它峰能完全分开，峰型好，不拖尾而且试剂价格便宜，因此相比较而言胆固醇是一种理想的内标物。
2.4 标准曲线的绘制
以标准品溶液中植物甾醇与加入内标物质量之比（ΣM/Ms）作为横坐标（X），植物甾醇各组分峰面积之和与内标物峰面积之比（ΣA/As）作为纵坐标（Y），从而得到植物甾醇与内标物的相关曲线，其线性回归方程为：Y=1.2168X+0.0127，R=0.9988，具有良好的现性关系。
2.5 样品分析
2.5.1 总植物甾醇的计算
按1.4.2中的方法处理样品，测得Y=3.162，计算得出X=3.488，根据总植物甾醇含量（C）=X×Ms/m，得出C=59.8%；其中：C为总植物甾醇含量；m为甾醇酯样品的质量
2.5.2 游离植物甾醇的计算
按1.4.3中的方法处理样品，测定Y=0.589，计算得出X=0.065，因此，游离植物甾醇含量（c）=1.3%其中：c为游离植物甾醇含量。
2.5.3 植物甾醇酯含量的计算
由于植物甾醇酯转化来的植物甾醇含量W=C-c= 59.8%-1.3%=58.5%；则植物甾醇酯含量Z=W×672/410 ×100%=95.9%，结果与样品提供的检测报告相符。其中：672为植物甾醇酯的平均分子量，410为植物甾醇的平均分子量。
3 结语
本实验对植物甾醇酯样品的分析方法进行了系统的研究，最终确定了选择DB-5色谱柱，采用程序升温的方法，不需要衍生化，并确定了以胆固醇为内标物的标准曲线法定量分析样品中总植物甾醇和游离植物甾醇，计算得出植物甾醇酯的含量。该方法条件温和，准确度高，重复性好适用于植物甾醇酯样品的分析。
参考文献
[1]CHOI Y H，KONG K R，KIM Y A，et a1.Induction of bax and activation of caspases during beta-sitosterol-mediated apoptosis in human colon cancer cells[J].Int J Oncol，2003，23：1657—1662.
[2]NASHED B，YEGANEH B，HAYGLASS K T，et a1.Antiatherogenic efects of dietary plant sterols are associated with inhibition of proinflammatory cytokine production in Apo E—KO mice[J].J Nutr，2005，135：2438—2444.
[3]ENGEL R，SCHUBERT H.Formulation of phytosterols in emulsions for increased dose respo nse in functional foods [J].Innov Food Sci Emerging Technol，2005，6（2）：233—237.
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[5]顾欣.植物甾醇的气相色谱分析.宁波化工，2001，（2）：30-32.
[6]K.Warner.HPLC结合蒸发光散射检测法分析植物油中的维生素E和植物甾醇。国外分析仪器，2001，4：53-57.
[7]吴时敏，裘爱泳.植物甾醇及其制品分析.粮食与油脂，1999，（3）：41-44.
[8] 姜媛媛.高温GC-FID法分析植物甾醇酯.大连工业大学学报.