目的:通过球孢虫草、蛹虫草EST设计EST-SSR引物,建立虫草属EST-SSR标记系统。方法:从NCBI公共数据库下载获得虫草EST,利用Sequece Seiners 1.2软件去除冗余序列并设计引物,进行PAGE电泳。结果:通过去除EST总序列中低质量的和冗余的序列后,得到全长为2 953 173 bp的4 556条无冗余球孢虫草EST。从中发掘出718个EST-SSR,分布于616条EST中,出现频率是15.8%。平均分布频率是每4 096 bp出现1个,三核苷酸重复序列有419个,是出现最多的重复类型。蛹虫草EST去冗余后得到1 363条无冗余EST,共含有1 117个EST-SSR,出现频率为81.95%,出现最多的重复类型是A核苷酸重复。根据球孢虫草EST-SSR序列,设计合成50对引物,有扩增产物的引物为34对,占总设计引物数的68%。根据蛹虫草EST-SSR,设计合成40对引物,有扩增产物的引物为39对,占总设计引物数的97.5%。基于SSR标记进行聚类分析,7种虫草无性型均能分开,且分为4支。结论:虫草属EST-SSR出现频率较高、类型较丰富、多态性潜能较高,具有较高的利用价值。球孢虫草和蛹虫草EST开发的SSR标记在虫草属有较好的转移性与通用性,可以很好的应用于虫草种间遗传关系的研究。应用虫草物种EST建立分子标记是一条简便而又有效的途径。