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摘要：用荧光光度法考察陈皮纯化物、原花青素、儿茶素及其组合物对·OH和蒽的清除能力。他们对·OH的IC50值分别为：0.190、0.080和 0.088g/L，对蒽的IC50值分别为0.070、1.084和1.019g/L。用正交试验方法来优化其的组合，发现清除·OH的最佳组合是陈皮纯化物：原花青素：儿茶素为1：2：2；清除蒽的最佳组合为2：1：2。
关键词：陈皮纯化物 原花青素 儿茶素 抗氧化性
自由基与免疫性疾病和心血管疾病等的发生密切相关[1]。自由基和多环芳烃及其氧化产生的中间产物能够伤害生物膜、维生素、蛋白质及活细胞，已明确许多疾病都与自由基和多环芳烃有关[2-3]。但目前的研究主要考察在一定温度下抗氧化剂对自由基或多环芳烃抗氧化能力的影响。许多植物的有效成份是天然的强抗氧化剂，有很强的清除自由基和多环芳烃的能力[4]。陈皮黄酮、原花青素和儿茶素有很强的清除自由基和多环芳烃的能力[5-6]。抗氧化活性取决其独特的分子结构及分子中大量的酚羟基[7-9]。但对这三种物质的抗氧化性的综合性研究未见报道。论文研究了温度、时间对其抗氧化能力的影响，通过正交实验考察了其分别对·OH和蒽清除的最佳配比，为天然抗氧化剂的开发提供理论依据。
1 实验方法
1.1 三种抗氧化剂分别对·OH的清除
1.1.1 清除·OH的测定：用Fenton反应(H2O2／Fe2+反应体系)产生·OH，羟苯甲酸可发荧光，往体系中加入苯甲酸捕获过量·OH生成羟苯甲酸，检测羟苯甲酸的荧光强度考察抗氧化剂对·OH清除作用。比色管中依次加入磷酸缓冲液(PH=7.0)2mL，10mmoL/L Fe+2-EDTA(1:1)溶液1mL，30mmoL/L苯甲酸10mL，乙醇-抗氧化剂(8mL)，最后加入20mmoL/L H2O20.5mL启动反应，在50或70℃、300nm(Ex)/408nm(Em)条件下测量荧光强度。清除率按下面公式计算：
清除率(%）=(F0-Fs)/F0×100% （*）
（F0：不含抗氧化反应液的荧光强度；Fs：含抗氧化反应液的荧光强度）
1.1.2 依1.1.1设计体系(荧光强度至不再变化作为反应完全的标志，间隔检测时间为10min)考察反应温度(30、50、70℃)、抗氧化剂浓度、时间对清除反应的影响及计算清除率。
1.2 三种抗氧化剂分别对蒽的清除
1.2.1 体系设计：利用多环芳烃(蒽)荧光强度的变化考察陈皮黄酮对多环芳烃的清除作用。在比色管中依次加入0.3mg/L蒽5mL，乙醇—抗氧化剂(共5mL)反应，分别在50和70 ℃下一定时间后，在355nm(Ex)/398nm(Em)条件下测量蒽的荧光强度。
1.2.2 反应温度、时间、抗氧化剂浓度对清除反应的影响：反应体系(抗氧化剂浓度为：0.151g/L)，在一定温度下反应一定时间后测量荧光强度至荧光强度不再变化。
1.3 三抗氧化剂协同抗氧化性的研究：设计3因素2水平正交实验L4(23)考察氧化剂组合对蒽和·OH的清除，再据正交结果得出他们对蒽和·OH清除的最佳质量组合。
2 结果与讨论
2.1 三种抗氧化剂分别对·OH的清除
2.1.1 反应温度、时间对清除反应的影响
不同温度三种抗氧化剂对·OH清除的荧光动力学曲线如图1（A）。在反应的开始阶段荧光强度不断升高，到一定值时基本不变，认为此时清除完全。当体系为30、50、70℃时，陈皮黄酮体系完全反应时间分别约为180、90和40min；葡萄籽原花青素分别为：120、60和40min。而儿茶素三曲线基本重合，温度对儿茶素抗氧化性影响不大，完全反应的时间为70min。造成各体系完全反应时间不同的原因是各抗氧化剂给出质子能力不同引起的。
2.1.2 抗氧化剂浓度、反应温度对清除反应的影响
抗氧化剂浓度、反应温度对·OH清除的影响见图1（B）。三种抗氧化剂对·OH均有较强的清除能力。当温度升高陈皮黄酮和原花青素的抗氧化性均有一定程度的提高，而儿茶素基本维持不变。当30℃时他们对·OH的IC50值分别为：0.296、0.105和0.175g/L；50℃时分别为：0.220、0.105和0.109g/L；70℃时分别为：0.170、0.105和0.045g/L。
2.2 反应温度、抗氧化剂浓度对清除蒽的影响
2.2.1 反应温度、时间对清除反应的影响
不同温度三种抗氧化剂对蒽清除荧光动力学曲线如图1（C）。在间隔检测时间前荧光强度已达最大值，可认为清除反应在检测前10min内已完全反应，温度对清除蒽的影响很小。
2.2.2 抗氧化剂浓度、反应温度对清除率的影响
由图1（D）可知，陈皮黄酮、儿茶素和葡萄籽原花青素对蒽均有较强的清除能力，清除能力为：陈皮黄酮＞原花青素＞儿茶素。温度的变化对其清除蒽的影响不大，对蒽的IC50值分别为：0.104、0.912和0.225g/L。
2.3 正交分析
设计正交实验考察抗氧化效果，结果如表1，对清除·OH儿茶素的浓度越高清除效果越好，当陈皮黄酮，葡萄籽原花青素和儿茶素以1：2：2的质量比进行组合时清除效率最佳，对蒽进行清除时陈皮黄酮起主要作用的清除作用，它们对蒽清除的最佳质量组合为2：1：2。
2.4 三抗氧化剂协调作用的研究
陈皮黄酮、葡萄籽原花青素、儿茶素及其组合物对·OH和蒽的清除结果见图2，清除·OH的能力顺序为：b＞c＞a；清除蒽的能力顺序为：a＞c＞b。四种组合抗氧化剂对·OH和蒽的清除能力均介于清除能力最强和最弱的二抗氧化剂间，即组合物间有一定的协同抗氧化性。
3 结论
3.1 温度升高陈皮黄酮和葡萄籽原花青素对·OH的清除效果增强。温度对陈皮黄酮和葡萄籽原花青素的抗氧化有较大的影响，而对儿茶素的影响不大。三抗氧化剂对蒽的清除反应快，反应时间短，其清除能力顺序为：陈皮黄酮＞原花青素＞儿茶素。
3.2 当陈皮黄酮、葡萄籽原花青素和儿茶素以1：2：2的质量比组合时对·OH进行清除时效果最好；对蒽进行清除时则以2：1：2进行组合最理想。
参考文献：
[1]A.V.-W.Tahereh，etc.Free Radicals and the Pathogenesis of Type 1 Diabetes β-Cell Cytokine-Mediated Free Radical Generation Via Cyclooxygenase-2 [J].Diabetes,2003,52:1994-1999.
[2]N.Almaraz-Abarca. Antioxidant activity of polyphenolic extract of monofloral honeybee-collected pollen from mesquite (Prosopis juliflora,Leguminosae)[J].Journal of Food Composition and Analysis,2007,20:119-124.
[3]张瑞菊,等.陈皮中黄酮类化合物的抗氧化性[J].食品与药品,2007,9(11A),22-24.
[4]Hersh,Theodore (Atlanta,GA),Hersh,Rebecca.Glutathione,green tea,grape seed extract to neutralize tobacco free radicals[P].Thione International,Inc.(Atlanta,GA):2002,US006470894.
[5]苏丹,等.陈皮提取液抗氧化及延缓衰老作用的研究[J].华东师范大学学报(自然科学版),1999,(1):110-112.
[6]何小解,等.儿茶素清除O_2~-·与·OH的能力[J].中南大学学报(医学版),2006，(1):138-140.
[7]石碧，狄莹.植物多酚[M]. 京:科学出版社,2000:124-146.
[8]S.Sang,etc.,Chemical studies on antioxidant mechanism of tea catechins: analysis of radical reaction products of catechin and epicatechin with 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl.[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry，2002，10（7）：2233-2237.
[9]王丽，等.儿茶素分光光度法与微量法抗氧化活性研究[J].天然产物研究与开发.2009，（4）：664-666.
关键词：陈皮纯化物 原花青素 儿茶素 抗氧化性
自由基与免疫性疾病和心血管疾病等的发生密切相关[1]。自由基和多环芳烃及其氧化产生的中间产物能够伤害生物膜、维生素、蛋白质及活细胞，已明确许多疾病都与自由基和多环芳烃有关[2-3]。但目前的研究主要考察在一定温度下抗氧化剂对自由基或多环芳烃抗氧化能力的影响。许多植物的有效成份是天然的强抗氧化剂，有很强的清除自由基和多环芳烃的能力[4]。陈皮黄酮、原花青素和儿茶素有很强的清除自由基和多环芳烃的能力[5-6]。抗氧化活性取决其独特的分子结构及分子中大量的酚羟基[7-9]。但对这三种物质的抗氧化性的综合性研究未见报道。论文研究了温度、时间对其抗氧化能力的影响，通过正交实验考察了其分别对·OH和蒽清除的最佳配比，为天然抗氧化剂的开发提供理论依据。
1 实验方法
1.1 三种抗氧化剂分别对·OH的清除
1.1.1 清除·OH的测定：用Fenton反应(H2O2／Fe2+反应体系)产生·OH，羟苯甲酸可发荧光，往体系中加入苯甲酸捕获过量·OH生成羟苯甲酸，检测羟苯甲酸的荧光强度考察抗氧化剂对·OH清除作用。比色管中依次加入磷酸缓冲液(PH=7.0)2mL，10mmoL/L Fe+2-EDTA(1:1)溶液1mL，30mmoL/L苯甲酸10mL，乙醇-抗氧化剂(8mL)，最后加入20mmoL/L H2O20.5mL启动反应，在50或70℃、300nm(Ex)/408nm(Em)条件下测量荧光强度。清除率按下面公式计算：
清除率(%）=(F0-Fs)/F0×100% （*）
（F0：不含抗氧化反应液的荧光强度；Fs：含抗氧化反应液的荧光强度）
1.1.2 依1.1.1设计体系(荧光强度至不再变化作为反应完全的标志，间隔检测时间为10min)考察反应温度(30、50、70℃)、抗氧化剂浓度、时间对清除反应的影响及计算清除率。
1.2 三种抗氧化剂分别对蒽的清除
1.2.1 体系设计：利用多环芳烃(蒽)荧光强度的变化考察陈皮黄酮对多环芳烃的清除作用。在比色管中依次加入0.3mg/L蒽5mL，乙醇—抗氧化剂(共5mL)反应，分别在50和70 ℃下一定时间后，在355nm(Ex)/398nm(Em)条件下测量蒽的荧光强度。
1.2.2 反应温度、时间、抗氧化剂浓度对清除反应的影响：反应体系(抗氧化剂浓度为：0.151g/L)，在一定温度下反应一定时间后测量荧光强度至荧光强度不再变化。
1.3 三抗氧化剂协同抗氧化性的研究：设计3因素2水平正交实验L4(23)考察氧化剂组合对蒽和·OH的清除，再据正交结果得出他们对蒽和·OH清除的最佳质量组合。
2 结果与讨论
2.1 三种抗氧化剂分别对·OH的清除
2.1.1 反应温度、时间对清除反应的影响
不同温度三种抗氧化剂对·OH清除的荧光动力学曲线如图1（A）。在反应的开始阶段荧光强度不断升高，到一定值时基本不变，认为此时清除完全。当体系为30、50、70℃时，陈皮黄酮体系完全反应时间分别约为180、90和40min；葡萄籽原花青素分别为：120、60和40min。而儿茶素三曲线基本重合，温度对儿茶素抗氧化性影响不大，完全反应的时间为70min。造成各体系完全反应时间不同的原因是各抗氧化剂给出质子能力不同引起的。
2.1.2 抗氧化剂浓度、反应温度对清除反应的影响
抗氧化剂浓度、反应温度对·OH清除的影响见图1（B）。三种抗氧化剂对·OH均有较强的清除能力。当温度升高陈皮黄酮和原花青素的抗氧化性均有一定程度的提高，而儿茶素基本维持不变。当30℃时他们对·OH的IC50值分别为：0.296、0.105和0.175g/L；50℃时分别为：0.220、0.105和0.109g/L；70℃时分别为：0.170、0.105和0.045g/L。
2.2 反应温度、抗氧化剂浓度对清除蒽的影响
2.2.1 反应温度、时间对清除反应的影响
不同温度三种抗氧化剂对蒽清除荧光动力学曲线如图1（C）。在间隔检测时间前荧光强度已达最大值，可认为清除反应在检测前10min内已完全反应，温度对清除蒽的影响很小。
2.2.2 抗氧化剂浓度、反应温度对清除率的影响
由图1（D）可知，陈皮黄酮、儿茶素和葡萄籽原花青素对蒽均有较强的清除能力，清除能力为：陈皮黄酮＞原花青素＞儿茶素。温度的变化对其清除蒽的影响不大，对蒽的IC50值分别为：0.104、0.912和0.225g/L。
2.3 正交分析
设计正交实验考察抗氧化效果，结果如表1，对清除·OH儿茶素的浓度越高清除效果越好，当陈皮黄酮，葡萄籽原花青素和儿茶素以1：2：2的质量比进行组合时清除效率最佳，对蒽进行清除时陈皮黄酮起主要作用的清除作用，它们对蒽清除的最佳质量组合为2：1：2。
2.4 三抗氧化剂协调作用的研究
陈皮黄酮、葡萄籽原花青素、儿茶素及其组合物对·OH和蒽的清除结果见图2，清除·OH的能力顺序为：b＞c＞a；清除蒽的能力顺序为：a＞c＞b。四种组合抗氧化剂对·OH和蒽的清除能力均介于清除能力最强和最弱的二抗氧化剂间，即组合物间有一定的协同抗氧化性。
3 结论
3.1 温度升高陈皮黄酮和葡萄籽原花青素对·OH的清除效果增强。温度对陈皮黄酮和葡萄籽原花青素的抗氧化有较大的影响，而对儿茶素的影响不大。三抗氧化剂对蒽的清除反应快，反应时间短，其清除能力顺序为：陈皮黄酮＞原花青素＞儿茶素。
3.2 当陈皮黄酮、葡萄籽原花青素和儿茶素以1：2：2的质量比组合时对·OH进行清除时效果最好；对蒽进行清除时则以2：1：2进行组合最理想。
参考文献：
[1]A.V.-W.Tahereh，etc.Free Radicals and the Pathogenesis of Type 1 Diabetes β-Cell Cytokine-Mediated Free Radical Generation Via Cyclooxygenase-2 [J].Diabetes,2003,52:1994-1999.
[2]N.Almaraz-Abarca. Antioxidant activity of polyphenolic extract of monofloral honeybee-collected pollen from mesquite (Prosopis juliflora,Leguminosae)[J].Journal of Food Composition and Analysis,2007,20:119-124.
[3]张瑞菊,等.陈皮中黄酮类化合物的抗氧化性[J].食品与药品,2007,9(11A),22-24.
[4]Hersh,Theodore (Atlanta,GA),Hersh,Rebecca.Glutathione,green tea,grape seed extract to neutralize tobacco free radicals[P].Thione International,Inc.(Atlanta,GA):2002,US006470894.
[5]苏丹,等.陈皮提取液抗氧化及延缓衰老作用的研究[J].华东师范大学学报(自然科学版),1999,(1):110-112.
[6]何小解,等.儿茶素清除O_2~-·与·OH的能力[J].中南大学学报(医学版),2006，(1):138-140.
[7]石碧，狄莹.植物多酚[M]. 京:科学出版社,2000:124-146.
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