论文部分内容阅读
摘要:以成熟的澳洲坚果为试验材料,分别选用水和体积分数70%甲醇、70%乙醇与70%丙酮4种溶剂对澳洲坚果的新鲜果皮进行浸提,测定各溶剂提取物的总酚、总黄酮与单宁含量及其抗氧化活性。结果表明,不同溶剂对澳洲坚果果皮中总酚、总黄酮与单宁含量以及DPPH、ABTS自由基清除能力与总抗氧化能力方面存在明显差异,以体积分数70%丙酮提取物的总酚、总黄酮与单宁含量最高,分别为(6.63±0.15) mg/g(FW)、(8.65±0.32) mg/g(FW)、(8.80±0.31) mg/g(FW)。其次是70%甲醇、70%乙醇;水提取物的含量最低。相关性分析表明,提取物中的总酚含量与其抗氧化能力显著相关。可见,提取剂的性质明显影响其提取物的酚类物质含量与抗氧化活性。
关键词:澳洲坚果果皮;溶剂提取物;多酚;黄酮;抗氧化活性
中图分类号: S667.901 文献标志码: A 文章编号:1002-1302(2017)01-0171-04
澳洲坚果(Macadamia spp.)别称夏威夷果,原产于澳洲,属于山龙眼科(Proteaceae)澳洲坚果属(Macadamia F. Mull)常绿乔木果树,被誉为世界“干果之王”,以富含多种不饱和脂肪酸为主要特点,还含有蛋白质、矿质元素和维生素等,具有较高的营养价值和保健功效。 作为一种新兴的高档坚果类果品,澳洲坚果在国际市场上供不应求,具有广阔的市场前景。近年来,中国澳洲坚果产业得到迅猛发展,目前种植规模已达652 km2,年产带壳果约9 700 t[1]。
澳洲坚果果实主要由果皮、种壳和果仁组成,其初加工的主要副产物为约占果实鲜质量的1/2的果皮和约占带壳果干质量的2/3种壳。当前国内外对澳洲坚果果仁的营养成分[2-5]与保健价值[6-7]、种壳的功能性組分[8-10]及开发利用[11-13]等方面的研究报道较多,但对果皮内含物的研究仅见于不同种质果皮的粗蛋白、可溶性糖、单宁及矿质元素含量的测定与分析[14-15],至今尚未见有果皮酚类物质及其抗氧化活性研究的报道。本试验采用水和体积分数70%甲醇、70%乙醇与70%丙酮4种溶剂浸提澳洲坚果果皮,研究不同溶剂提取物的总酚和总黄酮含量及其抗氧化活性的差异,旨在探讨适宜获得澳洲坚果果皮中天然抗氧化物质的提取溶剂,为开发和利用澳洲坚果果皮这一副产物资源提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试澳洲坚果果皮为已成熟的澳洲坚果新鲜果实,采自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所种质资源圃,分离出果皮,于-80 ℃冰箱中保存备用。
主要仪器有紫外可见分光光度计UV-1200,上海美谱达仪器有限公司;电子分析天平ML204,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;高速冷冻离心机Heraeus Multifuge X1R,德国Thermo Fisher Scientific公司。
主要试剂包括Folin-Cioealteu试剂、没食子酸、芸香苷、Trolox(水溶性维生素E类似物)、DPPH、ABTS、TPTZ,均购自美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 方法
1.2.1 提取物制备 准确称取澳洲坚果果皮1.0 g,放入研钵中,液氮研磨成粉末,转移至15 mL离心管中,分别以体积分数为70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮和水,料液比为 1 g ∶10 mL,充分混匀后置于37 ℃水浴中浸提1 h,4 ℃ 离心(2 200 g)20 min,取上清备用。
1.2.2 总酚含量测定 总酚含量的测定采用改良Folin-Cioealteu 法[16]。取0.5 mL样品溶液与2.5 mL 10% Folin-Cioealteu反应液于15 mL试管中,充分混匀,避光孵育5 min后与2.0 mL 20% Na2CO3溶液充分混匀,30 ℃水浴避光反应1 h,于765 nm下测定吸光度,重复3次。以没食子酸标准品制作标准曲线计算总酚含量(mg/g,FW)。
1.2.3 总黄酮含量测定 总黄酮含量的测定参照Benamar等的方法[17]。取0.5 mL样品溶液与0.5 mL 5% NaNO2溶液于15 mL试管中,充分混匀,反应5 min后加入0.5 mL 10% AlCl3摇匀,静置6 min;再加入1.5 mL 1.0 mol/L NaOH,于40 ℃水浴中避光反应15 min后,于510 nm下测定吸光度,重复3次。以芸香苷标准品制作标准曲线计算总黄酮的含量(mg/g,FW)。
1.2.4 单宁含量的测定 单宁含量的测定参照等的方法。取2 mL样品溶液加入含有25 mL蒸馏水和2.5 Folin-Donis试剂的容量瓶中,加入1mol/L的碳酸钠溶液,剧烈振荡,于30 ℃恒温箱中放置1.5 h后,于680 nm下测定吸光度,重复3次。以单宁标样绘制标准曲线计算单宁含量(mg/g,FW)。
1.2.5 抗氧化活性测定 DPPH自由基清除能力的测定。参照Vieira等的方法[18],利用60 mL甲醇和40 mL乙酸钠缓冲液(0.1 mol/L,pH值5.5)现配DPPH溶液(50 μmol/L)。取 2.9 mL DPPH溶液,于517 nm下测定其初始吸光度(D0);取2.9 mL DPPH溶液和0.1 mL样品溶液充分混匀后,于 30 ℃ 水浴中避光反应15 min,测定其吸光度(D15)。以甲醇-乙酸钠缓冲液为空白调0,重复测定3次。样品的DPPH自由基清除率按[100%-(D15/D0)× 100%]计算,用Trolox为标准物制作标准曲线计算其抗氧化活性。
ABTS自由基清除能力的测定。参照Re等的方法[19],将现配的ABTS反应液(7 mmol/L)用80%乙醇稀释至734 nm的吸光度为0.70±0.02,作为其初始吸光度(D0);取0.1 mL样品溶液与2.9 mL稀释了的ABTS反应液混匀,于30 ℃水浴中避光反应7 min,测定其吸光度(D7)。以80%乙醇为空白调0,重复测定3次。样品的ABTS自由基清除率按[100%-(D7/D0)× 100%]计算,以Trolox为标准物制作标准曲线计算其抗氧化能力。 总抗氧化能力的测定。参照Benzie等的FRAP法[20],将乙酸钠缓冲液(0.3 mol/L,pH值3.6)、TPTZ(10 mmol/L)与FeCl3·6H2(20 mmol/L)按体积比10 ∶1 ∶1现配FRAP试剂,取0.15 mL样品溶液和2.85 mL FRAP反应液混匀,于 37 ℃ 水浴中避光反应20 min后,于593 nm下测定其吸光度,重复测定3次。以FeSO4为标准物制作标准曲线计算其总抗氧化能力。
1.2.6 统计分析 用SPSS 17.0软件进行数据整理与统计分析。
2 结果与分析
2.1 澳洲坚果果皮不同溶剂提取物的总酚、总黄酮与单宁含量
水和体积分数70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮为提取溶剂,测定澳洲坚果果皮的总酚(没食子酸等效物)、总黄酮(芸香苷等效物)和单宁(单宁酸等效物)的含量(表1)。由表1可知,不同溶剂提取的总酚、总黄酮、单宁含量均具有一定差异,其中体积分数为70%丙酮的提取效果最佳,其次是体积分数为70%的甲醇和70%的乙醇,水提取效果最差。70%丙酮提取液总酚含量(6.63 mg/g,FW)、总黄酮含量(8.65 mg/g,FW)、单宁含量(8.80 mg/g,FW)显著高于70%乙醇(4.70、4.45、5.18 mg/g,FW )、70%甲醇(4.39、3.9、5.19 mg/g,FW)和水(2.28、2.74、2.31 mg/g,FW)。比较而言,体积分数70%丙酮提取液的总酚、总黄酮与单宁含量分别约是体积分数70%甲醇与70%乙醇提取液的1.5、2.0、1.7倍,说明对澳洲坚果果皮中的总酚、总黄酮与单宁这3种物质,体积分数为70%丙酮的提取效果最好。
2.2 澳洲坚果果皮不同溶剂提取物的抗氧化活性
2.2.1 总抗氧化能力FRAP FRAP法是一种快速简便、重复性好的测定总抗氧化能力的方法,待测生物活性物质将Fe3 还原为Fe2 的能力越大,其抗氧化活性越强。本研究是以Fe2 当量计算澳洲坚果果皮提取物的总抗氧化能力,结果见图1。图1表明,不同溶剂提取液的总抗氧化能力具有显著差异,总抗氧化能力大小排序为70%丙酮>70%乙醇>70%甲醇>水,总抗氧化能力依次为(191.43±6.72)、(109.86±6.33)、(100.58±7.27)、(62.54±0.98) μmol/g。其中,70%丙酮提取液的总抗氧化能力显著高于醇提取液和水。体积分数70%丙酮提取液的总抗氧化能力约是醇提取液的1.9倍和水提取液的3.1倍。
2.2.2 DPPH自由基清除能力差异 DPPH法常用于抗氧
化剂清除自由基能力的评价。本研究中,以标准抗氧化剂Trolox为等效物来衡量澳洲坚果果皮4种溶剂提取物的 DPPH 自由基清除能力,结果如图2所示。图2表明,不同溶剂提取液对DPPH自由基清除能力不同,其对DPPH自由基清除能力顺序为70%甲醇提取溶剂[(104.67±2.54) μmol/g,FW ]> 70%丙酮提取溶剂[(51.30±1.99) μmol/g,FW ]> 70%乙醇提取溶剂[(35.61±5.85) μmol/g,FW ]> 水[(34.19±0.40) μmol/g,FW]。4种溶剂中体积分数70%甲醇提取溶剂的DPPH自由基清除能力显著高于其他3种,而70%丙酮、70%乙醇和水3种溶剂的DPPH自由基清除能力差异不显著,说明70%甲醇是澳洲坚果DPPH自由基清除能力的最佳提取溶剂。
2.2.3 ABTS自由基清除作用 与DPPH自由基类似,ABTS 与抗氧化剂反应后溶液发生褪色,溶液褪色越明显,则表明所检测物质的抗氧化能力越强。本研究以Trolox为标准计算澳洲坚果果皮4种溶剂提取物的ABTS自由基清除能力,结果见图3。由图3可知,不同溶剂提取液对ABTS自由基的清除能力不同,其对ABTS自由基清除能力的强弱顺序依次为70%丙酮[(136.31±6.09) μmol/g,FW]>70%甲醇[(100.79±0.93) μmol/g,FW ]>70%乙醇[(81.13±3.35) μmol/g,FW]>水[(60.35±0.67) μmol/g,FW]。4种溶剂中,体积分数70%丙酮提取溶剂的ABTS自由基清除能力显著高于其他3种,70%甲醇、70%乙醇提取溶剂ABTS自由基清除能力差异不显著,说明70%丙酮是澳洲坚果ABTS自由基清除能力的最佳提取溶剂。
2.3 澳洲坚果果皮总酚含量与抗氧化能力的相关性分析
相关性分析(表2)表明,总酚含量与单宁含量呈极显著正相关(r=0.901),与总黄酮含量不相关,由此说明单宁类化合物是澳洲坚果果皮酚类物质的主要组成部分。此外,总酚与DPPH、ABTS、FRAP清除率呈极显著正相关,相关系数分别为0.901、0.978、0.921;单宁含量和DPPH、ABTS、FRAP清除率呈极显著正相关,相关系数分别为0.972、0.919、0.998;而总黄酮含量与DPPH、ABTS、FRAP清除率不相关,说明酚类物质在澳洲坚果果皮抗氧化能力方面发挥着重要作用。总酚含量和抗氧化活性测定的3个指标均有显著相关性,表明DPPH、ABTS、FRAP清除率均适用于澳洲坚果进行抗氧化能力的分析。
3 结论与讨论
澳洲坚果果皮是澳洲坚果初加工后遗留的副产物,在整个果实中占较大比重。目前,国内外澳洲坚果加工企业对果皮的回收利用还不够重视,造成资源浪费,而且对环境还有一定的污染。对山核桃[21-22]、柑橘[23]、荔枝[24]等研究表明,果皮含有很多天然抗氧化成分,具有抗氧化、抗致突变、抗衰老、抗炎和抑菌等活性。植物多酚类物质是天然的抗氧化剂,可有效地协助维持体内自由基代谢的平衡,减少或防止相关疾病的发生[25]。虽然张明楷等报道了澳洲坚果果皮富含单宁物質[14],但对果皮的抗氧化活性尚未有研究。本研究结果表明,澳洲坚果果皮提取物含有较丰富的酚类与黄酮类化合物,对DPPH与ABTS自由基具有较强的清除能力,且具有较高的总抗氧化能力,表明澳洲坚果果皮提取物具有较好的抗氧化活性,可在防衰老、抗炎症等方面发挥作用。然而,对于澳洲坚果果皮提取物中的活性成分及其作用机理,还有待于进一步研究。 不同溶劑制备的提取物中多酚类含量及其抗氧化活性显著不同,这可能与提取剂的极性有关[26]。以水、甲醇、乙醇、丙酮为提取溶剂,提取石榴皮[27]、紫苏草[28]、板栗[29]、高粱[30]、枣果渣[31]的抗氧化活性物质并对其抗氧化活性能力的分析发现,丙酮溶剂提取物的抗氧化活性显著高于其他3种溶剂,其次是甲醇和乙醇,水最低。而菠萝[32]、红薯叶[33]和翠云草[34]的抗氧化研究中发现,甲醇提取溶剂的抗氧化效果最好。本研究中利用不同极性的溶剂提取澳洲坚果果皮中抗氧化物质,所获提取物中的总酚、总黄酮与单宁含量也显著不同,以致不同溶剂提取物清除DPPH和ABTS自由基能力以及总抗氧化能力存在显著差异。其中,丙酮溶剂提取物的抗氧化能力显著高于水、甲醇和乙醇。综合分析4种提取溶剂抗氧化物的FRAP、ABTS和DPPH自由基清除能力可知,4种溶剂提取物均具有一定抗氧化能力,其中丙酮溶剂提取物抗氧化能力最高,其次是甲醇和乙醇,水提取物的抗氧化能力最低。综上所述,体积分数70%丙酮溶剂为提取澳洲坚果果皮中的抗氧化物质最佳溶剂。
通过DPPH、ABTS和FRAP等方法对澳洲坚果果皮抗氧化活性测定发现,总酚含量与3种测定指标均具有显著相关性,该结果也客观反映了3种方法测定澳洲坚果果皮抗氧化活性的准确性。
参考文献:
[1]中国热带农业科学院.中国热带作物产业可持续发展研究[M]. 北京:科学出版社,2014:147-152.
[2]Maguire L S,Oconnor T P,Obrien N M,et al. Fatty acid profile,tocopherol,squalene and phytosterol content of walnuts,almonds,peanuts,hazelnuts and the macadamia nut[J]. Journal of Food Science and Nutrition,2004,55(3):171-178.
[3]Venkatachalam M,Sathe S K. Chemical composition of selected edible nut seeds[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(13):4705-4714.
[4]杜丽清,邹明宏,曾 辉,等. 澳洲坚果果仁营养成分分析[J]. 营养学报,2010,32(1):95-96.
[5]杨为海,张明楷,邹明宏,等. 澳洲坚果不同种质果仁粗脂肪及脂肪酸成分的研究[J]. 热带作物学报,2012,33(7):1297-1302.
[6]Curb J D,Wergowske G,Dobbs J C,et al. Serum lipid effects of high-monounsaturated fat diet based on macadamia nuts[J]. Archives of Internal Medicine,2000,160(8):1154-1158.
[7]Garg M L,Blake R J,Wills R B. Macadamia nut consumption lowers plasma total and LDL cholesterol levels in hypercholesterolemic men[J]. Journal of Nutrition,2003,133(4):1060-1063.
[8]石 柳,王金华,熊 智,等. 澳洲坚果壳中纤维素和木质素成分分析[J]. 湖北农业科学,2009,48(11):2846-2848.
[9]杨为海,张明楷,曾 辉,等. 澳洲坚果种壳矿质元素含量研究[J]. 湖北农业科学,2011,50(23):4958-4961.
[10]芦燕玲,李亮星,魏 杰,等. 气质联用法分析澳洲坚果壳的挥发性成分[J]. 化学研究与应用,2012,24(3):433-436.
[11]宁 平,杨月红,彭金辉,等. 澳洲坚果壳活性炭制备的热解特性研究[J]. 林产化学与工业,2006,26(4):61-64.
[12]陈 玲,孙 浩,缪福俊,等. 澳洲坚果壳滤料的制备与过滤性能的研究[J]. 吉林农业,2011(5):134-135,137.
[13]刘晓芳,刘满红,张晓梅,等. 澳洲坚果壳活性炭对Cr(VI)的吸附性能[J]. 云南民族大学学报(自然科学版),2012,21(3):178-181.
[14]张明楷,杨为海,曾 辉,等. 澳洲坚果果皮中主要功能性成分分析[J]. 热带农业科学,2011,31(5):73-75.
[15]张汉周,张明楷,刘遂飞,等. 澳洲坚果不同种质果皮内含物含量的研究[J]. 热带作物学报,2015,36(3):541-545.
[16]Singleton V L,Orthofer R,Lamuela-Raventós R M. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent[M]//Packer L. Methods in enzymology,oxidant and antioxidants (Part A). San Diego:Academic Press,1999:152-178.
[17]Benamar H,Rached W,Derdour A,et al. Screening of algerian medicinal plants for acetylcholinesterase inhibitory activity[J]. Journal of Biological Sciences,2010,10(1):1-9. [18]Kunradi V F G,Campelo B G D,Copetti C,et al. Phenolic compounds and antioxidant activity of the Apple flesh and peel of eleven cultivars grown in Brazil[J]. Scientia Horticulturae,2011,128(3):261-266.
[19]Re R,Pellegrini N,Proteggente A,et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay[J]. Free Radical Biology and Medicine,1999,26(9/10):1231-1237.
[20]Benzie I F,Strain J J. The ferric reducing ability of plasma(FRAP)as a measure of “antioxidant power”:the FRAP assay[J]. Journal of Analytical Biochemistry,1996,239(1):70-76.
[21]楊琼霞,殷 舒,申屠垠,等. 山核桃外果皮提取液对小鼠的辐射防护作用[J]. 浙江林学院学报,2006,23(6):604-607.
[22]马良进,吴美卿,苏 秀,等. 山核桃外果皮提取物活体抑菌活性[J]. 浙江林学院学报,2009,26(5):620-624.
[23]严赞开,胡春菊. 橙皮甙的抑菌效果研究[J]. 西北农业学报,2004,13(2):87-89.
[24]Wang H C,Hu Z Q,Wang Y,et al. Phenolic compounds and the antioxidant activities in litchi pericarp:difference among cultivars[J]. Scientia Horticulturae,2011,129(4):784-789.
[25]房昱含,魏玉西,赵爱云,等. 无花果叶提取物抗氧化活性的研究[J]. 中国生化药物杂志,2008,29(6):366-368,373.
[26]Turkmen N,Sari F,Velioglu Y S. Effect of extraction solvents on concentration and antioxidant activity of black and black mate polyphenols determined by ferrous tartrate and Folin-Ciocalteu methods[J]. Food Chemistry,2006,99(4):838-841.
[27]张 茜,贾冬英,姚 开,等. 石榴皮提取物的抗氧化作用研究[J]. 中国油脂,2006,31(8):51-54.
[28]Do Q D,Angkawijaya A E,Tran-Nguyen P L,et al. Effect of extraction solvent on total phenol content,total flavonoid content,and antioxidant activity of Limnophila aromatica[J]. Journal of Food and Drug Analysis,2014,22(3):296-302.
[29]綦菁华,王 芳,庞美霞,等. 板栗酚类活性成分提取及其抗氧化活性研究[J]. 中国粮油学报,2009,24(9):141-143,168.
[30]刘 禹,段江莲,李为琴,等. 高粱米不同溶剂提取物的抗氧化活性研究[J]. 中国粮油学报,2013,28(6):36-39.
[31]王存堂,姜微波,曹建康. 枣果渣不同溶剂提取物的抗氧化成分及性能研究[J]. 食品工业,2015,36(1):210-213.
[32]Hossain M A,Rahman S. Total phenolics,flavonoids and antioxidant activity of tropical fruit pineapple[J]. Food Research International,2011,44(3):672-676.
[33]涂宗财,傅志丰,王 辉,等. 红薯叶不同溶剂提取物抗氧化活性及活性成分鉴定[J]. 食品科学,2015,36(17):1-6.
[34]赖红芳,潘立卫. 翠云草不同溶剂提取物的抗氧化性[J]. 江苏农业科学,2015,43(5):307-309.薛 菲,刘顺刚,张祥胜,等. 盐地碱蓬叶中可溶性膳食纤维的提取与抗氧化活性[J]. 江苏农业科学,2017,45(1):175-178.
关键词:澳洲坚果果皮;溶剂提取物;多酚;黄酮;抗氧化活性
中图分类号: S667.901 文献标志码: A 文章编号:1002-1302(2017)01-0171-04
澳洲坚果(Macadamia spp.)别称夏威夷果,原产于澳洲,属于山龙眼科(Proteaceae)澳洲坚果属(Macadamia F. Mull)常绿乔木果树,被誉为世界“干果之王”,以富含多种不饱和脂肪酸为主要特点,还含有蛋白质、矿质元素和维生素等,具有较高的营养价值和保健功效。 作为一种新兴的高档坚果类果品,澳洲坚果在国际市场上供不应求,具有广阔的市场前景。近年来,中国澳洲坚果产业得到迅猛发展,目前种植规模已达652 km2,年产带壳果约9 700 t[1]。
澳洲坚果果实主要由果皮、种壳和果仁组成,其初加工的主要副产物为约占果实鲜质量的1/2的果皮和约占带壳果干质量的2/3种壳。当前国内外对澳洲坚果果仁的营养成分[2-5]与保健价值[6-7]、种壳的功能性組分[8-10]及开发利用[11-13]等方面的研究报道较多,但对果皮内含物的研究仅见于不同种质果皮的粗蛋白、可溶性糖、单宁及矿质元素含量的测定与分析[14-15],至今尚未见有果皮酚类物质及其抗氧化活性研究的报道。本试验采用水和体积分数70%甲醇、70%乙醇与70%丙酮4种溶剂浸提澳洲坚果果皮,研究不同溶剂提取物的总酚和总黄酮含量及其抗氧化活性的差异,旨在探讨适宜获得澳洲坚果果皮中天然抗氧化物质的提取溶剂,为开发和利用澳洲坚果果皮这一副产物资源提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试澳洲坚果果皮为已成熟的澳洲坚果新鲜果实,采自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所种质资源圃,分离出果皮,于-80 ℃冰箱中保存备用。
主要仪器有紫外可见分光光度计UV-1200,上海美谱达仪器有限公司;电子分析天平ML204,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;高速冷冻离心机Heraeus Multifuge X1R,德国Thermo Fisher Scientific公司。
主要试剂包括Folin-Cioealteu试剂、没食子酸、芸香苷、Trolox(水溶性维生素E类似物)、DPPH、ABTS、TPTZ,均购自美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 方法
1.2.1 提取物制备 准确称取澳洲坚果果皮1.0 g,放入研钵中,液氮研磨成粉末,转移至15 mL离心管中,分别以体积分数为70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮和水,料液比为 1 g ∶10 mL,充分混匀后置于37 ℃水浴中浸提1 h,4 ℃ 离心(2 200 g)20 min,取上清备用。
1.2.2 总酚含量测定 总酚含量的测定采用改良Folin-Cioealteu 法[16]。取0.5 mL样品溶液与2.5 mL 10% Folin-Cioealteu反应液于15 mL试管中,充分混匀,避光孵育5 min后与2.0 mL 20% Na2CO3溶液充分混匀,30 ℃水浴避光反应1 h,于765 nm下测定吸光度,重复3次。以没食子酸标准品制作标准曲线计算总酚含量(mg/g,FW)。
1.2.3 总黄酮含量测定 总黄酮含量的测定参照Benamar等的方法[17]。取0.5 mL样品溶液与0.5 mL 5% NaNO2溶液于15 mL试管中,充分混匀,反应5 min后加入0.5 mL 10% AlCl3摇匀,静置6 min;再加入1.5 mL 1.0 mol/L NaOH,于40 ℃水浴中避光反应15 min后,于510 nm下测定吸光度,重复3次。以芸香苷标准品制作标准曲线计算总黄酮的含量(mg/g,FW)。
1.2.4 单宁含量的测定 单宁含量的测定参照等的方法。取2 mL样品溶液加入含有25 mL蒸馏水和2.5 Folin-Donis试剂的容量瓶中,加入1mol/L的碳酸钠溶液,剧烈振荡,于30 ℃恒温箱中放置1.5 h后,于680 nm下测定吸光度,重复3次。以单宁标样绘制标准曲线计算单宁含量(mg/g,FW)。
1.2.5 抗氧化活性测定 DPPH自由基清除能力的测定。参照Vieira等的方法[18],利用60 mL甲醇和40 mL乙酸钠缓冲液(0.1 mol/L,pH值5.5)现配DPPH溶液(50 μmol/L)。取 2.9 mL DPPH溶液,于517 nm下测定其初始吸光度(D0);取2.9 mL DPPH溶液和0.1 mL样品溶液充分混匀后,于 30 ℃ 水浴中避光反应15 min,测定其吸光度(D15)。以甲醇-乙酸钠缓冲液为空白调0,重复测定3次。样品的DPPH自由基清除率按[100%-(D15/D0)× 100%]计算,用Trolox为标准物制作标准曲线计算其抗氧化活性。
ABTS自由基清除能力的测定。参照Re等的方法[19],将现配的ABTS反应液(7 mmol/L)用80%乙醇稀释至734 nm的吸光度为0.70±0.02,作为其初始吸光度(D0);取0.1 mL样品溶液与2.9 mL稀释了的ABTS反应液混匀,于30 ℃水浴中避光反应7 min,测定其吸光度(D7)。以80%乙醇为空白调0,重复测定3次。样品的ABTS自由基清除率按[100%-(D7/D0)× 100%]计算,以Trolox为标准物制作标准曲线计算其抗氧化能力。 总抗氧化能力的测定。参照Benzie等的FRAP法[20],将乙酸钠缓冲液(0.3 mol/L,pH值3.6)、TPTZ(10 mmol/L)与FeCl3·6H2(20 mmol/L)按体积比10 ∶1 ∶1现配FRAP试剂,取0.15 mL样品溶液和2.85 mL FRAP反应液混匀,于 37 ℃ 水浴中避光反应20 min后,于593 nm下测定其吸光度,重复测定3次。以FeSO4为标准物制作标准曲线计算其总抗氧化能力。
1.2.6 统计分析 用SPSS 17.0软件进行数据整理与统计分析。
2 结果与分析
2.1 澳洲坚果果皮不同溶剂提取物的总酚、总黄酮与单宁含量
水和体积分数70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮为提取溶剂,测定澳洲坚果果皮的总酚(没食子酸等效物)、总黄酮(芸香苷等效物)和单宁(单宁酸等效物)的含量(表1)。由表1可知,不同溶剂提取的总酚、总黄酮、单宁含量均具有一定差异,其中体积分数为70%丙酮的提取效果最佳,其次是体积分数为70%的甲醇和70%的乙醇,水提取效果最差。70%丙酮提取液总酚含量(6.63 mg/g,FW)、总黄酮含量(8.65 mg/g,FW)、单宁含量(8.80 mg/g,FW)显著高于70%乙醇(4.70、4.45、5.18 mg/g,FW )、70%甲醇(4.39、3.9、5.19 mg/g,FW)和水(2.28、2.74、2.31 mg/g,FW)。比较而言,体积分数70%丙酮提取液的总酚、总黄酮与单宁含量分别约是体积分数70%甲醇与70%乙醇提取液的1.5、2.0、1.7倍,说明对澳洲坚果果皮中的总酚、总黄酮与单宁这3种物质,体积分数为70%丙酮的提取效果最好。
2.2 澳洲坚果果皮不同溶剂提取物的抗氧化活性
2.2.1 总抗氧化能力FRAP FRAP法是一种快速简便、重复性好的测定总抗氧化能力的方法,待测生物活性物质将Fe3 还原为Fe2 的能力越大,其抗氧化活性越强。本研究是以Fe2 当量计算澳洲坚果果皮提取物的总抗氧化能力,结果见图1。图1表明,不同溶剂提取液的总抗氧化能力具有显著差异,总抗氧化能力大小排序为70%丙酮>70%乙醇>70%甲醇>水,总抗氧化能力依次为(191.43±6.72)、(109.86±6.33)、(100.58±7.27)、(62.54±0.98) μmol/g。其中,70%丙酮提取液的总抗氧化能力显著高于醇提取液和水。体积分数70%丙酮提取液的总抗氧化能力约是醇提取液的1.9倍和水提取液的3.1倍。
2.2.2 DPPH自由基清除能力差异 DPPH法常用于抗氧
化剂清除自由基能力的评价。本研究中,以标准抗氧化剂Trolox为等效物来衡量澳洲坚果果皮4种溶剂提取物的 DPPH 自由基清除能力,结果如图2所示。图2表明,不同溶剂提取液对DPPH自由基清除能力不同,其对DPPH自由基清除能力顺序为70%甲醇提取溶剂[(104.67±2.54) μmol/g,FW ]> 70%丙酮提取溶剂[(51.30±1.99) μmol/g,FW ]> 70%乙醇提取溶剂[(35.61±5.85) μmol/g,FW ]> 水[(34.19±0.40) μmol/g,FW]。4种溶剂中体积分数70%甲醇提取溶剂的DPPH自由基清除能力显著高于其他3种,而70%丙酮、70%乙醇和水3种溶剂的DPPH自由基清除能力差异不显著,说明70%甲醇是澳洲坚果DPPH自由基清除能力的最佳提取溶剂。
2.2.3 ABTS自由基清除作用 与DPPH自由基类似,ABTS 与抗氧化剂反应后溶液发生褪色,溶液褪色越明显,则表明所检测物质的抗氧化能力越强。本研究以Trolox为标准计算澳洲坚果果皮4种溶剂提取物的ABTS自由基清除能力,结果见图3。由图3可知,不同溶剂提取液对ABTS自由基的清除能力不同,其对ABTS自由基清除能力的强弱顺序依次为70%丙酮[(136.31±6.09) μmol/g,FW]>70%甲醇[(100.79±0.93) μmol/g,FW ]>70%乙醇[(81.13±3.35) μmol/g,FW]>水[(60.35±0.67) μmol/g,FW]。4种溶剂中,体积分数70%丙酮提取溶剂的ABTS自由基清除能力显著高于其他3种,70%甲醇、70%乙醇提取溶剂ABTS自由基清除能力差异不显著,说明70%丙酮是澳洲坚果ABTS自由基清除能力的最佳提取溶剂。
2.3 澳洲坚果果皮总酚含量与抗氧化能力的相关性分析
相关性分析(表2)表明,总酚含量与单宁含量呈极显著正相关(r=0.901),与总黄酮含量不相关,由此说明单宁类化合物是澳洲坚果果皮酚类物质的主要组成部分。此外,总酚与DPPH、ABTS、FRAP清除率呈极显著正相关,相关系数分别为0.901、0.978、0.921;单宁含量和DPPH、ABTS、FRAP清除率呈极显著正相关,相关系数分别为0.972、0.919、0.998;而总黄酮含量与DPPH、ABTS、FRAP清除率不相关,说明酚类物质在澳洲坚果果皮抗氧化能力方面发挥着重要作用。总酚含量和抗氧化活性测定的3个指标均有显著相关性,表明DPPH、ABTS、FRAP清除率均适用于澳洲坚果进行抗氧化能力的分析。
3 结论与讨论
澳洲坚果果皮是澳洲坚果初加工后遗留的副产物,在整个果实中占较大比重。目前,国内外澳洲坚果加工企业对果皮的回收利用还不够重视,造成资源浪费,而且对环境还有一定的污染。对山核桃[21-22]、柑橘[23]、荔枝[24]等研究表明,果皮含有很多天然抗氧化成分,具有抗氧化、抗致突变、抗衰老、抗炎和抑菌等活性。植物多酚类物质是天然的抗氧化剂,可有效地协助维持体内自由基代谢的平衡,减少或防止相关疾病的发生[25]。虽然张明楷等报道了澳洲坚果果皮富含单宁物質[14],但对果皮的抗氧化活性尚未有研究。本研究结果表明,澳洲坚果果皮提取物含有较丰富的酚类与黄酮类化合物,对DPPH与ABTS自由基具有较强的清除能力,且具有较高的总抗氧化能力,表明澳洲坚果果皮提取物具有较好的抗氧化活性,可在防衰老、抗炎症等方面发挥作用。然而,对于澳洲坚果果皮提取物中的活性成分及其作用机理,还有待于进一步研究。 不同溶劑制备的提取物中多酚类含量及其抗氧化活性显著不同,这可能与提取剂的极性有关[26]。以水、甲醇、乙醇、丙酮为提取溶剂,提取石榴皮[27]、紫苏草[28]、板栗[29]、高粱[30]、枣果渣[31]的抗氧化活性物质并对其抗氧化活性能力的分析发现,丙酮溶剂提取物的抗氧化活性显著高于其他3种溶剂,其次是甲醇和乙醇,水最低。而菠萝[32]、红薯叶[33]和翠云草[34]的抗氧化研究中发现,甲醇提取溶剂的抗氧化效果最好。本研究中利用不同极性的溶剂提取澳洲坚果果皮中抗氧化物质,所获提取物中的总酚、总黄酮与单宁含量也显著不同,以致不同溶剂提取物清除DPPH和ABTS自由基能力以及总抗氧化能力存在显著差异。其中,丙酮溶剂提取物的抗氧化能力显著高于水、甲醇和乙醇。综合分析4种提取溶剂抗氧化物的FRAP、ABTS和DPPH自由基清除能力可知,4种溶剂提取物均具有一定抗氧化能力,其中丙酮溶剂提取物抗氧化能力最高,其次是甲醇和乙醇,水提取物的抗氧化能力最低。综上所述,体积分数70%丙酮溶剂为提取澳洲坚果果皮中的抗氧化物质最佳溶剂。
通过DPPH、ABTS和FRAP等方法对澳洲坚果果皮抗氧化活性测定发现,总酚含量与3种测定指标均具有显著相关性,该结果也客观反映了3种方法测定澳洲坚果果皮抗氧化活性的准确性。
参考文献:
[1]中国热带农业科学院.中国热带作物产业可持续发展研究[M]. 北京:科学出版社,2014:147-152.
[2]Maguire L S,Oconnor T P,Obrien N M,et al. Fatty acid profile,tocopherol,squalene and phytosterol content of walnuts,almonds,peanuts,hazelnuts and the macadamia nut[J]. Journal of Food Science and Nutrition,2004,55(3):171-178.
[3]Venkatachalam M,Sathe S K. Chemical composition of selected edible nut seeds[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(13):4705-4714.
[4]杜丽清,邹明宏,曾 辉,等. 澳洲坚果果仁营养成分分析[J]. 营养学报,2010,32(1):95-96.
[5]杨为海,张明楷,邹明宏,等. 澳洲坚果不同种质果仁粗脂肪及脂肪酸成分的研究[J]. 热带作物学报,2012,33(7):1297-1302.
[6]Curb J D,Wergowske G,Dobbs J C,et al. Serum lipid effects of high-monounsaturated fat diet based on macadamia nuts[J]. Archives of Internal Medicine,2000,160(8):1154-1158.
[7]Garg M L,Blake R J,Wills R B. Macadamia nut consumption lowers plasma total and LDL cholesterol levels in hypercholesterolemic men[J]. Journal of Nutrition,2003,133(4):1060-1063.
[8]石 柳,王金华,熊 智,等. 澳洲坚果壳中纤维素和木质素成分分析[J]. 湖北农业科学,2009,48(11):2846-2848.
[9]杨为海,张明楷,曾 辉,等. 澳洲坚果种壳矿质元素含量研究[J]. 湖北农业科学,2011,50(23):4958-4961.
[10]芦燕玲,李亮星,魏 杰,等. 气质联用法分析澳洲坚果壳的挥发性成分[J]. 化学研究与应用,2012,24(3):433-436.
[11]宁 平,杨月红,彭金辉,等. 澳洲坚果壳活性炭制备的热解特性研究[J]. 林产化学与工业,2006,26(4):61-64.
[12]陈 玲,孙 浩,缪福俊,等. 澳洲坚果壳滤料的制备与过滤性能的研究[J]. 吉林农业,2011(5):134-135,137.
[13]刘晓芳,刘满红,张晓梅,等. 澳洲坚果壳活性炭对Cr(VI)的吸附性能[J]. 云南民族大学学报(自然科学版),2012,21(3):178-181.
[14]张明楷,杨为海,曾 辉,等. 澳洲坚果果皮中主要功能性成分分析[J]. 热带农业科学,2011,31(5):73-75.
[15]张汉周,张明楷,刘遂飞,等. 澳洲坚果不同种质果皮内含物含量的研究[J]. 热带作物学报,2015,36(3):541-545.
[16]Singleton V L,Orthofer R,Lamuela-Raventós R M. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent[M]//Packer L. Methods in enzymology,oxidant and antioxidants (Part A). San Diego:Academic Press,1999:152-178.
[17]Benamar H,Rached W,Derdour A,et al. Screening of algerian medicinal plants for acetylcholinesterase inhibitory activity[J]. Journal of Biological Sciences,2010,10(1):1-9. [18]Kunradi V F G,Campelo B G D,Copetti C,et al. Phenolic compounds and antioxidant activity of the Apple flesh and peel of eleven cultivars grown in Brazil[J]. Scientia Horticulturae,2011,128(3):261-266.
[19]Re R,Pellegrini N,Proteggente A,et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay[J]. Free Radical Biology and Medicine,1999,26(9/10):1231-1237.
[20]Benzie I F,Strain J J. The ferric reducing ability of plasma(FRAP)as a measure of “antioxidant power”:the FRAP assay[J]. Journal of Analytical Biochemistry,1996,239(1):70-76.
[21]楊琼霞,殷 舒,申屠垠,等. 山核桃外果皮提取液对小鼠的辐射防护作用[J]. 浙江林学院学报,2006,23(6):604-607.
[22]马良进,吴美卿,苏 秀,等. 山核桃外果皮提取物活体抑菌活性[J]. 浙江林学院学报,2009,26(5):620-624.
[23]严赞开,胡春菊. 橙皮甙的抑菌效果研究[J]. 西北农业学报,2004,13(2):87-89.
[24]Wang H C,Hu Z Q,Wang Y,et al. Phenolic compounds and the antioxidant activities in litchi pericarp:difference among cultivars[J]. Scientia Horticulturae,2011,129(4):784-789.
[25]房昱含,魏玉西,赵爱云,等. 无花果叶提取物抗氧化活性的研究[J]. 中国生化药物杂志,2008,29(6):366-368,373.
[26]Turkmen N,Sari F,Velioglu Y S. Effect of extraction solvents on concentration and antioxidant activity of black and black mate polyphenols determined by ferrous tartrate and Folin-Ciocalteu methods[J]. Food Chemistry,2006,99(4):838-841.
[27]张 茜,贾冬英,姚 开,等. 石榴皮提取物的抗氧化作用研究[J]. 中国油脂,2006,31(8):51-54.
[28]Do Q D,Angkawijaya A E,Tran-Nguyen P L,et al. Effect of extraction solvent on total phenol content,total flavonoid content,and antioxidant activity of Limnophila aromatica[J]. Journal of Food and Drug Analysis,2014,22(3):296-302.
[29]綦菁华,王 芳,庞美霞,等. 板栗酚类活性成分提取及其抗氧化活性研究[J]. 中国粮油学报,2009,24(9):141-143,168.
[30]刘 禹,段江莲,李为琴,等. 高粱米不同溶剂提取物的抗氧化活性研究[J]. 中国粮油学报,2013,28(6):36-39.
[31]王存堂,姜微波,曹建康. 枣果渣不同溶剂提取物的抗氧化成分及性能研究[J]. 食品工业,2015,36(1):210-213.
[32]Hossain M A,Rahman S. Total phenolics,flavonoids and antioxidant activity of tropical fruit pineapple[J]. Food Research International,2011,44(3):672-676.
[33]涂宗财,傅志丰,王 辉,等. 红薯叶不同溶剂提取物抗氧化活性及活性成分鉴定[J]. 食品科学,2015,36(17):1-6.
[34]赖红芳,潘立卫. 翠云草不同溶剂提取物的抗氧化性[J]. 江苏农业科学,2015,43(5):307-309.薛 菲,刘顺刚,张祥胜,等. 盐地碱蓬叶中可溶性膳食纤维的提取与抗氧化活性[J]. 江苏农业科学,2017,45(1):175-178.