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摘要[目的]探讨pH、温度环境因素对多粘类芽孢杆菌 DN-1抑菌效果的影响以及井冈霉素A降低芽孢消解作用，为提高其生物活性提供理论依据。[方法]研究不同温度、pH条件下多粘类芽孢杆菌 DN-1对水稻纹枯病菌的抑制效果，测定 DN-1菌株和井冈霉素A复配对其细胞消解率的影响。[结果] pH在6.0～8.0时DN-1菌株对水稻纹枯病菌均表现出较好的抑制效果，pH为7.0时抑菌率最佳；温度在15～40 ℃时该菌对水稻纹枯病菌均能表现出较强的抑菌效果，温度在35 ℃时抑菌效果最强；在DN-1菌株配成的水悬液中添加不同比例的井冈霉素A，都有降低细胞消解速率的作用。[结论]温度和pH对DN-1菌株抑制水稻纹枯病菌的效果均有影响；井冈霉素A可延长含DN-1生物农药的货架期。
关键词多粘类芽孢杆菌 DN-1；pH；温度；抑菌效果；井冈霉素A
中图分类号S476文献标识码A文章编号0517-6611（2017）09-0137-02
Effects of Several Factors on Activity of Paenibacillus polymyxa DN-1
ZHOU Ziyan，SU Weihua，HU Benjin et al
（Institute of Plant Protection and Quality and Safety of Agricultural Products，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei，Anhui 230031）
Abstract[Objective] Effects of several factors like pH and temperature on activity of Paenibacillus polymyxa DN1 and decreasing digestion rate of DN1 strain by validamycin A were studied to provide reference for improving biological activity of DN1 strain.[Method] We investigated the effect of pH，temperature and environmental factors on the inhibitory effect of Paenibacillus polymyxa DN1，and determined effect of validamycin A on digestion rate of DN1.[Result] When pH was from 6.0 to 8.0，the DN1 strain had good inhibitory effect on Rhizoctonia solani；when the pH was 7.0，the DN1 strain had the best inhibitory rate.When the temperature was from 15 ℃ to 40 ℃，the DN1 strain showed strong inhibitory effect on Rhizoctonia solani；when the temperature was 35 ℃，the inhibitory effect was the strongest.Adding different proportions of DN1 strains with the agent of validamycin A had reduced digestion rate of Bacillus.[Conclusion] Both temperature and pH have effect on inhibition of the DN1 strain to Rhizoctonia solani，and validamycin A can prolong the shelf life of biological pesticide containing DN1.
Key wordsPaenibacillus polymyxa DN1；pH；Temperature；Inhibitory effect；Validamycin A
多粘類芽孢桿菌 DN-1是安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所筛选的用于防治水稻纹枯病新的优良拮抗菌株。该菌和井冈霉素A的组合物对水稻纹枯病有较好的防治效果，田间施用量为120亿芽孢/L时，多年田间防治纹枯病效果均在75%以上[1-2]。
Haggag等[3]发现多粘类芽孢杆菌菌悬液对花生根腐病有很好的防治作用。多粘类芽孢杆菌还可防治辣椒疫病[4]、花生茎腐病[5]和西瓜枯萎病[6]等植物病害，对线虫病害也有一定防治效果。作为一种植物根际促生细菌，多粘类芽抱杆菌具有许多有益的农用功能，包括固氮[7]、溶磷[8]、促进植物生长[9]以及抑制植物病原菌的生长[10]等。因此，多粘类芽孢杆菌在植物病害防治方面具有广阔的应用前景。
目前，关于pH、温度等对多粘类芽孢杆菌生长及芽孢量的影响文献报道较多，但不同pH、温度条件下生防菌株对纹枯病菌的抑制效果报道较少。鉴于此，笔者以DN-1菌株为研究对象，考察不同温度、pH条件对水稻纹枯病菌的抑制效果，同时测定了该菌和井冈霉素A复配后对其细胞消解率的影响，以期为提高其生物活性提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株。多粘类芽孢杆菌 DN-1，于青岛海域海泥中分离（GenBank 登录号：KM891591），由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所保存。水稻纹枯病病菌由田间分离并鉴定，经转接、纯化培养后供试。 1.1.2供试培养基。LB 培养基[11]用于DN-1菌株活化；PDA 培养基[12]用于水稻纹枯病菌培养及平板对峙试验。
1.2方法
1.2.1多粘类芽孢杆菌 DN-1的芽孢液制备与测定方法。
将經 LB 培养基活化后的DN-1菌株接入种子培养液（PD）中，培养 24 h 获得种子液，然后按接种量 10%转至固体培养基（配方专利申请号 201410339808.2）中，37 ℃发酵培养 72 h后，获得芽孢母粉，将母粉以0.1 g/mL的量加灭菌水稀释后作为芽孢母液。
1.2.2温度对DN-1菌株抑制病菌效果的影响测定。鉴于DN-1菌株在不同温度下生长的速率有差异，为考察不同温度下该菌对水稻纹枯病的抑菌效果， 分别在15、25、30、35、40 ℃下测定DN-1菌株对水稻纹枯病的抑菌效果。取1 mL多粘类芽孢杆菌DN-1菌株母液加入500 mL培养基中，用PDA培养基配制成药液平板，每皿约10 mL，同时设置无菌平板对照（CK），每处理4皿，4次重复。
1.2.3pH对DN-1菌株抑制病菌效果的影响测定。目标DN-1菌株发酵适宜的pH测定为6.5，为进一步考察该菌在不同pH条件下对水稻纹枯的抑制效果，用稀HCl或NaOH溶液将LB液体培养基初始pH调至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0共5个不同的初始值处理，每处理4皿，4次重复。
1.2.4井冈霉素A添加量对DN-1菌株细胞消解率的影响测定。
将20亿的母粉和60%井冈霉素A（有效量）以质量比1∶1、0.5∶1、0.25∶1、0.125∶1共4个比例混合，取各比例混配物及芽孢杆菌母粉1 g于加100 mL水的三角瓶中，常温保存，重复4次，分别在1、7、14、30、60 d时测定三角瓶水悬液中DN-1菌株细胞总量，计算细胞消解率。
2结果与分析
2.1温度对DN-1菌株抑制病菌效果的影响
由图1可知，温度在15、25、30、35、40 ℃时，DN-1菌株抑制水稻纹枯病效果分别为60.35%、69.31%、73.56%、89.13%和85.22%，15 ℃时该菌对水稻纹枯病的抑菌效果仅有6035%，随着温度的升高目标菌株对水稻纹枯病的抑菌效果显著提高，当温度达35 ℃时，该菌对水稻纹枯病的抑菌效果最佳，达89.13%，进一步升高温度，该菌对水稻纹枯病的抑制效果下降，温度40 ℃时该菌对水稻纹枯病菌的抑制率下降到85.22%。试验结果表明，温度在15～40 ℃时该菌对水稻纹枯病菌均有较好的抑菌效果， 35 ℃时该菌对水稻纹枯病的抑菌效果最强。
2.2pH对DN-1菌株抑制病菌效果的影响
由图2可知，当pH为6.0～8.0时，DN-1菌株对水稻纹枯病的抑菌率分别为73.18%、85.16%、85.90%、80.26%、75.15%，pH为7.0时，DN-1菌株对水稻纹枯病的抑菌率最高，随后，pH升高，DN-1菌株对水稻纹枯病的抑菌率显著下降。由此可见，pH在6.5～7.5时DN-1菌株对水稻纹枯病菌的抑制效果较好，pH为7.0时抑菌率最高。
2.3井冈霉素A对DN-1菌株消解率的影响
由图3可知，多粘类芽孢杆菌DN-1菌株在水中不添加任何物质时，60 d后自行消解率为12.06%，但芽孢杆菌：井冈霉素A的量为0.125∶1时，即添加井冈霉素A的量为1.25%时，60 d后DN-1菌株细胞消解率为9.29%；随着添加井冈霉素A量的增加DN-1菌株细胞消解率不断降低；井冈霉素A添加量和DN-1菌株量为1∶1时，即井冈霉素A的添加量为10%时，60 d后DN-1菌株细胞消解率最低，为5.03%。试验结果显示，在DN-1菌株悬浮液中添加井冈霉素A，可有效降低其细胞的消解率。
3结论与讨论
该研究结果表明，温度和pH对多粘类芽孢杆菌DN-1菌株抑制水稻纹枯病菌的效果均有影响。菌体的生长和代谢产物合成都需要在一定的温度下进行，温度是发酵过程中微生物生长与产生芽孢的主要环境影响因素之一。pH 主要通过改变菌体的膜渗透性、细胞膜电荷及物质的离子化程度来影响菌体对营养物质的吸收，影响菌株的芽孢产量，进而影响DN-1菌株对病原菌的抑制效果。在多粘类芽孢杆菌DN-1菌株悬浮液中添加井冈霉素A可有效降低其细胞消解率，添加的60%井冈霉素A是水链霉菌代谢产物，其生产过程也是通过培养基发酵而来，其中可能残存菌株或培养基成分，可为DN-1菌株提供营养，进而使菌株在混合液中细胞的消解减缓。pH在6.0～7.0、温度在15～40 ℃时多粘类芽孢杆菌DN-1菌株均能有效地抑制水稻纹枯病菌的生长，以pH中性、温度35 ℃时抑菌效果最强；在多粘类芽孢杆菌DN-1菌株水悬液中添加井冈霉素A可有效地延缓菌株细胞的消解，DN-1菌株和井冈霉素A复配后可延长该生物农药的货架期，为人们将多粘类芽孢杆菌DN-1菌株与井冈霉素A复配形成性能稳定的生物农药指明了方向，多年的田间试验结果也和该研究结论相吻合。
参考文献
[1]
胡飞，李昌春，周子燕，等.多粘类芽胞杆菌DN-1防治水稻纹枯病初步研究[J].中国生物防治学报，2015，31（4）：524-528.
[2] 周子燕，李昌春，胡本进，等.多粘類芽孢杆菌和井冈霉素A配比对水稻纹枯病菌的室内毒力测定及田间药效[J].农药，2014，53（7）：528-530.
[3] HAGGAG W M，TIMMUSK S.Colonization of peanut roots by biofilm-forming Paenibacillus polymyxa initiates biocontrol against crown rot disease[J].Journal of applied microbiology，2008，104（4）：961-969. [4] KIM S G，KHAN Z，JEON Y H，et al.Inhibitory effect of Paenibacillus polymyxa GBR462 on Phytophthora capsici causing phytophthora blight in Chili Pepper[J].Journal of phytopathology，2009，157（6）：329-337.
[5] HAGGAG W M.Colonization of exopolysaccharideproducing Paenibacillus polymyxa on peanut roots for enhancing resistance against crown rot disease[J].African journal of biotechnology，2007，6（13）：1568-1577.
[6] ZHANG S S，RAZA W，YANG X M，et al.Control of Fusarium wilt disease of cucumber plants with the application of a bioorganic fertilizer[J].Biology and fertility of soils，2008，44（8）：1073-1080.
[7] FIGUEIREDO M V B，MARTINEZ C R，BURITY H A，et al.Plant growthpromoting rhizobacteria for improving nodulation and nitrogen fixation in the common bean （Phaseolus vulgaris L.）[J].World journal of microbiology and biotechnology，2008，24（7）：1187-1193.
[8] SINGH H P，SINGH T A.The interaction of rockphosphate，Bradyrhizobium，vesiculararbuscular mycorrhizae and phosphatesolubilizing microbes on soybean grown in a subHimalayan mollisol[J].Mycorrhiza，1993，4（1）：37-43.
[9] SHISHIDO M，MASSICOTTE H B，CHANWAY C P.Effect of plant growth promoting Bacillus strains on pine and spruce seedling growth and mycorrhizal infection[J].Annals of botany，1996，77（5）：433-442.
[10] HELBIG J.Biological control of Botrytis cinerea Pers.ex Fr.in strawberry by Paenibacillus polymyxa（isolate 18191）[J].Journal of phytopathology，2001，149（5）：265-273.
[11] 王春娟，郭亞輝，王超，等.根围促生细菌（PGPR）蜡质芽胞杆菌 AR156 对番茄的诱导耐旱性研究[J].农业生物技术学报，2012，20（10）：1097-1105.
[12] 李小龙，王超，郭坚华.菌株 518 鉴定及其次生代谢产物的生防特性与分离[J].浙江农业学报，2013，25（3）：537-542.
关键词多粘类芽孢杆菌 DN-1；pH；温度；抑菌效果；井冈霉素A
中图分类号S476文献标识码A文章编号0517-6611（2017）09-0137-02
Effects of Several Factors on Activity of Paenibacillus polymyxa DN-1
ZHOU Ziyan，SU Weihua，HU Benjin et al
（Institute of Plant Protection and Quality and Safety of Agricultural Products，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei，Anhui 230031）
Abstract[Objective] Effects of several factors like pH and temperature on activity of Paenibacillus polymyxa DN1 and decreasing digestion rate of DN1 strain by validamycin A were studied to provide reference for improving biological activity of DN1 strain.[Method] We investigated the effect of pH，temperature and environmental factors on the inhibitory effect of Paenibacillus polymyxa DN1，and determined effect of validamycin A on digestion rate of DN1.[Result] When pH was from 6.0 to 8.0，the DN1 strain had good inhibitory effect on Rhizoctonia solani；when the pH was 7.0，the DN1 strain had the best inhibitory rate.When the temperature was from 15 ℃ to 40 ℃，the DN1 strain showed strong inhibitory effect on Rhizoctonia solani；when the temperature was 35 ℃，the inhibitory effect was the strongest.Adding different proportions of DN1 strains with the agent of validamycin A had reduced digestion rate of Bacillus.[Conclusion] Both temperature and pH have effect on inhibition of the DN1 strain to Rhizoctonia solani，and validamycin A can prolong the shelf life of biological pesticide containing DN1.
Key wordsPaenibacillus polymyxa DN1；pH；Temperature；Inhibitory effect；Validamycin A
多粘類芽孢桿菌 DN-1是安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所筛选的用于防治水稻纹枯病新的优良拮抗菌株。该菌和井冈霉素A的组合物对水稻纹枯病有较好的防治效果，田间施用量为120亿芽孢/L时，多年田间防治纹枯病效果均在75%以上[1-2]。
Haggag等[3]发现多粘类芽孢杆菌菌悬液对花生根腐病有很好的防治作用。多粘类芽孢杆菌还可防治辣椒疫病[4]、花生茎腐病[5]和西瓜枯萎病[6]等植物病害，对线虫病害也有一定防治效果。作为一种植物根际促生细菌，多粘类芽抱杆菌具有许多有益的农用功能，包括固氮[7]、溶磷[8]、促进植物生长[9]以及抑制植物病原菌的生长[10]等。因此，多粘类芽孢杆菌在植物病害防治方面具有广阔的应用前景。
目前，关于pH、温度等对多粘类芽孢杆菌生长及芽孢量的影响文献报道较多，但不同pH、温度条件下生防菌株对纹枯病菌的抑制效果报道较少。鉴于此，笔者以DN-1菌株为研究对象，考察不同温度、pH条件对水稻纹枯病菌的抑制效果，同时测定了该菌和井冈霉素A复配后对其细胞消解率的影响，以期为提高其生物活性提供理论依据。
1材料与方法
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1.1.1供试菌株。多粘类芽孢杆菌 DN-1，于青岛海域海泥中分离（GenBank 登录号：KM891591），由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所保存。水稻纹枯病病菌由田间分离并鉴定，经转接、纯化培养后供试。 1.1.2供试培养基。LB 培养基[11]用于DN-1菌株活化；PDA 培养基[12]用于水稻纹枯病菌培养及平板对峙试验。
1.2方法
1.2.1多粘类芽孢杆菌 DN-1的芽孢液制备与测定方法。
将經 LB 培养基活化后的DN-1菌株接入种子培养液（PD）中，培养 24 h 获得种子液，然后按接种量 10%转至固体培养基（配方专利申请号 201410339808.2）中，37 ℃发酵培养 72 h后，获得芽孢母粉，将母粉以0.1 g/mL的量加灭菌水稀释后作为芽孢母液。
1.2.2温度对DN-1菌株抑制病菌效果的影响测定。鉴于DN-1菌株在不同温度下生长的速率有差异，为考察不同温度下该菌对水稻纹枯病的抑菌效果， 分别在15、25、30、35、40 ℃下测定DN-1菌株对水稻纹枯病的抑菌效果。取1 mL多粘类芽孢杆菌DN-1菌株母液加入500 mL培养基中，用PDA培养基配制成药液平板，每皿约10 mL，同时设置无菌平板对照（CK），每处理4皿，4次重复。
1.2.3pH对DN-1菌株抑制病菌效果的影响测定。目标DN-1菌株发酵适宜的pH测定为6.5，为进一步考察该菌在不同pH条件下对水稻纹枯的抑制效果，用稀HCl或NaOH溶液将LB液体培养基初始pH调至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0共5个不同的初始值处理，每处理4皿，4次重复。
1.2.4井冈霉素A添加量对DN-1菌株细胞消解率的影响测定。
将20亿的母粉和60%井冈霉素A（有效量）以质量比1∶1、0.5∶1、0.25∶1、0.125∶1共4个比例混合，取各比例混配物及芽孢杆菌母粉1 g于加100 mL水的三角瓶中，常温保存，重复4次，分别在1、7、14、30、60 d时测定三角瓶水悬液中DN-1菌株细胞总量，计算细胞消解率。
2结果与分析
2.1温度对DN-1菌株抑制病菌效果的影响
由图1可知，温度在15、25、30、35、40 ℃时，DN-1菌株抑制水稻纹枯病效果分别为60.35%、69.31%、73.56%、89.13%和85.22%，15 ℃时该菌对水稻纹枯病的抑菌效果仅有6035%，随着温度的升高目标菌株对水稻纹枯病的抑菌效果显著提高，当温度达35 ℃时，该菌对水稻纹枯病的抑菌效果最佳，达89.13%，进一步升高温度，该菌对水稻纹枯病的抑制效果下降，温度40 ℃时该菌对水稻纹枯病菌的抑制率下降到85.22%。试验结果表明，温度在15～40 ℃时该菌对水稻纹枯病菌均有较好的抑菌效果， 35 ℃时该菌对水稻纹枯病的抑菌效果最强。
2.2pH对DN-1菌株抑制病菌效果的影响
由图2可知，当pH为6.0～8.0时，DN-1菌株对水稻纹枯病的抑菌率分别为73.18%、85.16%、85.90%、80.26%、75.15%，pH为7.0时，DN-1菌株对水稻纹枯病的抑菌率最高，随后，pH升高，DN-1菌株对水稻纹枯病的抑菌率显著下降。由此可见，pH在6.5～7.5时DN-1菌株对水稻纹枯病菌的抑制效果较好，pH为7.0时抑菌率最高。
2.3井冈霉素A对DN-1菌株消解率的影响
由图3可知，多粘类芽孢杆菌DN-1菌株在水中不添加任何物质时，60 d后自行消解率为12.06%，但芽孢杆菌：井冈霉素A的量为0.125∶1时，即添加井冈霉素A的量为1.25%时，60 d后DN-1菌株细胞消解率为9.29%；随着添加井冈霉素A量的增加DN-1菌株细胞消解率不断降低；井冈霉素A添加量和DN-1菌株量为1∶1时，即井冈霉素A的添加量为10%时，60 d后DN-1菌株细胞消解率最低，为5.03%。试验结果显示，在DN-1菌株悬浮液中添加井冈霉素A，可有效降低其细胞的消解率。
3结论与讨论
该研究结果表明，温度和pH对多粘类芽孢杆菌DN-1菌株抑制水稻纹枯病菌的效果均有影响。菌体的生长和代谢产物合成都需要在一定的温度下进行，温度是发酵过程中微生物生长与产生芽孢的主要环境影响因素之一。pH 主要通过改变菌体的膜渗透性、细胞膜电荷及物质的离子化程度来影响菌体对营养物质的吸收，影响菌株的芽孢产量，进而影响DN-1菌株对病原菌的抑制效果。在多粘类芽孢杆菌DN-1菌株悬浮液中添加井冈霉素A可有效降低其细胞消解率，添加的60%井冈霉素A是水链霉菌代谢产物，其生产过程也是通过培养基发酵而来，其中可能残存菌株或培养基成分，可为DN-1菌株提供营养，进而使菌株在混合液中细胞的消解减缓。pH在6.0～7.0、温度在15～40 ℃时多粘类芽孢杆菌DN-1菌株均能有效地抑制水稻纹枯病菌的生长，以pH中性、温度35 ℃时抑菌效果最强；在多粘类芽孢杆菌DN-1菌株水悬液中添加井冈霉素A可有效地延缓菌株细胞的消解，DN-1菌株和井冈霉素A复配后可延长该生物农药的货架期，为人们将多粘类芽孢杆菌DN-1菌株与井冈霉素A复配形成性能稳定的生物农药指明了方向，多年的田间试验结果也和该研究结论相吻合。
参考文献
[1]
胡飞，李昌春，周子燕，等.多粘类芽胞杆菌DN-1防治水稻纹枯病初步研究[J].中国生物防治学报，2015，31（4）：524-528.
[2] 周子燕，李昌春，胡本进，等.多粘類芽孢杆菌和井冈霉素A配比对水稻纹枯病菌的室内毒力测定及田间药效[J].农药，2014，53（7）：528-530.
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[7] FIGUEIREDO M V B，MARTINEZ C R，BURITY H A，et al.Plant growthpromoting rhizobacteria for improving nodulation and nitrogen fixation in the common bean （Phaseolus vulgaris L.）[J].World journal of microbiology and biotechnology，2008，24（7）：1187-1193.
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[12] 李小龙，王超，郭坚华.菌株 518 鉴定及其次生代谢产物的生防特性与分离[J].浙江农业学报，2013，25（3）：537-542.