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摘要：DNA的甲基化作用作为一种常见的表观基因修饰方式广泛存在于生物体内，与DNA甲基化密切相关的蛋白——甲基化CpG结合蛋白(MeCPs)在DNA甲基化中起着非常显著的作用。通过浅谈DNA甲基化的作用及MeCP2的相关功能，并且构建了可表达MeCP2的载体，为进一步研究MeCP2在肿瘤和Rett综合症中的作用打下基础。
关键词：表达DNA甲基化 甲基化 CpG结合蛋白2(MeCP2) 克隆 Rett综合症
中图分类号：Q71 文献标识码：A 文章编号：1007-3973(2011)004-087-02
1 概述
DNA甲基化对基因的表达有抑制作用，而去甲基化则可以恢复基因表达的活性。甲基化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲基化酶可将新合成的未甲基化位点进行甲基化。结构基因含有很多CpG结构，CpG和GpC中两个胞嘧啶的5位碳原子通常被甲基化，且两个甲基集团在DNA双链大沟中呈特定三维结构。
哺乳动物中，CpG序列在基因组中出现的频率仅有1％，远低于基因组中的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中，CpG序列密度却很高，可以达均值的5倍以上。基因组中60％-90％的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地组成CpG岛，大约含有500多个碱基，CpG岛位于结构基因启动子的核心序列和转录起始区域，一般是第一个外显子区。在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛，而且只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化。健康人基因组中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG位点则通常是处于甲基化状态。
DNA甲基化对基因表达的抑制作用是由于特异性结合于甲基化CpG位点的蛋白所造成的，这种蛋白被称作转录抑制子，或者甲基化CpG结合蛋白(MeCPs)。哺乳动物甲基化的主要方式是形成5-甲基胞嘧啶(5mC)，以甲基CpG(mCpG)形式出现，MeCPs特异地识别mCpG，对mCpG周围序列无特异要求，因而能广泛参与基因转录抑制。已经鉴定的MeCP家族成员有5个，即MeCPl、MeCP2、MBDl、MBD3和MBD4，其中MeCP2在细胞中含量丰富，并且能与含一个甲基CpG岛的DNA结合。
MeCP2在体外特异性的与甲基化DNA结合，在体内，其-在染色体中的分布依赖于甲基CpG。在小鼠中，MeCP2集中在中心粒异染色质上，在这里含有大部分(约40％)的5-甲基胞嘧啶。异染色质定位实验表明，完整的MeCP2蛋白被定位于野生型细胞的异染色质上，但低水平基因DNA甲基化的变异细胞只有较少的蛋白定位于异染色质。在MeCP2的删除实验中表明，异染色质上的定位需要85个氨基酸的与甲基-CpG结合的结构域。以上实验结果说明MeCP2在体内是一个与甲基-CpG结合的蛋白质，并可能是DNA甲基化下游序列的主要调节介质。
MeCP2是一个丰富的染色体蛋白，大小约84kD，含有4个外显子，它广泛存在于哺乳动物的体细胞中，尤其在脑组织中最丰富，但在早期胚胎细胞中很少表达。每个细胞核中约有1×105～5×105个MeCP2分子，比MeCPl高1～2个数量级。人类MeCP2基因定位于染色体Xq28，编码的蛋白质主要有两个功能域，N端85个氨基酸是甲基CpG结合功能域(methyIbindingdomain,MBD)，可与单一mCpG结合；c端104个氨基酸是转录抑制功能域(transeriptional repression domain，TRD)。
为了评价MeCP2的功能意义，Tate用含有一个Lae报告基因的无启动子靶基因结构，使雄性小鼠胚胎干细胞x联结基因发生变异。缺乏MeCP2的变异ES细胞的生长与父本一样，还能相当程度的分化。但从几个独立变异株衍生的嵌和胚胎却出现发育缺陷，其严重程度与变异细胞的分布里正相关。结果提示与DNA甲基转移酶一样，MeCP2在干细胞中是非必需的，但对胚胎发育却是必不可少的。Nan发现野生和重组大鼠MeCP2在体外抑制甲基化启动子的转录，但不抑制非甲基化启动子的转录。而且，MeCP2能在含甲基·CpG的组装前染色质中替换组氨酸H1(H1FI)。这些性质，再加上丰富的MeCP2和高频率的2-bp结合位置，提示MeCP2在脊椎动物基因组中可能起着普遍转录抑制因子的作用。对MeCP2抑制作用的机制的研究发现MeCP2以甲基化依赖的模式与染色体紧密的结合。它的转录抑制结构域能在一定距离内起作用。实验证明MeCP2的TRD与一个共抑制复合物协同起作用，此复合物含有转录抑制因子mSin3A和组氨酸乙酰基转移酶(HDACl)。体内的转录抑制可被去乙酰基转移酶抑制因子trichostatin A缓解，说明组氨酸的去乙酰化作用是抑制机制的基本要素。这些事实说明MeCP2很可能是连接DNA甲基化和组氨酸去乙酰化这两个普遍的基因调节机制的桥梁。
由于MeCP2是一个普遍的转录抑制子，所以它与肿瘤及其他很多疾病都有关联。因此，我们从人乳腺正常细胞eDNA文库中获得MeCP2基因，构建到真核表达载体上并在细胞中成功表达，为进一步研究MeCP2的功能打下了基础。
2 结果
2.1 PCR扩增MeCP2cDNA片段
通过PCR扩增的方法成功获得了MeCP2cDNA片段，PCR的产物在1％琼脂糖凝胶上的分析，特异性片段的大小估计为171lbp。
2.2重组质粒的鉴定
(1)限制性内切酶酶切鉴定
用BamH I和EcoR I双酶切重组质粒pFLAG-MeCP2和载体pcDNA3-FLAG，得到与预期大小相符的外源基因插入片段，而对照的pcDNA3-FLAG经双酶切后无此插入片段，说明克隆成功。
(2)测序鉴定
将重组质粒pFLAG-MeCP2送去进行测序，结果与文库中的MeCP2 cDNA片段比对相吻合，说明插入的片段是正确的，克隆成功。
2.3FLAG-MeCP2的表达鉴定
将重组质粒pFLAG-MeCP2转化到大肠杆DH57中，转化菌经IPTG诱导表达FLAG-MeCP2融合蛋白。Western Blot检测表明，DH5(pFLAG-MeCP2)在84 kD处有一特异性的表达带，与空载体的表达结果比较可知，特异表达带即为FLAG抗体与FLAG-MeCP2融合蛋白发生特异反应所产生，说明DH5(pFLAG-MeCP2)成功表达FLAG-MeCP2融合蛋白。
3 讨论
由于甲基化普遍存在于生物体的DNA中，所以其作用显得格外重要。DNA甲基化可以引起基因突变(C→T)，DNMT的催化反应可以加快C(胞嘧啶)和5mC脱氨，封闭u(尿嘧啶)的修复，并且使u→T改变，故DNMT可促使CpG序列的c→T突变。抑癌基因p53就是一个典型的例证：50％实体瘤病人 出现p53基因突变，突变中24％是CpG甲基化后脱氨引起的C→T突变。
此外，DNA甲基化还可能影响基因错配修复。Ahujia发现MMR缺陷时，CpG岛的甲基化增强，并认为MMR与DNA甲基化有关。在基因错配修复过程中甲基化具有导向识别作用，而在错配修复基因表达缺陷的原因中基因突变和基因启动子区的高甲基化是其主要原因。DNA甲基化最重要的作用就是对基因表达的抑制。甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素，目前肿瘤相关甲基化的研究主要侧重于抑癌基因。这是由于DNA甲基化所引起的改变包括基因组整体甲基化水平的降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高，可以导致基因组的不稳定和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率提高。由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测，而且全基因组的低甲基化也随着肿瘤发生而出现，并且其随着肿瘤恶性度的增加而显著，因此甲基化的检测可用于肿瘤的分级。此外，许多报告都指出肿瘤的发生与甲基化有着密不可分的联系。由此可以看出，甲基化的研究可以为肿瘤的早期预测、分类、分级及预后评估提供新的依据。
本实验所克隆的MeCP2主要集中在中心粒的异染色质上，通过TRD与共抑制因子mSin3A、HDACI及HDAC2构成复合体抑制转录。现在发现MeCP2蛋白的功能主要有3种：
(1)MeCP2具有转录抑制和调控功能。
(2)MeCP2蛋白在小鼠和人体的发育过程中存在空间上和时间上的分布。MeCP2蛋白大量存在于成熟的中枢神经系统中，较早出现于脊髓和脑干等个体发育早期的结构中。MeCP2蛋白存在于神经细胞中，但在神经胶质细胞中却没有被发现。
(3)MeCP2基因的突变与相关疾病。MeCP2在胚胎发育中是必不可少的，它的突变会导致Rett综合症，这种疾病的主要症状是由于神经发育的不良导致的大脑迟缓，多见于女性。此外MeCP2的突变还与Angelman综合症和孤独症有关。
Rett综合症是一种严重影响儿童精神运动发育的神经系统疾病，这种罕见的复杂性神经系统疾病目前没有可行的治疗方法，最终患者会彻底丧失行为能力。
研究人员发现在大约80％的案例中，RTT与x染色体连接MECP2基因的突变相关，即当我们定位在非活性的x染色体时发现该基因失活，这就表明MECP2基因的突变是导致Rett综合症的主要原因。MeCP2在大部分器官的组织和细胞中都有表达，但表达水平最高的还是在脑部神经细胞。MeCP2蛋白的表达时序和中枢神经系统的成熟相关，最近还有报道说这个蛋白可能参与神经元细胞之间的突触的形成，其作用模式可能是一种活性依赖的基因表达。多个实验室证实在小鼠出生后神经细胞中的选择性突变MeCP2会导致小鼠出现类似Rett综合症的症状，这说明MeCP蛋白在神经元细胞成熟过程中起重要作用。
实验发现将MeCP2蛋白导入有丝分裂后神经细胞MeCP2缺陷的突变小鼠中能够显著减轻Rett综合症，并且证明过多的MeCP2同样会引起运动障碍。实验结果提示：神经元细胞在新生儿时期能够正常工作，当长期处于MeCP2蛋白缺失的环境中才表现出功能紊乱的现象。如果这个假设是成立的，那防止Rett综合症发作的治疗措施就应该着手于新生婴儿。
综上所述，MeCP2蛋白在DNA的甲基化中有着很重要的生物学作用，并且与Rett综合症等相关疾病有着密切的联系。为了进一步研究MeCP2蛋白的功能，本研究克隆得到了MeCP2的全长编码序列，并通过Western Blot检测表达的融合蛋白，为进一步研究其功能打下基础。
参考文献：
[1]Bird A P CpG-rich islands and the function ofDNA methyla-tion[J].Nature，1986，321：209-213.
[2]Riggs A D，Jones P D.5-methylcytosine.gene regulation andcancer[J].Adv Cancer Res，1984,40：1-30.
关键词：表达DNA甲基化 甲基化 CpG结合蛋白2(MeCP2) 克隆 Rett综合症
中图分类号：Q71 文献标识码：A 文章编号：1007-3973(2011)004-087-02
1 概述
DNA甲基化对基因的表达有抑制作用，而去甲基化则可以恢复基因表达的活性。甲基化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲基化酶可将新合成的未甲基化位点进行甲基化。结构基因含有很多CpG结构，CpG和GpC中两个胞嘧啶的5位碳原子通常被甲基化，且两个甲基集团在DNA双链大沟中呈特定三维结构。
哺乳动物中，CpG序列在基因组中出现的频率仅有1％，远低于基因组中的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中，CpG序列密度却很高，可以达均值的5倍以上。基因组中60％-90％的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地组成CpG岛，大约含有500多个碱基，CpG岛位于结构基因启动子的核心序列和转录起始区域，一般是第一个外显子区。在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛，而且只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化。健康人基因组中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG位点则通常是处于甲基化状态。
DNA甲基化对基因表达的抑制作用是由于特异性结合于甲基化CpG位点的蛋白所造成的，这种蛋白被称作转录抑制子，或者甲基化CpG结合蛋白(MeCPs)。哺乳动物甲基化的主要方式是形成5-甲基胞嘧啶(5mC)，以甲基CpG(mCpG)形式出现，MeCPs特异地识别mCpG，对mCpG周围序列无特异要求，因而能广泛参与基因转录抑制。已经鉴定的MeCP家族成员有5个，即MeCPl、MeCP2、MBDl、MBD3和MBD4，其中MeCP2在细胞中含量丰富，并且能与含一个甲基CpG岛的DNA结合。
MeCP2在体外特异性的与甲基化DNA结合，在体内，其-在染色体中的分布依赖于甲基CpG。在小鼠中，MeCP2集中在中心粒异染色质上，在这里含有大部分(约40％)的5-甲基胞嘧啶。异染色质定位实验表明，完整的MeCP2蛋白被定位于野生型细胞的异染色质上，但低水平基因DNA甲基化的变异细胞只有较少的蛋白定位于异染色质。在MeCP2的删除实验中表明，异染色质上的定位需要85个氨基酸的与甲基-CpG结合的结构域。以上实验结果说明MeCP2在体内是一个与甲基-CpG结合的蛋白质，并可能是DNA甲基化下游序列的主要调节介质。
MeCP2是一个丰富的染色体蛋白，大小约84kD，含有4个外显子，它广泛存在于哺乳动物的体细胞中，尤其在脑组织中最丰富，但在早期胚胎细胞中很少表达。每个细胞核中约有1×105～5×105个MeCP2分子，比MeCPl高1～2个数量级。人类MeCP2基因定位于染色体Xq28，编码的蛋白质主要有两个功能域，N端85个氨基酸是甲基CpG结合功能域(methyIbindingdomain,MBD)，可与单一mCpG结合；c端104个氨基酸是转录抑制功能域(transeriptional repression domain，TRD)。
为了评价MeCP2的功能意义，Tate用含有一个Lae报告基因的无启动子靶基因结构，使雄性小鼠胚胎干细胞x联结基因发生变异。缺乏MeCP2的变异ES细胞的生长与父本一样，还能相当程度的分化。但从几个独立变异株衍生的嵌和胚胎却出现发育缺陷，其严重程度与变异细胞的分布里正相关。结果提示与DNA甲基转移酶一样，MeCP2在干细胞中是非必需的，但对胚胎发育却是必不可少的。Nan发现野生和重组大鼠MeCP2在体外抑制甲基化启动子的转录，但不抑制非甲基化启动子的转录。而且，MeCP2能在含甲基·CpG的组装前染色质中替换组氨酸H1(H1FI)。这些性质，再加上丰富的MeCP2和高频率的2-bp结合位置，提示MeCP2在脊椎动物基因组中可能起着普遍转录抑制因子的作用。对MeCP2抑制作用的机制的研究发现MeCP2以甲基化依赖的模式与染色体紧密的结合。它的转录抑制结构域能在一定距离内起作用。实验证明MeCP2的TRD与一个共抑制复合物协同起作用，此复合物含有转录抑制因子mSin3A和组氨酸乙酰基转移酶(HDACl)。体内的转录抑制可被去乙酰基转移酶抑制因子trichostatin A缓解，说明组氨酸的去乙酰化作用是抑制机制的基本要素。这些事实说明MeCP2很可能是连接DNA甲基化和组氨酸去乙酰化这两个普遍的基因调节机制的桥梁。
由于MeCP2是一个普遍的转录抑制子，所以它与肿瘤及其他很多疾病都有关联。因此，我们从人乳腺正常细胞eDNA文库中获得MeCP2基因，构建到真核表达载体上并在细胞中成功表达，为进一步研究MeCP2的功能打下了基础。
2 结果
2.1 PCR扩增MeCP2cDNA片段
通过PCR扩增的方法成功获得了MeCP2cDNA片段，PCR的产物在1％琼脂糖凝胶上的分析，特异性片段的大小估计为171lbp。
2.2重组质粒的鉴定
(1)限制性内切酶酶切鉴定
用BamH I和EcoR I双酶切重组质粒pFLAG-MeCP2和载体pcDNA3-FLAG，得到与预期大小相符的外源基因插入片段，而对照的pcDNA3-FLAG经双酶切后无此插入片段，说明克隆成功。
(2)测序鉴定
将重组质粒pFLAG-MeCP2送去进行测序，结果与文库中的MeCP2 cDNA片段比对相吻合，说明插入的片段是正确的，克隆成功。
2.3FLAG-MeCP2的表达鉴定
将重组质粒pFLAG-MeCP2转化到大肠杆DH57中，转化菌经IPTG诱导表达FLAG-MeCP2融合蛋白。Western Blot检测表明，DH5(pFLAG-MeCP2)在84 kD处有一特异性的表达带，与空载体的表达结果比较可知，特异表达带即为FLAG抗体与FLAG-MeCP2融合蛋白发生特异反应所产生，说明DH5(pFLAG-MeCP2)成功表达FLAG-MeCP2融合蛋白。
3 讨论
由于甲基化普遍存在于生物体的DNA中，所以其作用显得格外重要。DNA甲基化可以引起基因突变(C→T)，DNMT的催化反应可以加快C(胞嘧啶)和5mC脱氨，封闭u(尿嘧啶)的修复，并且使u→T改变，故DNMT可促使CpG序列的c→T突变。抑癌基因p53就是一个典型的例证：50％实体瘤病人 出现p53基因突变，突变中24％是CpG甲基化后脱氨引起的C→T突变。
此外，DNA甲基化还可能影响基因错配修复。Ahujia发现MMR缺陷时，CpG岛的甲基化增强，并认为MMR与DNA甲基化有关。在基因错配修复过程中甲基化具有导向识别作用，而在错配修复基因表达缺陷的原因中基因突变和基因启动子区的高甲基化是其主要原因。DNA甲基化最重要的作用就是对基因表达的抑制。甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素，目前肿瘤相关甲基化的研究主要侧重于抑癌基因。这是由于DNA甲基化所引起的改变包括基因组整体甲基化水平的降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高，可以导致基因组的不稳定和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率提高。由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测，而且全基因组的低甲基化也随着肿瘤发生而出现，并且其随着肿瘤恶性度的增加而显著，因此甲基化的检测可用于肿瘤的分级。此外，许多报告都指出肿瘤的发生与甲基化有着密不可分的联系。由此可以看出，甲基化的研究可以为肿瘤的早期预测、分类、分级及预后评估提供新的依据。
本实验所克隆的MeCP2主要集中在中心粒的异染色质上，通过TRD与共抑制因子mSin3A、HDACI及HDAC2构成复合体抑制转录。现在发现MeCP2蛋白的功能主要有3种：
(1)MeCP2具有转录抑制和调控功能。
(2)MeCP2蛋白在小鼠和人体的发育过程中存在空间上和时间上的分布。MeCP2蛋白大量存在于成熟的中枢神经系统中，较早出现于脊髓和脑干等个体发育早期的结构中。MeCP2蛋白存在于神经细胞中，但在神经胶质细胞中却没有被发现。
(3)MeCP2基因的突变与相关疾病。MeCP2在胚胎发育中是必不可少的，它的突变会导致Rett综合症，这种疾病的主要症状是由于神经发育的不良导致的大脑迟缓，多见于女性。此外MeCP2的突变还与Angelman综合症和孤独症有关。
Rett综合症是一种严重影响儿童精神运动发育的神经系统疾病，这种罕见的复杂性神经系统疾病目前没有可行的治疗方法，最终患者会彻底丧失行为能力。
研究人员发现在大约80％的案例中，RTT与x染色体连接MECP2基因的突变相关，即当我们定位在非活性的x染色体时发现该基因失活，这就表明MECP2基因的突变是导致Rett综合症的主要原因。MeCP2在大部分器官的组织和细胞中都有表达，但表达水平最高的还是在脑部神经细胞。MeCP2蛋白的表达时序和中枢神经系统的成熟相关，最近还有报道说这个蛋白可能参与神经元细胞之间的突触的形成，其作用模式可能是一种活性依赖的基因表达。多个实验室证实在小鼠出生后神经细胞中的选择性突变MeCP2会导致小鼠出现类似Rett综合症的症状，这说明MeCP蛋白在神经元细胞成熟过程中起重要作用。
实验发现将MeCP2蛋白导入有丝分裂后神经细胞MeCP2缺陷的突变小鼠中能够显著减轻Rett综合症，并且证明过多的MeCP2同样会引起运动障碍。实验结果提示：神经元细胞在新生儿时期能够正常工作，当长期处于MeCP2蛋白缺失的环境中才表现出功能紊乱的现象。如果这个假设是成立的，那防止Rett综合症发作的治疗措施就应该着手于新生婴儿。
综上所述，MeCP2蛋白在DNA的甲基化中有着很重要的生物学作用，并且与Rett综合症等相关疾病有着密切的联系。为了进一步研究MeCP2蛋白的功能，本研究克隆得到了MeCP2的全长编码序列，并通过Western Blot检测表达的融合蛋白，为进一步研究其功能打下基础。
参考文献：
[1]Bird A P CpG-rich islands and the function ofDNA methyla-tion[J].Nature，1986，321：209-213.
[2]Riggs A D，Jones P D.5-methylcytosine.gene regulation andcancer[J].Adv Cancer Res，1984,40：1-30.