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摘要：目的 优选复方金铃四逆四物失笑散颗粒中挥发油提取工艺及羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）包合工艺。方法 采用L9（34）正交试验，以挥发油提取量为评价指标，确定最佳提取工艺。以挥发油包合率和包合物收得率综合评分为评价指标，优选最佳包合工艺。采用薄层层析法（TLC）对包合物进行表征分析。结果 最佳提取工艺：药材粉碎度为20目，加8倍量水，蒸馏提取8 h。最优包合工艺：挥发油与HP-β-CD投料配比为1∶6，包合温度30 ℃，研磨2 h。TLC图谱显示挥发油已被包合并形成稳定包合物。结论 优选的提取和包合工艺质量稳定、可行性强。
关键词：复方金铃四逆四物失笑散颗粒；挥发油；羟丙基-β-环糊精；提取工艺；包合工艺；正交设计
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.026
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）09-0095-04
Study on Extraction Process of Volatile Oil and Inclusion Preparation of Hydroxypropyl- β- cyclodextrin from Compound Jinling Sini Siwu Shixiaosan Granules BAI Chun-xia1， XIE Ping2， FENG Jian2， JIANG Chuan1， NING Hai-yan1 （1.Chengdu University of TCM， Chengdu 610072， China；2.Teaching Hospital of Chengdu University of TCM， Chengdu 610072， China）
Abstract：Objective To optimize the extraction process of volatile oil and inclusion preparation of hydroxypropyl-β-cyclodextrin from compound Jinling Sini Siwu Shixiaosan Granules. Methods The orthogonal approach of L9 （34） was applied to investigate the volume of volatile oil extraction by 3 factors to obtain the optimum extraction conditions. With inclusion rate of volatile oil and yield of inclusion compound as comprehensive evaluation indexes， the optimum preparation conditions were discussed. The characterization of this prepared inclusion was analyzed by TLC. Results The optimum extraction conditions were as follows：the crude medicine with medicinal powder was shattered into 20 meshes；8 times the amount of water was added and was extracted for 8 h. The best inclusion conditions were as follows：the proportion of volatile oil to HP-β-CD was 1∶6， with inclusion temperature of 30 ℃， grinding time of 2 h. Analysis results of TLC showed that stable inclusion compound was formed from volatile oil and HP-β-CD. Conclusion The optimized extraction process and inclusion preparation are with stable quality and high feasibility.
Key words：compound Jinling Sini Siwu Shixiaosan Granules；volatile oil；HP-β-CD；extraction process；inclusion preparation；orthogonal approach
復方金铃四逆四物失笑散颗粒（以下简称“复方失笑散颗粒”）为成都中医药大学附属医院名老中医针对原发性痛经实证病机“不通则痛”，在古方基础上加减而得，处方主要由延胡索、柴胡、枳壳、当归、川芎、五灵脂等中药组成，具有理气活血、化瘀止痛之效。挥发油是方中当归、枳壳、柴胡及川芎主要活
通讯作者：冯俭，E-mail：fengjan222@tom.com
性成分，具有易挥发、氧化变质及对光、热稳定性差等特性，在制剂过程中要避免挥发损失而保证药效。
羟丙基-β-环糊精（hydroxypropyl-β- cyclodextrin，HP-β-CD）为挥发油包合辅料，其外部亲水性结构及内部亲脂性内腔能与脂溶性药物形成水溶性包合物[1]，不仅溶解性高、对热稳定，且对肾、肌肉和黏膜几乎无刺激，是一种低毒、安全、有效的水溶性包合辅料[2]。本试验结合HP-β-CD包合材料，采用L9（34）正交设计和多指标综合评分法对药材进行提取工艺和包合工艺研究，从而控制制剂质量。 1 仪器与试药
AS10300A型超声清洗仪（天津奥特赛恩斯仪器），FW135型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司），101A-I真空干燥箱（上海亚明热处理设备有限公司），挥发油测定器（上海玻璃仪器厂），ZF-90多功能暗箱式紫外仪（上海宝山顾村电光仪器厂）。
川芎、当归、柴胡、枳壳均购自成都中医药大学附属医院中药房，经成都中医药大学药学院严铸云教授鉴定，均符合2010年版《中华人民共和国药典》相关项下规定。HP-β-CD（天津市博迪化工有限公司），其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 提取工艺研究
2.1.1 正交试验 根据预试验结果，按复方质量配比（1∶1∶1∶1）称取药材共120 g，采用L9（34）法，以药材粉碎度（A）、加水倍量（B）、蒸馏时间（C）为考察因素（见表1），以挥发油得量为评价指标，按2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录挥发油测定甲法[3]提取挥发油，优选提取工艺，结果见表2、表3。
直观分析可见，各因素对挥发油得率的影响次序为A>C>B>D；方差分析显示，因素A和C对挥发油得量有显著影响（P<0.05），因素B对挥发油得量影响不大（P>0.05），为节约原料、降低成本，故选择加水量为8倍量。结合生产实际确定挥发油提取工艺为A2B1C3，即药材粉碎度20目、加8倍量水、提取8 h。
2.1.2 验证试验 精密称取复方比例混合药材3份，按上述工艺参数进行验证试验，平均挥发油得量为1.46 mL，RSD=0.79%，表明此工艺条件重复性好。
2.2 挥发油提取
分别称取4味药材各600 g，按上述工艺参数提取挥发油，冷却，用乙醚萃取3次，合并乙醚液，35 ℃下回收乙醚至小体积，加无水硫酸钠脱水，过滤，挥干乙醚，密闭保存。
2.3 包合工艺优化
2.3.1 制备方法考察 根据文献[4-5]，分别采用研磨法、水溶液搅拌法、超声波法对挥发油进行包合，以挥发油包合率为评价指标，选择最优包合方法。
2.3.1.1 研磨法 称取HP-β-CD 6 g，加蒸馏水30 mL，研磨成糊状，缓慢滴加1 mL挥发油，温水浴中研磨3 h，取出冷却，冷藏24 h，抽滤，沉淀用石油醚洗涤，50 ℃真空干燥4 h，得粉状包合物。
2.3.1.2 水溶液搅拌法 称取HP-β-CD 6 g，加蒸馏水30 mL，置恒温磁力搅拌器上，搅拌（200 r/min）成饱和水溶液，缓慢滴加1 mL挥发油，恒温40 ℃搅拌3 h，取出冷却，冷藏24 h，抽滤，沉淀用石油醚洗涤，50 ℃真空干燥4 h，得粉状包合物。
2.3.1.3 超声波法 称取HP-β-CD 6 g，加蒸馏水30 mL，超声混匀，缓慢滴加1 mL挥发油，恒温40 ℃超声处理3 h，取出冷却，冷藏24 h，抽滤，沉淀用石油醚洗涤，50 ℃真空干燥4 h，得粉状包合物。
2.3.2 包合物质量评价 取等量上述3种包合物，分别置圓底烧瓶中，加100 mL蒸馏水，提取4 h以上，至油量不再增加时停止加热，测定包合物中挥发油回收量。同时，精密移取1 mL挥发油，置圆底烧瓶中，同法操作，测得平均空白回收率（挥发油测得量÷挥发油加入量×100%）为89%。计算挥发油包合率[包合物中实际挥发油量÷（挥发油加入量×空白回收率）×100%]，结果研磨法>水溶液搅拌法>超声波法，见表4。采用最小显著性差异法对3组数据进行统计分析，结果见表5。方差分析结果显示，3组样本均数两两比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。综合分析，选择研磨法为挥发油最佳包合方法。
2.3.3 正交试验 采用研磨法，选择对试验结果影响较大的挥发油与HP-β-CD投料比（A）、包合温度（B）及研磨时间（C）为考察因素（见表6）。以挥发油包合率和收得率[包合物质量÷（HP-β-CD量+挥发油加入量）×100%]的综合评分为评价指标，二者权重系数分别为70和30，优选最佳包合工艺，结果见表7、表8。
直观分析显示，各因素水平作用主次顺序为A>B>C，A2>A3>A1、B3>B2>B1、C3>C1>C2。方差分析结果表明，因素A对挥发油包合存在显著影响（P<0.05），而因素B和C对包合结果影响不大（P>0.05）。考虑省时节能问题，包合温度选择30 ℃，研磨时间选取2 h。故各因素水平优化组合为A2B1C1，即挥发油与HP-β-CD投料比为1∶6、包合温度为30 ℃、研磨2 h。
2.3.4 验证试验 精密称取适量挥发油和HP-β-CD各3份，按上述工艺进行验证试验，包合物收得率、挥发油包合率平均值分别为86.26%、88.35%，RSD分别为1.28%、1.10%，表明此包合工艺稳定、可行。
2.3.5 包合物稳定性试验 取按上述最佳工艺制备的包合物7份置于烧杯中，另取挥发油1 mL置于有等体积水量的烧杯中，于50 ℃通风恒温箱放置7 d，并分别于1、2、3、4、5、6、7 d取样，测定样品溶液中挥发油得量，结果见图1。可见，包合物中油释放率明显低于油水混合物中的释放率，7 d后包合物含油量明显高于油水混合物含油量，表明挥发油已被包合并形成稳定包合物。
图1 挥发油HP-β-CD包合物稳定性分析
2.3.6 包合物薄层层析分析 取包合物3 g，加95%乙醇30 mL溶解，振摇后静置1 h，过滤，取滤液，作为供试品溶液a；精密移取挥发油0.5 mL，加95%乙醇30 mL溶解，作为供试品溶液b；取包合物3 g，置100 mL圆底烧瓶中，加95%乙醇30 mL回流1 h，冷却，过滤，取滤液，作为供试品溶液c；取空白HP-β-CD 3 g，同法制得供试品溶液d。吸取上述4种样品，点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯（10∶1）为展开剂，展开，取出，挥干，喷以5%香草醛酸溶液显色，置紫外光 灯（365 nm）下检视。结果显示：b和c出现相同颜色荧光斑点，说明挥发油在包合前后成分未发生变化；a和d无相应斑点出现，表明挥发油已被HP-β-CD包合并形成包合物。
3 讨论
环糊精在药物制剂方面应用越来越广泛，β-环糊精（β-CD）应用最多，但因其本身水溶解度较低而限制了其在药学邻域中进一步开发利用[6]。HP-β-CD较β-CD具有更好的水溶性和稳定性，可提高油利用率和包合物得率，降低生产成本。同时，HP-β-CD克服了β-CD非胃肠道给药的肾毒性缺点，为中药新剂型开发提供了辅料基础。
在提取工艺研究中，发现药材粉碎度增大，颗粒间吸附力增大，提取率降低，且易发生糊化。药材粉碎后宜立即提取，避免挥发油损失。本试验对包合物3种制备方法进行考察，发现研磨法所得包合物粉末性状细腻、均匀，便于制剂混合均匀。稳定性试验表明，包合能提高挥发油稳定性并降低其释放率，更有利于制剂。通过TLC对包合物进行分析，结果显示，挥发油已被包合在HP-β-CD空腔结构内，并形成了稳定分子包合物相。此外，包合完成后，宜低温放置，以减少包合物反溶解，提高包合物收得率。
参考文献：
[1] 丁平田，吴雪梅.药物制剂的新型辅料2-羟丙基-β-环糊精[J].国外医药：合成药、生化药、制剂分册，1996，17（2）：107-111.
[2] Tao T. Characteristics and pharmaceutical applications of hydroxypropyl-betacyclo-dextrin[J].中国医药工业杂志，2002，33（6）：304-309.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录63.
[4] 桂卉，刘东文，邹龙，等.白术、木香混合挥发油β-环糊精包合物制备工艺的研究[J].时珍国医国药，2009，20（7）：1682-1684.
[5] 师白梅，严建业，王元清，等.当归、枳壳挥发油的提取与包合工艺研究[J].中南药学，2012，10（6）：401-405.
[6] 杨彩琴，王静，纪桂霞.羟丙基β-环糊精对双苯氟嗪包合作用的热力学研究[J].化学研究与应用，2010，22（4）：23-27.
（收稿日期：2015-01-24）
（修回日期：2015-03-27；编辑：陈静）
关键词：复方金铃四逆四物失笑散颗粒；挥发油；羟丙基-β-环糊精；提取工艺；包合工艺；正交设计
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.026
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）09-0095-04
Study on Extraction Process of Volatile Oil and Inclusion Preparation of Hydroxypropyl- β- cyclodextrin from Compound Jinling Sini Siwu Shixiaosan Granules BAI Chun-xia1， XIE Ping2， FENG Jian2， JIANG Chuan1， NING Hai-yan1 （1.Chengdu University of TCM， Chengdu 610072， China；2.Teaching Hospital of Chengdu University of TCM， Chengdu 610072， China）
Abstract：Objective To optimize the extraction process of volatile oil and inclusion preparation of hydroxypropyl-β-cyclodextrin from compound Jinling Sini Siwu Shixiaosan Granules. Methods The orthogonal approach of L9 （34） was applied to investigate the volume of volatile oil extraction by 3 factors to obtain the optimum extraction conditions. With inclusion rate of volatile oil and yield of inclusion compound as comprehensive evaluation indexes， the optimum preparation conditions were discussed. The characterization of this prepared inclusion was analyzed by TLC. Results The optimum extraction conditions were as follows：the crude medicine with medicinal powder was shattered into 20 meshes；8 times the amount of water was added and was extracted for 8 h. The best inclusion conditions were as follows：the proportion of volatile oil to HP-β-CD was 1∶6， with inclusion temperature of 30 ℃， grinding time of 2 h. Analysis results of TLC showed that stable inclusion compound was formed from volatile oil and HP-β-CD. Conclusion The optimized extraction process and inclusion preparation are with stable quality and high feasibility.
Key words：compound Jinling Sini Siwu Shixiaosan Granules；volatile oil；HP-β-CD；extraction process；inclusion preparation；orthogonal approach
復方金铃四逆四物失笑散颗粒（以下简称“复方失笑散颗粒”）为成都中医药大学附属医院名老中医针对原发性痛经实证病机“不通则痛”，在古方基础上加减而得，处方主要由延胡索、柴胡、枳壳、当归、川芎、五灵脂等中药组成，具有理气活血、化瘀止痛之效。挥发油是方中当归、枳壳、柴胡及川芎主要活
通讯作者：冯俭，E-mail：fengjan222@tom.com
性成分，具有易挥发、氧化变质及对光、热稳定性差等特性，在制剂过程中要避免挥发损失而保证药效。
羟丙基-β-环糊精（hydroxypropyl-β- cyclodextrin，HP-β-CD）为挥发油包合辅料，其外部亲水性结构及内部亲脂性内腔能与脂溶性药物形成水溶性包合物[1]，不仅溶解性高、对热稳定，且对肾、肌肉和黏膜几乎无刺激，是一种低毒、安全、有效的水溶性包合辅料[2]。本试验结合HP-β-CD包合材料，采用L9（34）正交设计和多指标综合评分法对药材进行提取工艺和包合工艺研究，从而控制制剂质量。 1 仪器与试药
AS10300A型超声清洗仪（天津奥特赛恩斯仪器），FW135型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司），101A-I真空干燥箱（上海亚明热处理设备有限公司），挥发油测定器（上海玻璃仪器厂），ZF-90多功能暗箱式紫外仪（上海宝山顾村电光仪器厂）。
川芎、当归、柴胡、枳壳均购自成都中医药大学附属医院中药房，经成都中医药大学药学院严铸云教授鉴定，均符合2010年版《中华人民共和国药典》相关项下规定。HP-β-CD（天津市博迪化工有限公司），其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 提取工艺研究
2.1.1 正交试验 根据预试验结果，按复方质量配比（1∶1∶1∶1）称取药材共120 g，采用L9（34）法，以药材粉碎度（A）、加水倍量（B）、蒸馏时间（C）为考察因素（见表1），以挥发油得量为评价指标，按2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录挥发油测定甲法[3]提取挥发油，优选提取工艺，结果见表2、表3。
直观分析可见，各因素对挥发油得率的影响次序为A>C>B>D；方差分析显示，因素A和C对挥发油得量有显著影响（P<0.05），因素B对挥发油得量影响不大（P>0.05），为节约原料、降低成本，故选择加水量为8倍量。结合生产实际确定挥发油提取工艺为A2B1C3，即药材粉碎度20目、加8倍量水、提取8 h。
2.1.2 验证试验 精密称取复方比例混合药材3份，按上述工艺参数进行验证试验，平均挥发油得量为1.46 mL，RSD=0.79%，表明此工艺条件重复性好。
2.2 挥发油提取
分别称取4味药材各600 g，按上述工艺参数提取挥发油，冷却，用乙醚萃取3次，合并乙醚液，35 ℃下回收乙醚至小体积，加无水硫酸钠脱水，过滤，挥干乙醚，密闭保存。
2.3 包合工艺优化
2.3.1 制备方法考察 根据文献[4-5]，分别采用研磨法、水溶液搅拌法、超声波法对挥发油进行包合，以挥发油包合率为评价指标，选择最优包合方法。
2.3.1.1 研磨法 称取HP-β-CD 6 g，加蒸馏水30 mL，研磨成糊状，缓慢滴加1 mL挥发油，温水浴中研磨3 h，取出冷却，冷藏24 h，抽滤，沉淀用石油醚洗涤，50 ℃真空干燥4 h，得粉状包合物。
2.3.1.2 水溶液搅拌法 称取HP-β-CD 6 g，加蒸馏水30 mL，置恒温磁力搅拌器上，搅拌（200 r/min）成饱和水溶液，缓慢滴加1 mL挥发油，恒温40 ℃搅拌3 h，取出冷却，冷藏24 h，抽滤，沉淀用石油醚洗涤，50 ℃真空干燥4 h，得粉状包合物。
2.3.1.3 超声波法 称取HP-β-CD 6 g，加蒸馏水30 mL，超声混匀，缓慢滴加1 mL挥发油，恒温40 ℃超声处理3 h，取出冷却，冷藏24 h，抽滤，沉淀用石油醚洗涤，50 ℃真空干燥4 h，得粉状包合物。
2.3.2 包合物质量评价 取等量上述3种包合物，分别置圓底烧瓶中，加100 mL蒸馏水，提取4 h以上，至油量不再增加时停止加热，测定包合物中挥发油回收量。同时，精密移取1 mL挥发油，置圆底烧瓶中，同法操作，测得平均空白回收率（挥发油测得量÷挥发油加入量×100%）为89%。计算挥发油包合率[包合物中实际挥发油量÷（挥发油加入量×空白回收率）×100%]，结果研磨法>水溶液搅拌法>超声波法，见表4。采用最小显著性差异法对3组数据进行统计分析，结果见表5。方差分析结果显示，3组样本均数两两比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。综合分析，选择研磨法为挥发油最佳包合方法。
2.3.3 正交试验 采用研磨法，选择对试验结果影响较大的挥发油与HP-β-CD投料比（A）、包合温度（B）及研磨时间（C）为考察因素（见表6）。以挥发油包合率和收得率[包合物质量÷（HP-β-CD量+挥发油加入量）×100%]的综合评分为评价指标，二者权重系数分别为70和30，优选最佳包合工艺，结果见表7、表8。
直观分析显示，各因素水平作用主次顺序为A>B>C，A2>A3>A1、B3>B2>B1、C3>C1>C2。方差分析结果表明，因素A对挥发油包合存在显著影响（P<0.05），而因素B和C对包合结果影响不大（P>0.05）。考虑省时节能问题，包合温度选择30 ℃，研磨时间选取2 h。故各因素水平优化组合为A2B1C1，即挥发油与HP-β-CD投料比为1∶6、包合温度为30 ℃、研磨2 h。
2.3.4 验证试验 精密称取适量挥发油和HP-β-CD各3份，按上述工艺进行验证试验，包合物收得率、挥发油包合率平均值分别为86.26%、88.35%，RSD分别为1.28%、1.10%，表明此包合工艺稳定、可行。
2.3.5 包合物稳定性试验 取按上述最佳工艺制备的包合物7份置于烧杯中，另取挥发油1 mL置于有等体积水量的烧杯中，于50 ℃通风恒温箱放置7 d，并分别于1、2、3、4、5、6、7 d取样，测定样品溶液中挥发油得量，结果见图1。可见，包合物中油释放率明显低于油水混合物中的释放率，7 d后包合物含油量明显高于油水混合物含油量，表明挥发油已被包合并形成稳定包合物。
图1 挥发油HP-β-CD包合物稳定性分析
2.3.6 包合物薄层层析分析 取包合物3 g，加95%乙醇30 mL溶解，振摇后静置1 h，过滤，取滤液，作为供试品溶液a；精密移取挥发油0.5 mL，加95%乙醇30 mL溶解，作为供试品溶液b；取包合物3 g，置100 mL圆底烧瓶中，加95%乙醇30 mL回流1 h，冷却，过滤，取滤液，作为供试品溶液c；取空白HP-β-CD 3 g，同法制得供试品溶液d。吸取上述4种样品，点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯（10∶1）为展开剂，展开，取出，挥干，喷以5%香草醛酸溶液显色，置紫外光 灯（365 nm）下检视。结果显示：b和c出现相同颜色荧光斑点，说明挥发油在包合前后成分未发生变化；a和d无相应斑点出现，表明挥发油已被HP-β-CD包合并形成包合物。
3 讨论
环糊精在药物制剂方面应用越来越广泛，β-环糊精（β-CD）应用最多，但因其本身水溶解度较低而限制了其在药学邻域中进一步开发利用[6]。HP-β-CD较β-CD具有更好的水溶性和稳定性，可提高油利用率和包合物得率，降低生产成本。同时，HP-β-CD克服了β-CD非胃肠道给药的肾毒性缺点，为中药新剂型开发提供了辅料基础。
在提取工艺研究中，发现药材粉碎度增大，颗粒间吸附力增大，提取率降低，且易发生糊化。药材粉碎后宜立即提取，避免挥发油损失。本试验对包合物3种制备方法进行考察，发现研磨法所得包合物粉末性状细腻、均匀，便于制剂混合均匀。稳定性试验表明，包合能提高挥发油稳定性并降低其释放率，更有利于制剂。通过TLC对包合物进行分析，结果显示，挥发油已被包合在HP-β-CD空腔结构内，并形成了稳定分子包合物相。此外，包合完成后，宜低温放置，以减少包合物反溶解，提高包合物收得率。
参考文献：
[1] 丁平田，吴雪梅.药物制剂的新型辅料2-羟丙基-β-环糊精[J].国外医药：合成药、生化药、制剂分册，1996，17（2）：107-111.
[2] Tao T. Characteristics and pharmaceutical applications of hydroxypropyl-betacyclo-dextrin[J].中国医药工业杂志，2002，33（6）：304-309.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录63.
[4] 桂卉，刘东文，邹龙，等.白术、木香混合挥发油β-环糊精包合物制备工艺的研究[J].时珍国医国药，2009，20（7）：1682-1684.
[5] 师白梅，严建业，王元清，等.当归、枳壳挥发油的提取与包合工艺研究[J].中南药学，2012，10（6）：401-405.
[6] 杨彩琴，王静，纪桂霞.羟丙基β-环糊精对双苯氟嗪包合作用的热力学研究[J].化学研究与应用，2010，22（4）：23-27.
（收稿日期：2015-01-24）
（修回日期：2015-03-27；编辑：陈静）