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【摘要】 目的 探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）的在实验性小鼠纤维化肺组织的表达及其肺间质纤维化严重程度的关系。方法 用平阳霉素盐溶液管内灌注诱导ICR小鼠制备肺间质纤维化模型，处死小鼠并收集肺组织进行HE染色、Masson染色和组织免疫化学检测TGF-β1的表达。结果 TGF-β1除了表达在支气管粘膜细胞，血管内皮细胞、巨噬细胞外，还表达在细支气管和大的血管周围的成纤维细胞、成纤维细胞灶和间质散在间质细胞。TGF-β1与肺纤维化分级成分别呈强正相关关系。结论 TGF-β1在肺间质纤维化形成过程中起重要作用。
【关键词】 肺间质纤维化；特发性肺纤维化；转化生长因子-β1；小鼠；动物模型
肺间质纤维化是不同病因引起的肺间质疾病（ILD）的共同结局。但是其发病机制仍不清楚。近年来，肺间质纤维化发病率有增高趋势。肺泡的持续性损伤、成纤维细胞的活化增殖和细胞外基质（ECM）的过度沉积是其病理特征。肌成纤维细胞是活化的成纤维细胞的亚型，ECM成份的主要来源，是致纤维化的主要效应细胞。成纤维细胞逐渐成为了治疗的标靶[1]。
1 材料与方法
1.1 试剂 平阳霉素购自哈尔滨博莱霉素制药公司；兔抗鼠TGF-β1单克隆抗体购自abcam公司；即用型SP试剂盒购自北京中杉生物制剂有限公司。
1.2 动物模型 健康清级雄性ICR小鼠80只，随机分为对照组和模型组各40只。模型制备按参照文献进行[2]。模型组和对照组都在第1w、2w、3w和4w各随机处死9只。右肺进行固定，脱水透明，常规包埋。
1.3 实验方法
1.3.1 免疫组织化学 切片脱蜡至水，在室温下经3%H2O2封闭内源性过氧化物酶30min；一抗TGF-β1室温孵育1小时；过氧化物酶标记二抗，室温孵育20min后，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封固。
1.4 结果的判定
1.4.1 肺间质纤维化程度的判定，按参考文献进行[3]，分为：0级，I级轻度纤维化，Ⅱ级中度纤维化，Ⅲ级重度纤维化。
1.4.2 免疫组织化学结果的判定，按文献进行[4]，免疫反应性：在高倍镜下观察0=0%阳性细胞；1=<10%阳性细胞；2=10%-50%阳性细胞；3=>50%阳性细胞。染色强度：0=无；1=仅仅在×400下染色明显；2=×100而不在×40染色明显；3=×40染色明显。免疫反应性和染色强度相加得到染色指数（0=无；1-2=低；3-4=中；5-6=高）。
1.4.3 统计分析 数据资料，应用SSPS15.0版本统计软件包进行spearman秩相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
TGF-β1在肺间质纤维化中表达及其与肺间质纤维化相关性：TGF-β1除了表达在支气管粘膜细胞，血管内皮细胞和巨噬细胞外，表达在细支气管和大的血管周围的成纤维细胞、成纤维细胞灶和间质散在间质细胞。阳性细胞呈黄色、棕褐色。并且TGF-β1与纤维化的分级呈正相关关系（spearman相关rs=0.628，P<0.001）。
3 讨 论
肺间质纤维化涉及多种细胞和细胞因子的复杂网络，以成纤维细胞/肌成纤维细胞的活化、胶原代谢紊乱和ECM的重塑为其病理特征。其中成纤维细胞灶（由主要肌成纤维细胞组成）在肺间质纤维化过程中起到重要的作用。因此有效抑制肌成纤维细胞募集和肌成纤维细胞持续性的增殖分化，促进其凋亡也可能成为有效的治疗肺间质纤维化的目标。但是缺乏特异性的载体。
大量的研究结果证明TGF-β1是肺间质纤维化形成过程中的关键致纤维化细胞因子，在诱导成纤维细胞的分化增值过程中起到重要的作用[5]。由于在肺间质纤维化中，巨噬细胞，内皮细胞、粘膜細胞和成纤维细胞可通过自分泌或旁分泌TGF-β1作用于成纤维细胞，合成ECM成分。因此抑制TGF-β1的分泌或者阻断其传导通路将会为肺间质纤维化的治疗提供新的治疗方法和途径。
参考文献
[1] SJ Flavell，TZ Hou，S Lax，AD Filer，M Salmon and CD Buckley.Fibroblasts as novel therapeutic targets in chronic inflammation[J].British Journal of Pharmacology，2008，（153）：S241-S246.
[2] Thall RS，Barton RW，Damato DA，et al.Differential cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid obtained at various stages during the development of bleomycin2 induced pulmonary fibrosis in the rat[J].Am Rev Respir Dis，1982，126 （3）：4882-492.
[3] Szapiel SV，El son NA.Bleomycin2induced interstitial pulmonary disease in t he nude，at hymic mouse[J].Am Rev Respir Dis，1979，120 （4）：893.
[4] Acharya，P.S，A.Zukas，V.Chandan，A.L.Katzenstein & E.Pure：Fibroblast activation protein：a serine protease expressed at the remodeling interface in idiopathic pulmonary fibrosis[J].Hum Pathol，2006，（37）：352-360.
[4] Eric S.White，Rachelle G.Atrasz，Biao Hu，Sem H.Phan，Vuk Stambolic，Tak W.Mak，Cory M.Hogaboam，Kevin R.Flaherty，Fernando J.Martinez，Christopher D.Kontos，and Galen B.Negative Regulation of Myofibroblast Differentiation by PTEN （Phosphatase and Tensin Homolog Deleted on Chromosome 10）[J].Toews Am J Respir Crit Care Med，2006，173：112-121.
【关键词】 肺间质纤维化；特发性肺纤维化；转化生长因子-β1；小鼠；动物模型
肺间质纤维化是不同病因引起的肺间质疾病（ILD）的共同结局。但是其发病机制仍不清楚。近年来，肺间质纤维化发病率有增高趋势。肺泡的持续性损伤、成纤维细胞的活化增殖和细胞外基质（ECM）的过度沉积是其病理特征。肌成纤维细胞是活化的成纤维细胞的亚型，ECM成份的主要来源，是致纤维化的主要效应细胞。成纤维细胞逐渐成为了治疗的标靶[1]。
1 材料与方法
1.1 试剂 平阳霉素购自哈尔滨博莱霉素制药公司；兔抗鼠TGF-β1单克隆抗体购自abcam公司；即用型SP试剂盒购自北京中杉生物制剂有限公司。
1.2 动物模型 健康清级雄性ICR小鼠80只，随机分为对照组和模型组各40只。模型制备按参照文献进行[2]。模型组和对照组都在第1w、2w、3w和4w各随机处死9只。右肺进行固定，脱水透明，常规包埋。
1.3 实验方法
1.3.1 免疫组织化学 切片脱蜡至水，在室温下经3%H2O2封闭内源性过氧化物酶30min；一抗TGF-β1室温孵育1小时；过氧化物酶标记二抗，室温孵育20min后，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封固。
1.4 结果的判定
1.4.1 肺间质纤维化程度的判定，按参考文献进行[3]，分为：0级，I级轻度纤维化，Ⅱ级中度纤维化，Ⅲ级重度纤维化。
1.4.2 免疫组织化学结果的判定，按文献进行[4]，免疫反应性：在高倍镜下观察0=0%阳性细胞；1=<10%阳性细胞；2=10%-50%阳性细胞；3=>50%阳性细胞。染色强度：0=无；1=仅仅在×400下染色明显；2=×100而不在×40染色明显；3=×40染色明显。免疫反应性和染色强度相加得到染色指数（0=无；1-2=低；3-4=中；5-6=高）。
1.4.3 统计分析 数据资料，应用SSPS15.0版本统计软件包进行spearman秩相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
TGF-β1在肺间质纤维化中表达及其与肺间质纤维化相关性：TGF-β1除了表达在支气管粘膜细胞，血管内皮细胞和巨噬细胞外，表达在细支气管和大的血管周围的成纤维细胞、成纤维细胞灶和间质散在间质细胞。阳性细胞呈黄色、棕褐色。并且TGF-β1与纤维化的分级呈正相关关系（spearman相关rs=0.628，P<0.001）。
3 讨 论
肺间质纤维化涉及多种细胞和细胞因子的复杂网络，以成纤维细胞/肌成纤维细胞的活化、胶原代谢紊乱和ECM的重塑为其病理特征。其中成纤维细胞灶（由主要肌成纤维细胞组成）在肺间质纤维化过程中起到重要的作用。因此有效抑制肌成纤维细胞募集和肌成纤维细胞持续性的增殖分化，促进其凋亡也可能成为有效的治疗肺间质纤维化的目标。但是缺乏特异性的载体。
大量的研究结果证明TGF-β1是肺间质纤维化形成过程中的关键致纤维化细胞因子，在诱导成纤维细胞的分化增值过程中起到重要的作用[5]。由于在肺间质纤维化中，巨噬细胞，内皮细胞、粘膜細胞和成纤维细胞可通过自分泌或旁分泌TGF-β1作用于成纤维细胞，合成ECM成分。因此抑制TGF-β1的分泌或者阻断其传导通路将会为肺间质纤维化的治疗提供新的治疗方法和途径。
参考文献
[1] SJ Flavell，TZ Hou，S Lax，AD Filer，M Salmon and CD Buckley.Fibroblasts as novel therapeutic targets in chronic inflammation[J].British Journal of Pharmacology，2008，（153）：S241-S246.
[2] Thall RS，Barton RW，Damato DA，et al.Differential cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid obtained at various stages during the development of bleomycin2 induced pulmonary fibrosis in the rat[J].Am Rev Respir Dis，1982，126 （3）：4882-492.
[3] Szapiel SV，El son NA.Bleomycin2induced interstitial pulmonary disease in t he nude，at hymic mouse[J].Am Rev Respir Dis，1979，120 （4）：893.
[4] Acharya，P.S，A.Zukas，V.Chandan，A.L.Katzenstein & E.Pure：Fibroblast activation protein：a serine protease expressed at the remodeling interface in idiopathic pulmonary fibrosis[J].Hum Pathol，2006，（37）：352-360.
[4] Eric S.White，Rachelle G.Atrasz，Biao Hu，Sem H.Phan，Vuk Stambolic，Tak W.Mak，Cory M.Hogaboam，Kevin R.Flaherty，Fernando J.Martinez，Christopher D.Kontos，and Galen B.Negative Regulation of Myofibroblast Differentiation by PTEN （Phosphatase and Tensin Homolog Deleted on Chromosome 10）[J].Toews Am J Respir Crit Care Med，2006，173：112-121.