论文部分内容阅读
摘 要：糖尿病是危害人类健康的世界性公共卫生问题，而我国糖尿病患者正在呈上升趋势，近年已达近9200多万。传统的血糖检测只能检测患者及时血糖，对确诊糖尿病临床指标不高，而糖化血红蛋白作为血糖监测的金指标，能够有效提示病人血糖动态水平。目前市场上几个主要糖化血红蛋白检测的方法包括：液相色谱法、比浊法、金标法、亲和层析法等，存或设备昂贵、检测过程复杂或检测灵敏度低等问题。应用SELEX技术筛选糖化血红蛋白适配子，并通过荧光亲合体标记技术，使用普通荧光检测仪器即可读取，既提高了血红蛋白适配子的亲和力，又减少了设备门槛。对提高糖尿病的检测率有重大意义。
糖尿病是危害人类健康的世界性公共卫生问题，糖尿病是一种终生性疾病，其并发症是至残至死的主要原因，所以人们希望能尽早发现和治疗糖尿病。2007年～2008年，中华医学会糖尿病学分会在我国选择经济发展水平不同的14个省市，对糖尿病进行了流行病学调查。该调查发现，我国糖尿病患病率的增长速度令人震惊[1]。2002年，在全国营养状况调查过程中进行的糖尿病流行病学调查表明，我国城市糖尿病患病率为4.5%，农村为1.8%，推算全国有病人2000多万。而时隔6年，我国20岁以上人群的糖尿病患病率已达9.7%，推算病人约为9200万人;糖尿病前期患病率达15.5%，推算处于糖尿病前期者约1.48亿人，这意味着我国糖尿病“后备军”人群庞大。目前糖尿病的快速检测以血糖检测数据为主，但是该项检查主要是体现被检者临时血糖数据，如需确诊还要重复两至三次检查或者进行糖耐量测试，这对大部分糖尿病前期患者很难通过及时体检发现糖尿病前兆，从而能够在患病前采取干预治疗，提高患者健康指数。
1 糖化血红蛋白检测的意义
传统的糖尿病诊断和治疗监测采用空腹血糖、餐后血糖和口服葡萄糖耐量试验等，但是血糖参数仅代表抽血时的瞬间血糖水平，而糖化血红蛋白（GHb）作为反映长期血糖水平的金标准，也是监测糖尿病治疗的重要指标。GHb是红细胞中血红蛋白与葡萄糖缓慢、持续且不可逆地进行非酶促蛋白糖化反应的产物，形成两周后不易分开。当血液中葡萄糖浓度较高时，人体所形成的GHb含量也会相对较高[2]。正常生理条件下，非酶促糖化反应产物的生成量与反应物的浓度成正比。由于蛋白质浓度保持相对稳定，糖化水平主要决定于葡萄糖浓度，也与蛋白质与葡萄糖接触的时间长短有关。GHb可以反映最近2—3个月的平均血糖水平。2002年美国糖尿病协会已明确规定应定期检测GHb，并将其作为监测糖尿病血糖控制的金标。普及糖尿病知识，更新治疗理念，监测并保持GHb达标，更早、更合理地使用胰岛素等药物治疗，对于控制糖尿病并发症的发生发展尤为重要[3]。
2 糖化血红蛋白检测常规方法与优缺点
目前临床上常用的糖化血红蛋白的检测方法有以下几种：
2.1高压液相方法（HPLC）[4]
全自动分离测定GHb及血蛋白的变异体和亚型，但仪器的操作保养要求较高，CV值1%以内，以北京执信医疗公司的HLC-723 G7为代表。但由于此方法所使用的仪器昂贵，难以在比较基层的医院和实验室普及;微柱法手工操作步骤繁琐，层析时间和微柱的质量不易控制，易产生操作技术误差，重复性欠佳;而且干扰因素很多，尤其对pH值和温度的变化敏感，HbF及变异血红蛋白（HbS、HbC、HbE等）对结果干扰，干扰程度根据柱的分离能力而定，所以一定要仔细观察图谱。市场主流：高端HPLC方法学是日本TOSOH的G7，美国伯乐的DS5，价格在20万上下，中档为西门子拜耳的DCA Vantage，价格约在10万以下，低端和普及型的是挪威小旋风价格3.6万。
2.2 免疫方法[5]
（1）比浊法：利用抗原、抗体反应的原理进行测定。GHb的B链N末端提供了一个容易被抗体识别的抗原表位，用单克隆抗体特异识别GHb的B链N末端最后4～6个氨基酸组成的抗原表位，结合比浊法。
（2）离子捕获法：应用抗原抗体反应原理，并联以荧光标志物，通过连接带负电的多阴离子复合物，吸附到带正电的的纤维表面，经过一系列彻底清洗等步骤后，测定荧光强度变化率，计算GHb浓度。杭州丽珠医疗器械有限公司代理韩国艾可美 糖化血红蛋白检测试剂盒。
（3）胶乳凝集法：利用抗原抗体反应直接测定总lib中HbAlc的百分含量的方法。样品中总Hb和GHb与胶乳有相同的非特异性吸附而固相化，当加入HbAlc的特异性单克隆抗体后形成胶乳一GHb.鼠抗人GHb单克隆抗体的复合物，此复合物由于羊抗鼠抗体而形成凝集，凝集量因胶乳表面固相化的GHb量的不同而不同。通过测定其吸光度并与GHb百分浓度的标准曲线比较后即可求出样品中GHb所占Hb的百分含量。免疫法测定糖化血红蛋白其准确性和重复性均有欠缺，测定受高浓度葡萄糖、高三酰甘油、高胆红素等物质的干扰，由于样本的浊度会使光度计测定产生错误。另外，抗体由动物免疫获得，成本高且筛选周期长，批与批之间存在差异;抗体对温度湿度敏感，易变性难保存等缺点。该类试剂以北京莱帮生物技术有限公司（德国莱帮）北京九强生物技术有限公司（英国朗道公司）
2.3亲和层析法[6]：
该试剂盒包含多孔性滤膜装置，含试剂的试管和洗涤溶液。试剂能溶解红细胞并特异性沉淀血红蛋白因子，其中蓝色的硼酸缀合物能和糖化血红蛋白上的Cis-diols相结合。血液加入试剂中，红细胞立即溶解，使全部的血红蛋白都沉淀，硼酸缀合物就和GHb中的cis-diol结构相结合。血液和试剂混合后加入滤膜装置，所有沉淀的血红蛋白，不管是和缀合物结合的或未结合的都保留在滤膜的顶部。过量的显色缀合物就被洗涤液洗掉。通过金标定量仪测定蓝色（糖化血红蛋白）和红色（总血红蛋白）的强度，可以计算样品中的GHb的百分比。主要生产厂家包括美国Bio-Rad、Primus、日本TOSOH、英國DREWSCIENTIFIC、德国SIEMENS公司，挪威小旋风Nycocard Reader II等等。 3.应用SELEX技术筛选糖化血红蛋白适配子
核酸适体探针开发的第一步是通过SELEX方法筛选到与靶分子特异并紧密结合的核酸适体。通过筛选的糖化血红蛋白核酸适体探针用于直接检测混合生物样品中的靶分子，核酸适体的特异性将是检测系统的关键[7]。SELEX筛选过程采用引入负筛选步骤，即先将随机寡核苷酸文库与靶分子相似的分子或不含靶分子的样品混合，除去非特异结合的核酸适体。然后再把处理过的随机寡核苷酸文库与靶分子混合进行SELEX筛选，从而保证与靶分子结合的核酸适体的特异性。通过引入带有额外化学修饰基团的核苷酸，如benzylaminocarbonyl-dUTP（BndUTP）等，增加核酸适体与靶分子相互作用的位点，使核酸适体与靶分子的亲和力达到nM 甚至 pM 水平。不与靶分子结合时，核酸适体处于比较松散的结构，5' 和3' 两端相互游离。与靶分子结合时，靶分子诱导核酸适体结构发生改变，核酸适体的5' 端和3' 端都将参与与靶分子特定区域（类似于与康体结合的抗原位点）的相互作用，导致5' 和3' 两端相互靠近（见图1）。
这一特点使核酸适体成为分子信标探针设计和开发的热点。选用激发态二聚体核酸适体分子信标技术，是因为芘激发态二聚体不仅荧光强度高，而且荧光寿命比生物样品中的非特异激发荧光的寿命长，检测时可以在非特异激发荧光消失后，再来收集激发态二聚体的荧光信号，大大提高检测的特异性和灵敏度（见图2）。
4 结论
该文从糖化血红蛋白的常见检测方法及优缺点对比进行分析与总结，并通过相关研究发现，提出了应用SELEX技术筛选糖化血红蛋白适配子来检测糖化血红蛋白的论点[8]。本文进一步提出，利用适配子探针标记技术，能够提高血红蛋白读取率，克服目前市场糖化血红蛋白检测中的弊端。该方法一经推广，可以广泛应用于糖尿病健康定量筛查、糖尿病血糖控制快速监测，并取代目前的血糖监测法，为广大糖尿病患者提供更准确有效的血糖监测指数，同时为医生调整用药提供辅助资料。
该文基于血红蛋白检测方法与实践应用，从多方面分析、思考与总结，为科研工作者和医院相关人员提供详实、可靠的参考资料，同时又提出更新的血红蛋白检测解决方案，为科研实践提供了参考意义。
参考文献
[1] Wenying Y，M.D.，Juming Lu，M.D.，Jiangping Weng，M.D.，etc. Prevalence of Diabetes among Men and Women in China[J].The New England journal of Medicine.2010.362（12）：1090-1101.
[2] 边卫，王成. 糖化血红蛋白用于筛查糖尿病的意义分析 [J].中国社区医师，2019（2）：132-135.
[3] American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes-2010[J]. Diabetes Care，2010，33（Suppl 1）：S11-S61.
[4] 陈斌，黄庆，府伟灵.离子交换层微柱法及电泳法与液相色谱分析法对糖化血红蛋白含量测定的比较.第三军医大学学报，2001，23（9）：1124-25.
[5] 黄宗利，甘志荣，兰万. 糖化血红蛋白的检测方法 [J]. 分析化學进展，2017（7）：163-170.
[6] 吴菲. 糖化血红蛋白检测的影响因素 [J]. 世界最新医学信息文摘，2016（8）：162-164.
[7] 黄奔.糖化血红蛋白检测与临床应用新进展 [J]. 临床检验杂志，2018（1）：168-170.
[8] 刘仲栋，李丽艳. 糖化血红蛋白在糖尿病中的临床应用价值 [J]. 医学理论与实践，2018（7）：2086-2088.
作者简介：徐菁（1980-），女，湖北武汉人，硕士研究生，讲师，主要研究方向为药物分析、适配子筛选技术研究。
通讯作者：孙平（1979-），男，湖北黄冈人，硕士研究生，实验室主任，主要研究方向为实验室安全管理、生物安全管理。
糖尿病是危害人类健康的世界性公共卫生问题，糖尿病是一种终生性疾病，其并发症是至残至死的主要原因，所以人们希望能尽早发现和治疗糖尿病。2007年～2008年，中华医学会糖尿病学分会在我国选择经济发展水平不同的14个省市，对糖尿病进行了流行病学调查。该调查发现，我国糖尿病患病率的增长速度令人震惊[1]。2002年，在全国营养状况调查过程中进行的糖尿病流行病学调查表明，我国城市糖尿病患病率为4.5%，农村为1.8%，推算全国有病人2000多万。而时隔6年，我国20岁以上人群的糖尿病患病率已达9.7%，推算病人约为9200万人;糖尿病前期患病率达15.5%，推算处于糖尿病前期者约1.48亿人，这意味着我国糖尿病“后备军”人群庞大。目前糖尿病的快速检测以血糖检测数据为主，但是该项检查主要是体现被检者临时血糖数据，如需确诊还要重复两至三次检查或者进行糖耐量测试，这对大部分糖尿病前期患者很难通过及时体检发现糖尿病前兆，从而能够在患病前采取干预治疗，提高患者健康指数。
1 糖化血红蛋白检测的意义
传统的糖尿病诊断和治疗监测采用空腹血糖、餐后血糖和口服葡萄糖耐量试验等，但是血糖参数仅代表抽血时的瞬间血糖水平，而糖化血红蛋白（GHb）作为反映长期血糖水平的金标准，也是监测糖尿病治疗的重要指标。GHb是红细胞中血红蛋白与葡萄糖缓慢、持续且不可逆地进行非酶促蛋白糖化反应的产物，形成两周后不易分开。当血液中葡萄糖浓度较高时，人体所形成的GHb含量也会相对较高[2]。正常生理条件下，非酶促糖化反应产物的生成量与反应物的浓度成正比。由于蛋白质浓度保持相对稳定，糖化水平主要决定于葡萄糖浓度，也与蛋白质与葡萄糖接触的时间长短有关。GHb可以反映最近2—3个月的平均血糖水平。2002年美国糖尿病协会已明确规定应定期检测GHb，并将其作为监测糖尿病血糖控制的金标。普及糖尿病知识，更新治疗理念，监测并保持GHb达标，更早、更合理地使用胰岛素等药物治疗，对于控制糖尿病并发症的发生发展尤为重要[3]。
2 糖化血红蛋白检测常规方法与优缺点
目前临床上常用的糖化血红蛋白的检测方法有以下几种：
2.1高压液相方法（HPLC）[4]
全自动分离测定GHb及血蛋白的变异体和亚型，但仪器的操作保养要求较高，CV值1%以内，以北京执信医疗公司的HLC-723 G7为代表。但由于此方法所使用的仪器昂贵，难以在比较基层的医院和实验室普及;微柱法手工操作步骤繁琐，层析时间和微柱的质量不易控制，易产生操作技术误差，重复性欠佳;而且干扰因素很多，尤其对pH值和温度的变化敏感，HbF及变异血红蛋白（HbS、HbC、HbE等）对结果干扰，干扰程度根据柱的分离能力而定，所以一定要仔细观察图谱。市场主流：高端HPLC方法学是日本TOSOH的G7，美国伯乐的DS5，价格在20万上下，中档为西门子拜耳的DCA Vantage，价格约在10万以下，低端和普及型的是挪威小旋风价格3.6万。
2.2 免疫方法[5]
（1）比浊法：利用抗原、抗体反应的原理进行测定。GHb的B链N末端提供了一个容易被抗体识别的抗原表位，用单克隆抗体特异识别GHb的B链N末端最后4～6个氨基酸组成的抗原表位，结合比浊法。
（2）离子捕获法：应用抗原抗体反应原理，并联以荧光标志物，通过连接带负电的多阴离子复合物，吸附到带正电的的纤维表面，经过一系列彻底清洗等步骤后，测定荧光强度变化率，计算GHb浓度。杭州丽珠医疗器械有限公司代理韩国艾可美 糖化血红蛋白检测试剂盒。
（3）胶乳凝集法：利用抗原抗体反应直接测定总lib中HbAlc的百分含量的方法。样品中总Hb和GHb与胶乳有相同的非特异性吸附而固相化，当加入HbAlc的特异性单克隆抗体后形成胶乳一GHb.鼠抗人GHb单克隆抗体的复合物，此复合物由于羊抗鼠抗体而形成凝集，凝集量因胶乳表面固相化的GHb量的不同而不同。通过测定其吸光度并与GHb百分浓度的标准曲线比较后即可求出样品中GHb所占Hb的百分含量。免疫法测定糖化血红蛋白其准确性和重复性均有欠缺，测定受高浓度葡萄糖、高三酰甘油、高胆红素等物质的干扰，由于样本的浊度会使光度计测定产生错误。另外，抗体由动物免疫获得，成本高且筛选周期长，批与批之间存在差异;抗体对温度湿度敏感，易变性难保存等缺点。该类试剂以北京莱帮生物技术有限公司（德国莱帮）北京九强生物技术有限公司（英国朗道公司）
2.3亲和层析法[6]：
该试剂盒包含多孔性滤膜装置，含试剂的试管和洗涤溶液。试剂能溶解红细胞并特异性沉淀血红蛋白因子，其中蓝色的硼酸缀合物能和糖化血红蛋白上的Cis-diols相结合。血液加入试剂中，红细胞立即溶解，使全部的血红蛋白都沉淀，硼酸缀合物就和GHb中的cis-diol结构相结合。血液和试剂混合后加入滤膜装置，所有沉淀的血红蛋白，不管是和缀合物结合的或未结合的都保留在滤膜的顶部。过量的显色缀合物就被洗涤液洗掉。通过金标定量仪测定蓝色（糖化血红蛋白）和红色（总血红蛋白）的强度，可以计算样品中的GHb的百分比。主要生产厂家包括美国Bio-Rad、Primus、日本TOSOH、英國DREWSCIENTIFIC、德国SIEMENS公司，挪威小旋风Nycocard Reader II等等。 3.应用SELEX技术筛选糖化血红蛋白适配子
核酸适体探针开发的第一步是通过SELEX方法筛选到与靶分子特异并紧密结合的核酸适体。通过筛选的糖化血红蛋白核酸适体探针用于直接检测混合生物样品中的靶分子，核酸适体的特异性将是检测系统的关键[7]。SELEX筛选过程采用引入负筛选步骤，即先将随机寡核苷酸文库与靶分子相似的分子或不含靶分子的样品混合，除去非特异结合的核酸适体。然后再把处理过的随机寡核苷酸文库与靶分子混合进行SELEX筛选，从而保证与靶分子结合的核酸适体的特异性。通过引入带有额外化学修饰基团的核苷酸，如benzylaminocarbonyl-dUTP（BndUTP）等，增加核酸适体与靶分子相互作用的位点，使核酸适体与靶分子的亲和力达到nM 甚至 pM 水平。不与靶分子结合时，核酸适体处于比较松散的结构，5' 和3' 两端相互游离。与靶分子结合时，靶分子诱导核酸适体结构发生改变，核酸适体的5' 端和3' 端都将参与与靶分子特定区域（类似于与康体结合的抗原位点）的相互作用，导致5' 和3' 两端相互靠近（见图1）。
这一特点使核酸适体成为分子信标探针设计和开发的热点。选用激发态二聚体核酸适体分子信标技术，是因为芘激发态二聚体不仅荧光强度高，而且荧光寿命比生物样品中的非特异激发荧光的寿命长，检测时可以在非特异激发荧光消失后，再来收集激发态二聚体的荧光信号，大大提高检测的特异性和灵敏度（见图2）。
4 结论
该文从糖化血红蛋白的常见检测方法及优缺点对比进行分析与总结，并通过相关研究发现，提出了应用SELEX技术筛选糖化血红蛋白适配子来检测糖化血红蛋白的论点[8]。本文进一步提出，利用适配子探针标记技术，能够提高血红蛋白读取率，克服目前市场糖化血红蛋白检测中的弊端。该方法一经推广，可以广泛应用于糖尿病健康定量筛查、糖尿病血糖控制快速监测，并取代目前的血糖监测法，为广大糖尿病患者提供更准确有效的血糖监测指数，同时为医生调整用药提供辅助资料。
该文基于血红蛋白检测方法与实践应用，从多方面分析、思考与总结，为科研工作者和医院相关人员提供详实、可靠的参考资料，同时又提出更新的血红蛋白检测解决方案，为科研实践提供了参考意义。
参考文献
[1] Wenying Y，M.D.，Juming Lu，M.D.，Jiangping Weng，M.D.，etc. Prevalence of Diabetes among Men and Women in China[J].The New England journal of Medicine.2010.362（12）：1090-1101.
[2] 边卫，王成. 糖化血红蛋白用于筛查糖尿病的意义分析 [J].中国社区医师，2019（2）：132-135.
[3] American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes-2010[J]. Diabetes Care，2010，33（Suppl 1）：S11-S61.
[4] 陈斌，黄庆，府伟灵.离子交换层微柱法及电泳法与液相色谱分析法对糖化血红蛋白含量测定的比较.第三军医大学学报，2001，23（9）：1124-25.
[5] 黄宗利，甘志荣，兰万. 糖化血红蛋白的检测方法 [J]. 分析化學进展，2017（7）：163-170.
[6] 吴菲. 糖化血红蛋白检测的影响因素 [J]. 世界最新医学信息文摘，2016（8）：162-164.
[7] 黄奔.糖化血红蛋白检测与临床应用新进展 [J]. 临床检验杂志，2018（1）：168-170.
[8] 刘仲栋，李丽艳. 糖化血红蛋白在糖尿病中的临床应用价值 [J]. 医学理论与实践，2018（7）：2086-2088.
作者简介：徐菁（1980-），女，湖北武汉人，硕士研究生，讲师，主要研究方向为药物分析、适配子筛选技术研究。
通讯作者：孙平（1979-），男，湖北黄冈人，硕士研究生，实验室主任，主要研究方向为实验室安全管理、生物安全管理。