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摘要 为选育纳豆激酶（Nattokinase，NK）高活性菌株，从4种不同风味食品中分离得到26株菌株，通过酪蛋白平板初筛和液体发酵复筛，得到2株纳豆激酶高产菌株，利用分子生物学技术鉴定为2株枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ）。采用氯化锂-紫外与亚硝基胍（NTG）复合诱变的方式，最终获得1株纳豆激酶活性达到2 338.01 U/mL的高产菌株SD3-3-6，该突变菌株纳豆激酶酶活相较于初始菌株SD3提高了1.93倍，是1株具有应用前景的高产菌株。
关键词 纳豆;纳豆激酶;多肽;复合诱变;芽孢杆菌
中图分类号 Q 936.96 文献标识码 A 文章編号 0517-6611（2021）15-0159-03
Abstract In order to select nattokinase high activity strains， 26 strains were isolated from four different samples. Two nattokinase highyield strains were screened through primary screening and rescreening， and identified as two Bacillus subtilis strains by molecular biology technology. A highyield strain SD336 with nattokinase activity of 2 338.01 U/mL was obtained by lithium chloride UV and NTG compound mutagenesis. The final activity of nattokinase of SD336 was 1.93 times higher than that of the original strain SD3.
Key words Natto;Nattokinase;Polypeptide;Mutagenesis; Bacillus subtilis
基金项目 河南省科技攻关项目（212102310541）;河南省科学院科研项目（190305003、18JK16012）。
作者简介 巩涛（1982—），男，山东临沂人，助理研究员，博士，从事农业微生物学研究。
收稿日期 2021-01-03
纳豆激酶（natto kinase，NK）是纳豆在发酵过程中由枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ）产生的一种具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶[1]。大量研究结果显示，纳豆发酵过程中，不仅生成大量的短肽、多肽等具有特殊生理功能的生物活性肽，还能产生具有强溶栓功能的纳豆激酶，可以被开发为功能性食品、营养食品和天然药物等，具有广泛的应用前景[2-5]。纳豆激酶作为一种潜在的溶栓药物，与目前临床使用的链激酶、尿激酶等溶栓药物相比，除具有更好的安全性等诸多优点外，成本也更加低廉[6-10]。然而，目前国内筛选到的纳豆激酶菌种的产酶活性和国外相比还存在较大差距，国内报道的多数为500～3 200 U/mL[11-15]，如何分离与选育出纳豆激酶高活性菌种是亟需解决的问题。
笔者从4种纳豆与豆豉食品中分离得到了26株产纳豆激酶的菌株，对2株酶活较高的菌株通过氯化锂-紫外与NTG复合诱变的方法实施多次诱变，最终得到纳豆激酶酶活较高的高产菌株，旨在为纳豆激酶的生产奠定良好基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌株来源。
分别从购于日本的山大纳豆、滨莉纳豆，中国的惟一斋八宝豆豉、永川豆豉中分离。
1.1.2 培养基。
酪蛋白初筛培养基[16]：酪蛋白5 g/L，葡萄糖1 g/L，酵母提取物1 g/L，K2HPO4 1 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，MgSO4 0.1 g/L，琼脂15 g/L，pH 7.0～7.5。
LB培养基：蛋白胨5 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L。
液体发酵培养基：蛋白胨25 g/L，葡萄糖20 g/L，MgSO4 0.5 g/L，CaCl2 0.2 g/L，K2HPO4 2 g/L，KH2PO4 1 g/L。以上培养基于121 ℃灭菌20 min，备用。
1.1.3 主要试剂。
尿激酶、纤维蛋白原（血）、凝血酶，均购自中国药品生物制品检定所，亚硝基胍（北京华越洋生物科技有限公司产品，中国），其他试剂均为国产分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 纳豆激酶产生菌株的分离与初筛。
根据文献[17]的方法稍作修改，取5 g样品用灭菌研钵磨碎，加入20 mL无菌生理盐水混匀，85 ℃水浴10 min杀死营养体及杂菌，5 000 r/min 离心10 min，取上清。将上清进行10倍梯度稀释，吸取适当稀释后的样品0.2 mL涂布酪蛋白平板，37 ℃培养24 h，选择透明圈较大的菌落作为初筛菌株。
1.2.2 液体发酵复筛。
将初筛菌株的种子液以5%接种量接种于LB液体培养基中，37 ℃ 180 r/min振荡培养72 h，5 000 r/min离心10 min，取适当稀释后的上清液10 μL于琼脂糖-纤维蛋白平板，室温下放置3～5 h，测量比较溶纤圈直径，选择纳豆激酶酶活较高的菌株，作为诱变育种的出发菌株。
1.2.3 生长曲线绘制。 将待诱变菌株以5%接种量分别接种到装有LB液体培养基的三角瓶中，37 ℃，200 r/min摇瓶培养，每隔2 h取样1次，在OD600下测定吸光值。以菌体生长时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制菌株生长曲线图。
1.2.4 氯化锂-紫外复合诱变。
根据文献[18]描述略做修改，将菌株接种于含有0.8%氯化锂的LB培养基，37 ℃200 r/min 培养至对数生长期，5 000 r/min离心10 min，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体细胞并稀释为10-8 CFU/mL的菌悬液，取制备好的菌悬液10 mL于无菌9 cm培养皿中，置于距20 W紫外灯30 cm处的磁力搅拌器上，开启磁力搅拌器，分别照射30、60、90、120、150、180 s，將诱变后的菌悬液移入无菌试管中，避光冰浴1 h，冰浴后的菌液适当稀释，取200 μL涂布酪蛋白平板，37 ℃培养24 h，选取透明圈较大的菌落进行液体发酵复筛。
1.2.5 亚硝基胍（NTG）诱变。
将氯化锂-紫外复合诱变处理之后的高活性菌株接入LB培养基培养至对数生长期，用灭菌的0.1 mol/L、pH 7.0磷酸钠盐缓冲液（PBS）制备10-8 CFU /mL的菌悬液，加入用上述PBS配制的亚硝基胍（NTG）溶液，制作终浓度0.1～1.0 mg/mL的诱变液，于37 ℃摇床中振荡处理20 h，5 000 r/min离心10 min，弃上清液，用缓冲液洗涤3次，适当稀释涂于酪蛋白平板，37 ℃培养24 h，选取透明圈较大的菌落进行液体发酵复筛[19]。
1.2.6 致死率的测定。
将未经诱变处理的菌液（A）与诱变处理的菌液（B）适当等量稀释后，涂布于酪蛋白平板上计算菌落数。取致死率为60%～90%的组别进行下一步试验[20]。致死率的计算公式如下：
致死率（%）=（ A-B）/A×100
1.2.7 高活性菌株遗传稳定性验证。
对经诱变处理之后筛选到的高性菌株进行传代试验，连续传8代，每次传代后的菌株经液体发酵，测量比较溶纤圈直径，筛选纳豆激酶酶活高的菌株。
1.2.8 高活性菌株的鉴定。
按细菌DNA提取试剂盒（Omega）操作手册提取基因组DNA，用细菌16S rDNA通用引物27F和1492R进行PCR扩增16S rDNA基因序列[21]。将PCR产物送华大基因进行测序。将测序序列进行BLAST同源性对比分析，运用Mega 7.0构建系统发育树，确定所选菌株种属[22]。
2 结果与分析
2.1 纳豆激酶高活性菌株的初筛与复筛
通过酪蛋白平板初步筛选出了26株长势良好且透明圈明显的菌落。经过琼脂糖-纤维蛋白原平板对26株菌进行复筛，最终得到5株具有较大透明圈的菌株（表1），按照“1.2.8”进行了菌株的鉴定，综合考虑选择菌株SD3与WYZ14作为诱变育种出发菌株。
2.2 SD3、WYZ14生长曲线绘制
菌株SD3、WYZ14生长曲线（图1）显示，接种后4 h菌株SD3、WYZ14进入对数生长期，4～18 h是菌株的对数生长期，20 h后菌体进入稳定期。加入氯化锂的菌体生长稍延后。由于对数生长期的细胞处理，菌体活力旺盛，突变率高，重现性好，故后续试验选择培养16 h的菌体进行诱变处理。
2.3 氯化锂-紫外复合诱变筛选结果
文献报道，一般选择致死率为70%～80%的剂量，诱变效果较好。从图2可见，当处理时间为120 s时，SD3与WYZ14致死率分别达到76.5%与78.2%。因此，氯化锂-紫外复合试验选择120 s作为最佳诱变剂量。
通过对氯化锂-紫外复合诱变，筛选出22株透明圈与菌落直径比值较CK有所增大的菌株，每出发菌株选择1株酶活最高的诱变菌株分别进行摇瓶发酵，传代培养后对酶活进行测定，测定结果见表2。表2显示，诱变菌株SD3-3液体发酵液纳豆激酶酶活较出发菌株提高了40.3%，为摇瓶发酵酶活最高的菌株，选用菌株SD3-3进行NTG 诱变育种。
2.4 NTG诱变筛选结果
由图3可见，随着诱变剂量的增加与处理时间的延长，菌株致死率不断增大。低剂量时，诱变效果不佳，高剂量会影响菌落再生。综合考虑致死率与正突变范围后，选择NTG 浓度0.4 mg/mL，处理时间20 min 进行诱变筛选。
通过NTG诱变筛选得到10株高产菌株，结果见图4，菌株SD3-3-2、SD3-3-6、SD3-3-8与SD3-3-10的酶活较高，比出发菌株SD3-3分别提高42.3%、39.5%、47.4%与385%。
2.5 高产菌株的遗传稳定性
将诱变高产菌株进行传代试验，结果见图5，菌株SD3-3-4、SD3-3-6与SD3-3-9传代8次遗传稳定性仍然较好，其他菌株从第3代开始就回落，传代6次以上菌株的高产特性基本消失。高产菌株SD3-3-6不仅遗传稳定，且酶活较高，传代8次后，酶活稳定在2 327.18 U/mL，是1株具备生产潜力的高产菌株。
3 结论
紫外与亚硝基胍诱变技术是传统诱变育种技术，具有快速、安全、有效、操作简便、正突变率高等优点，已被广泛用于微生物诱变育种[23-24]。采用多种诱变剂交替的复合诱变通常比单一诱变剂处理能取得更好的结果，如彭钰媛等[25]选用NTG 和紫外处理蜡样芽孢杆菌（ Bacillus cereus ）获得了解钾能力提高了63.64%的诱变菌株。钱娟娟等[26]利用ARTP-亚硝基胍（NTG）复合诱变方法对中性蛋白酶出发菌株进行复合诱变，选育出1株酶活较出发菌株提高90%左右的高产菌株。
笔者通过对SD3菌株进行氯化锂-紫外和NTG复合诱变，酪蛋白平板初筛，液态发酵复筛，从大量突变株中筛选到1株稳定、高产纳豆激酶的突变菌株SD3-3-6，其产酶能力从最初的1 203.56 U/mL提高到2 327.18 U/mL，提高了193倍。连续培养8代均维持较高的酶活水平，说明该突变菌株遗传性稳定，是1株具有应用前景的高产菌株，同时也说明氯化锂-紫外和NTG复合诱变是一种针对纳豆激酶产生菌株有效的诱变技术。 参考文献
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关键词 纳豆;纳豆激酶;多肽;复合诱变;芽孢杆菌
中图分类号 Q 936.96 文献标识码 A 文章編号 0517-6611（2021）15-0159-03
Abstract In order to select nattokinase high activity strains， 26 strains were isolated from four different samples. Two nattokinase highyield strains were screened through primary screening and rescreening， and identified as two Bacillus subtilis strains by molecular biology technology. A highyield strain SD336 with nattokinase activity of 2 338.01 U/mL was obtained by lithium chloride UV and NTG compound mutagenesis. The final activity of nattokinase of SD336 was 1.93 times higher than that of the original strain SD3.
Key words Natto;Nattokinase;Polypeptide;Mutagenesis; Bacillus subtilis
基金项目 河南省科技攻关项目（212102310541）;河南省科学院科研项目（190305003、18JK16012）。
作者简介 巩涛（1982—），男，山东临沂人，助理研究员，博士，从事农业微生物学研究。
收稿日期 2021-01-03
纳豆激酶（natto kinase，NK）是纳豆在发酵过程中由枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ）产生的一种具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶[1]。大量研究结果显示，纳豆发酵过程中，不仅生成大量的短肽、多肽等具有特殊生理功能的生物活性肽，还能产生具有强溶栓功能的纳豆激酶，可以被开发为功能性食品、营养食品和天然药物等，具有广泛的应用前景[2-5]。纳豆激酶作为一种潜在的溶栓药物，与目前临床使用的链激酶、尿激酶等溶栓药物相比，除具有更好的安全性等诸多优点外，成本也更加低廉[6-10]。然而，目前国内筛选到的纳豆激酶菌种的产酶活性和国外相比还存在较大差距，国内报道的多数为500～3 200 U/mL[11-15]，如何分离与选育出纳豆激酶高活性菌种是亟需解决的问题。
笔者从4种纳豆与豆豉食品中分离得到了26株产纳豆激酶的菌株，对2株酶活较高的菌株通过氯化锂-紫外与NTG复合诱变的方法实施多次诱变，最终得到纳豆激酶酶活较高的高产菌株，旨在为纳豆激酶的生产奠定良好基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌株来源。
分别从购于日本的山大纳豆、滨莉纳豆，中国的惟一斋八宝豆豉、永川豆豉中分离。
1.1.2 培养基。
酪蛋白初筛培养基[16]：酪蛋白5 g/L，葡萄糖1 g/L，酵母提取物1 g/L，K2HPO4 1 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，MgSO4 0.1 g/L，琼脂15 g/L，pH 7.0～7.5。
LB培养基：蛋白胨5 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L。
液体发酵培养基：蛋白胨25 g/L，葡萄糖20 g/L，MgSO4 0.5 g/L，CaCl2 0.2 g/L，K2HPO4 2 g/L，KH2PO4 1 g/L。以上培养基于121 ℃灭菌20 min，备用。
1.1.3 主要试剂。
尿激酶、纤维蛋白原（血）、凝血酶，均购自中国药品生物制品检定所，亚硝基胍（北京华越洋生物科技有限公司产品，中国），其他试剂均为国产分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 纳豆激酶产生菌株的分离与初筛。
根据文献[17]的方法稍作修改，取5 g样品用灭菌研钵磨碎，加入20 mL无菌生理盐水混匀，85 ℃水浴10 min杀死营养体及杂菌，5 000 r/min 离心10 min，取上清。将上清进行10倍梯度稀释，吸取适当稀释后的样品0.2 mL涂布酪蛋白平板，37 ℃培养24 h，选择透明圈较大的菌落作为初筛菌株。
1.2.2 液体发酵复筛。
将初筛菌株的种子液以5%接种量接种于LB液体培养基中，37 ℃ 180 r/min振荡培养72 h，5 000 r/min离心10 min，取适当稀释后的上清液10 μL于琼脂糖-纤维蛋白平板，室温下放置3～5 h，测量比较溶纤圈直径，选择纳豆激酶酶活较高的菌株，作为诱变育种的出发菌株。
1.2.3 生长曲线绘制。 将待诱变菌株以5%接种量分别接种到装有LB液体培养基的三角瓶中，37 ℃，200 r/min摇瓶培养，每隔2 h取样1次，在OD600下测定吸光值。以菌体生长时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制菌株生长曲线图。
1.2.4 氯化锂-紫外复合诱变。
根据文献[18]描述略做修改，将菌株接种于含有0.8%氯化锂的LB培养基，37 ℃200 r/min 培养至对数生长期，5 000 r/min离心10 min，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体细胞并稀释为10-8 CFU/mL的菌悬液，取制备好的菌悬液10 mL于无菌9 cm培养皿中，置于距20 W紫外灯30 cm处的磁力搅拌器上，开启磁力搅拌器，分别照射30、60、90、120、150、180 s，將诱变后的菌悬液移入无菌试管中，避光冰浴1 h，冰浴后的菌液适当稀释，取200 μL涂布酪蛋白平板，37 ℃培养24 h，选取透明圈较大的菌落进行液体发酵复筛。
1.2.5 亚硝基胍（NTG）诱变。
将氯化锂-紫外复合诱变处理之后的高活性菌株接入LB培养基培养至对数生长期，用灭菌的0.1 mol/L、pH 7.0磷酸钠盐缓冲液（PBS）制备10-8 CFU /mL的菌悬液，加入用上述PBS配制的亚硝基胍（NTG）溶液，制作终浓度0.1～1.0 mg/mL的诱变液，于37 ℃摇床中振荡处理20 h，5 000 r/min离心10 min，弃上清液，用缓冲液洗涤3次，适当稀释涂于酪蛋白平板，37 ℃培养24 h，选取透明圈较大的菌落进行液体发酵复筛[19]。
1.2.6 致死率的测定。
将未经诱变处理的菌液（A）与诱变处理的菌液（B）适当等量稀释后，涂布于酪蛋白平板上计算菌落数。取致死率为60%～90%的组别进行下一步试验[20]。致死率的计算公式如下：
致死率（%）=（ A-B）/A×100
1.2.7 高活性菌株遗传稳定性验证。
对经诱变处理之后筛选到的高性菌株进行传代试验，连续传8代，每次传代后的菌株经液体发酵，测量比较溶纤圈直径，筛选纳豆激酶酶活高的菌株。
1.2.8 高活性菌株的鉴定。
按细菌DNA提取试剂盒（Omega）操作手册提取基因组DNA，用细菌16S rDNA通用引物27F和1492R进行PCR扩增16S rDNA基因序列[21]。将PCR产物送华大基因进行测序。将测序序列进行BLAST同源性对比分析，运用Mega 7.0构建系统发育树，确定所选菌株种属[22]。
2 结果与分析
2.1 纳豆激酶高活性菌株的初筛与复筛
通过酪蛋白平板初步筛选出了26株长势良好且透明圈明显的菌落。经过琼脂糖-纤维蛋白原平板对26株菌进行复筛，最终得到5株具有较大透明圈的菌株（表1），按照“1.2.8”进行了菌株的鉴定，综合考虑选择菌株SD3与WYZ14作为诱变育种出发菌株。
2.2 SD3、WYZ14生长曲线绘制
菌株SD3、WYZ14生长曲线（图1）显示，接种后4 h菌株SD3、WYZ14进入对数生长期，4～18 h是菌株的对数生长期，20 h后菌体进入稳定期。加入氯化锂的菌体生长稍延后。由于对数生长期的细胞处理，菌体活力旺盛，突变率高，重现性好，故后续试验选择培养16 h的菌体进行诱变处理。
2.3 氯化锂-紫外复合诱变筛选结果
文献报道，一般选择致死率为70%～80%的剂量，诱变效果较好。从图2可见，当处理时间为120 s时，SD3与WYZ14致死率分别达到76.5%与78.2%。因此，氯化锂-紫外复合试验选择120 s作为最佳诱变剂量。
通过对氯化锂-紫外复合诱变，筛选出22株透明圈与菌落直径比值较CK有所增大的菌株，每出发菌株选择1株酶活最高的诱变菌株分别进行摇瓶发酵，传代培养后对酶活进行测定，测定结果见表2。表2显示，诱变菌株SD3-3液体发酵液纳豆激酶酶活较出发菌株提高了40.3%，为摇瓶发酵酶活最高的菌株，选用菌株SD3-3进行NTG 诱变育种。
2.4 NTG诱变筛选结果
由图3可见，随着诱变剂量的增加与处理时间的延长，菌株致死率不断增大。低剂量时，诱变效果不佳，高剂量会影响菌落再生。综合考虑致死率与正突变范围后，选择NTG 浓度0.4 mg/mL，处理时间20 min 进行诱变筛选。
通过NTG诱变筛选得到10株高产菌株，结果见图4，菌株SD3-3-2、SD3-3-6、SD3-3-8与SD3-3-10的酶活较高，比出发菌株SD3-3分别提高42.3%、39.5%、47.4%与385%。
2.5 高产菌株的遗传稳定性
将诱变高产菌株进行传代试验，结果见图5，菌株SD3-3-4、SD3-3-6与SD3-3-9传代8次遗传稳定性仍然较好，其他菌株从第3代开始就回落，传代6次以上菌株的高产特性基本消失。高产菌株SD3-3-6不仅遗传稳定，且酶活较高，传代8次后，酶活稳定在2 327.18 U/mL，是1株具备生产潜力的高产菌株。
3 结论
紫外与亚硝基胍诱变技术是传统诱变育种技术，具有快速、安全、有效、操作简便、正突变率高等优点，已被广泛用于微生物诱变育种[23-24]。采用多种诱变剂交替的复合诱变通常比单一诱变剂处理能取得更好的结果，如彭钰媛等[25]选用NTG 和紫外处理蜡样芽孢杆菌（ Bacillus cereus ）获得了解钾能力提高了63.64%的诱变菌株。钱娟娟等[26]利用ARTP-亚硝基胍（NTG）复合诱变方法对中性蛋白酶出发菌株进行复合诱变，选育出1株酶活较出发菌株提高90%左右的高产菌株。
笔者通过对SD3菌株进行氯化锂-紫外和NTG复合诱变，酪蛋白平板初筛，液态发酵复筛，从大量突变株中筛选到1株稳定、高产纳豆激酶的突变菌株SD3-3-6，其产酶能力从最初的1 203.56 U/mL提高到2 327.18 U/mL，提高了193倍。连续培养8代均维持较高的酶活水平，说明该突变菌株遗传性稳定，是1株具有应用前景的高产菌株，同时也说明氯化锂-紫外和NTG复合诱变是一种针对纳豆激酶产生菌株有效的诱变技术。 参考文献
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