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摘 要：目的：研究 IL-2、IL-12单用及联用对小鼠血清IFN-г水平的影响。方法：①通过建立小鼠肺部曲霉感染模型。将60只已建立免疫功能低下模型的小鼠随机分为A、B、C、D四组，每组15只。A组用IL-2+IL-12治疗；B组用IL-12治疗；C组用IL-2治疗；D组用生理盐水治疗，作为对照组。检测各组小鼠血清г-干扰素(г-IFN)。肺组织菌落计数。结果：①A组、B组、C组、D组小鼠的血清г-干扰素(г-IFN)水平，各组间比较，差异无显著性(P>0.05)；A组、B组、C组、D组各组小鼠肺组织菌落数。IL-2+IL12组与IL-2组、IL-12组比较，差异均有显著性(P<0.05)。生理盐水治疗组与其他组比较，差异有显著性(P<0.05)。结论： IL-2和IL-12联用与否对血清г-干扰素(г-IFN)水平无显著性影响，但IL-2和IL-12联合治疗组较单独使用能减少肺组织的菌落数。
关键词：真菌；白介素12；白介素2；免疫；肺；干扰素-г；一氧化碳
中图分类号：R392.7 文献标识码：A 文章编号：1673-2197(2008)05-011-02
流行病学调查发现，深部真菌感染病例在逐渐增多。真菌感染与机体免疫功能关系密切，一方面深部真菌感染多发生于机体免疫功能低下的患者，另一方面真菌感染可进一步降低机体的免疫，导致感染的进一步加重。
尽管新的抗微生物制剂不断问世，但由于耐药性的问题，或由于药物的毒副作用等诸多因素，抗微生物治疗仍面临重大挑战，有效的宿主保护性免疫在防治感染性疾病方面有着不可替代的作用。目前国内外的研究结果表明：IL-2和IL-12联用具有协同刺激Thl反应，加速病原清除，防止感染慢性化的作用[1]。国内外尚未见将IL-2和IL-12联用于真菌感染的治疗报道。我们采用IL-2和IL-12对肺部真菌感染的小鼠进行了实验研究。
1 材料与方法
1.1 制作实验动物模型所需主要材料
实验所用小鼠为6~8周龄雄性清洁组BALB/c小鼠，购自中山医科大学实验动物中心。烟曲霉菌菌株购自广东省微生物研究所。用于制造感染模型的环磷酰胺购自江苏连云港制药厂，批号：9711182，氢化可的松购自扬州制药厂，批号：980101，苯巴比妥钠购自广东制药厂，批号：980625。
1.2 实验动物治疗药品
白细胞介素2(IL-2)购自北京四环生物工程制品厂，批准文号：(97)卫药准字S-03号。基因重组的白细胞介素12(IL-12)由日本琉球大学医学部赠，效价(2.5×108Roche units/mg)。
1.3 检测试剂
r-干扰素(r-IFN)检测试剂盒购自Diaclone生物公司。
1.4 实验方法
1.4.1 免疫功能低下的小鼠实验模型制作方法
免疫功能低下的小鼠实验模型制作方法是在粒细胞减少的小鼠感染模型制作方法基础上进行的。具体制作方法参照Smith等[2，3]的报道。
1.4.2 治疗方法
将60只已建立免疫功能低下模型的小鼠随机分为A、B、C、D四组，每组15只。A组IL-2+IL-12治疗；B组单用IL-12治疗；C组单用IL-2治疗；D组生理盐水治疗，作为对照组。IL-2的用量为每只小鼠6mg/kg，分两次分别于建立模型后的第二天和第五天腹腔注射。IL-12从建立模型后的第二天开始用药，连续用药5d。IL-2和IL-12的用量参照Kawakami等[4]的报道。
1.4.3 血清r-干扰素(r-IFN)的检测
血清r-干扰素(r-IFN)的检测方法按试剂盒说明书的要求进行。利用SPSS8.0统计软件包求出直线回归方程，将标本的OD值代入直线回归方程，求出各标本的r-干扰素(r-IFN)浓度(pg/ml)。
1.4.4 肺组织菌落计数方法：无菌分离小鼠的肺组织，取一小部分肺组织固定于10%的福尔马林中，以作病理检查。将其余的肺组织称重，置于研钵内用组织匀浆器碾细，筛网过滤，稀释10倍后，取1ml加入培养皿中，再加入一定量的溶化了的沙保氏培养液，培养1d后计数培养皿中的烟曲霉菌菌落数。
1.5 数据统计
采用SPSS8.0统计软件包进行分析，计量资料采用t检测和方差分析。
2 结果
(1)各治疗组小鼠血清IFN-r的测定结果比较(表1，每组6例)
(2)各组小鼠肺组织菌落数(表2，以log形式表示，菌落数/每克肺组织)
3 讨论
IL-12是由B细胞和单核细胞产生的。在感染过程中，它能诱导自然杀伤细胞和T细胞产生干扰素，发生Thl细胞免疫反应。IL-12在Th0细胞分化为Thl细胞过程中发挥中心作用，起着“总开关”的作用。IL-12的抗感染机制通过巨噬细胞等在外来病原体或其产物的作用下，在短时间内产生IFN-r及Thl效应。在免疫缺陷机体中IFN-r可活化巨噬细胞的杀灭微生物机制，限制胞内微生物的增殖[5，6]。一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子a(TNFa)在调节巨噬细胞的吞噬活性方面起着很重要的作用。
r-干扰素(IFN-r)调节效应细胞(如中性粒细胞和巨噬细胞等)功能的分子机制虽不清楚，但许多实验已证实它确实能增强中性粒细胞、巨噬细胞和NK细胞的吞噬、杀菌能力。在真菌感染过程中，r-干扰素能增强中性粒细胞、巨噬细胞和NK细胞对白色念珠菌、组织胞浆菌、曲霉菌、隐球菌等真菌感染的清除。Kawakami等[4]的研究结果表明，IL-12能促进IFN-rmRNA在感染部位的表达，但未检测血清IFN-r水平。本研究发现IL-2和IL-12联合治疗组的血清r-干扰素水平与单用组相比，差异无显著性，与生理盐水组也无差异(p>0.05)。是否IFN-r的作用只与IFN—rmRNA在感染部位的表达有关，而与血清IFN-r水平无关?也可能与采标本的时间有关。本研究的血清标本是在感染结束阶段采样的，故不能观察到血清-干扰素的变化。对此问题有待进一步研究。本研究中观察到，血清r-干扰素与血清一氧化氮的水平不一致，可能与这两种细胞因子的感染过程的不同阶段的分泌量不同有关。r-干扰素一般在感染的早期分泌较多，随后逐渐减少，而一氧化氮则持续产生，有利于机体清除感染病灶[6]。
参考文献：
[1] Cenci E，Mencacci A，Bacci A，et al.T cell vaccination in mice with invasive pulmonary aspergillosis[J].J Immunol，2000，165：381~388.
[2] Ampel NM，kramer LA.In vitro modulation of cytokine production by lymphocytes in human coccidioidomycosis[J].Cell Immunol，2003，221(2)：115~121.
[3] Romano CC，Mendes-Giannini MJ，Duarte AJ，et，al.IL-12 and neutralization of endogenous IL-10 revert the in vitro antigen-specific cellular immunosuppression of paracoccidioidomycosis patients[J].Cytokine，2002，18(3)：149~157.
[4] Kawakami k，Tohyama，M，Xie QF，et al.Interleukin-12 protects mice against pulmonary and disseminated infection caused by cryptococcus neoformans [J].Clin Exp Immunol，1996，104：208~214.
[5] Maffei CM，Mirels LF，Sobel RA，et al.Cytokine and inducible nitric oxide synthase mRNA expression during experimental murine cryptococcal meningoencephalitis[J].Infect Immun，2004，72(4)：2338~2349.
[6] Bocca，AL，Hayashi AG，Pinheiro AB，et al.Treatment of Paracoccidioides brasiliensis-infected mice with a nitric oxide inhibitor prevents the failure of cell-mediated immune response [J].J Immunol，1998，161：3056~3063.
(责任编辑：陈涌涛)
关键词：真菌；白介素12；白介素2；免疫；肺；干扰素-г；一氧化碳
中图分类号：R392.7 文献标识码：A 文章编号：1673-2197(2008)05-011-02
流行病学调查发现，深部真菌感染病例在逐渐增多。真菌感染与机体免疫功能关系密切，一方面深部真菌感染多发生于机体免疫功能低下的患者，另一方面真菌感染可进一步降低机体的免疫，导致感染的进一步加重。
尽管新的抗微生物制剂不断问世，但由于耐药性的问题，或由于药物的毒副作用等诸多因素，抗微生物治疗仍面临重大挑战，有效的宿主保护性免疫在防治感染性疾病方面有着不可替代的作用。目前国内外的研究结果表明：IL-2和IL-12联用具有协同刺激Thl反应，加速病原清除，防止感染慢性化的作用[1]。国内外尚未见将IL-2和IL-12联用于真菌感染的治疗报道。我们采用IL-2和IL-12对肺部真菌感染的小鼠进行了实验研究。
1 材料与方法
1.1 制作实验动物模型所需主要材料
实验所用小鼠为6~8周龄雄性清洁组BALB/c小鼠，购自中山医科大学实验动物中心。烟曲霉菌菌株购自广东省微生物研究所。用于制造感染模型的环磷酰胺购自江苏连云港制药厂，批号：9711182，氢化可的松购自扬州制药厂，批号：980101，苯巴比妥钠购自广东制药厂，批号：980625。
1.2 实验动物治疗药品
白细胞介素2(IL-2)购自北京四环生物工程制品厂，批准文号：(97)卫药准字S-03号。基因重组的白细胞介素12(IL-12)由日本琉球大学医学部赠，效价(2.5×108Roche units/mg)。
1.3 检测试剂
r-干扰素(r-IFN)检测试剂盒购自Diaclone生物公司。
1.4 实验方法
1.4.1 免疫功能低下的小鼠实验模型制作方法
免疫功能低下的小鼠实验模型制作方法是在粒细胞减少的小鼠感染模型制作方法基础上进行的。具体制作方法参照Smith等[2，3]的报道。
1.4.2 治疗方法
将60只已建立免疫功能低下模型的小鼠随机分为A、B、C、D四组，每组15只。A组IL-2+IL-12治疗；B组单用IL-12治疗；C组单用IL-2治疗；D组生理盐水治疗，作为对照组。IL-2的用量为每只小鼠6mg/kg，分两次分别于建立模型后的第二天和第五天腹腔注射。IL-12从建立模型后的第二天开始用药，连续用药5d。IL-2和IL-12的用量参照Kawakami等[4]的报道。
1.4.3 血清r-干扰素(r-IFN)的检测
血清r-干扰素(r-IFN)的检测方法按试剂盒说明书的要求进行。利用SPSS8.0统计软件包求出直线回归方程，将标本的OD值代入直线回归方程，求出各标本的r-干扰素(r-IFN)浓度(pg/ml)。
1.4.4 肺组织菌落计数方法：无菌分离小鼠的肺组织，取一小部分肺组织固定于10%的福尔马林中，以作病理检查。将其余的肺组织称重，置于研钵内用组织匀浆器碾细，筛网过滤，稀释10倍后，取1ml加入培养皿中，再加入一定量的溶化了的沙保氏培养液，培养1d后计数培养皿中的烟曲霉菌菌落数。
1.5 数据统计
采用SPSS8.0统计软件包进行分析，计量资料采用t检测和方差分析。
2 结果
(1)各治疗组小鼠血清IFN-r的测定结果比较(表1，每组6例)
(2)各组小鼠肺组织菌落数(表2，以log形式表示，菌落数/每克肺组织)
3 讨论
IL-12是由B细胞和单核细胞产生的。在感染过程中，它能诱导自然杀伤细胞和T细胞产生干扰素，发生Thl细胞免疫反应。IL-12在Th0细胞分化为Thl细胞过程中发挥中心作用，起着“总开关”的作用。IL-12的抗感染机制通过巨噬细胞等在外来病原体或其产物的作用下，在短时间内产生IFN-r及Thl效应。在免疫缺陷机体中IFN-r可活化巨噬细胞的杀灭微生物机制，限制胞内微生物的增殖[5，6]。一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子a(TNFa)在调节巨噬细胞的吞噬活性方面起着很重要的作用。
r-干扰素(IFN-r)调节效应细胞(如中性粒细胞和巨噬细胞等)功能的分子机制虽不清楚，但许多实验已证实它确实能增强中性粒细胞、巨噬细胞和NK细胞的吞噬、杀菌能力。在真菌感染过程中，r-干扰素能增强中性粒细胞、巨噬细胞和NK细胞对白色念珠菌、组织胞浆菌、曲霉菌、隐球菌等真菌感染的清除。Kawakami等[4]的研究结果表明，IL-12能促进IFN-rmRNA在感染部位的表达，但未检测血清IFN-r水平。本研究发现IL-2和IL-12联合治疗组的血清r-干扰素水平与单用组相比，差异无显著性，与生理盐水组也无差异(p>0.05)。是否IFN-r的作用只与IFN—rmRNA在感染部位的表达有关，而与血清IFN-r水平无关?也可能与采标本的时间有关。本研究的血清标本是在感染结束阶段采样的，故不能观察到血清-干扰素的变化。对此问题有待进一步研究。本研究中观察到，血清r-干扰素与血清一氧化氮的水平不一致，可能与这两种细胞因子的感染过程的不同阶段的分泌量不同有关。r-干扰素一般在感染的早期分泌较多，随后逐渐减少，而一氧化氮则持续产生，有利于机体清除感染病灶[6]。
参考文献：
[1] Cenci E，Mencacci A，Bacci A，et al.T cell vaccination in mice with invasive pulmonary aspergillosis[J].J Immunol，2000，165：381~388.
[2] Ampel NM，kramer LA.In vitro modulation of cytokine production by lymphocytes in human coccidioidomycosis[J].Cell Immunol，2003，221(2)：115~121.
[3] Romano CC，Mendes-Giannini MJ，Duarte AJ，et，al.IL-12 and neutralization of endogenous IL-10 revert the in vitro antigen-specific cellular immunosuppression of paracoccidioidomycosis patients[J].Cytokine，2002，18(3)：149~157.
[4] Kawakami k，Tohyama，M，Xie QF，et al.Interleukin-12 protects mice against pulmonary and disseminated infection caused by cryptococcus neoformans [J].Clin Exp Immunol，1996，104：208~214.
[5] Maffei CM，Mirels LF，Sobel RA，et al.Cytokine and inducible nitric oxide synthase mRNA expression during experimental murine cryptococcal meningoencephalitis[J].Infect Immun，2004，72(4)：2338~2349.
[6] Bocca，AL，Hayashi AG，Pinheiro AB，et al.Treatment of Paracoccidioides brasiliensis-infected mice with a nitric oxide inhibitor prevents the failure of cell-mediated immune response [J].J Immunol，1998，161：3056~3063.
(责任编辑：陈涌涛)