【摘 要】
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为研究小尾寒羊绵羊白细胞抗原Ⅰ(Ovis aries leukocyte antigen classⅠ,OLAⅠ)轻链四聚体前体链β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2 m)的结构和功能,根据GenBank中公布的绵
【机 构】
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中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,兰州 730046
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为研究小尾寒羊绵羊白细胞抗原Ⅰ(Ovis aries leukocyte antigen classⅠ,OLAⅠ)轻链四聚体前体链β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2 m)的结构和功能,根据GenBank中公布的绵羊β2 m基因设计特异性引物,提取小尾寒羊全血中的RNA并运用RT-PCR方法扩增绵羊β2 m基因,将扩增的绵羊β2 m基因克隆到pMD18-T载体,筛选出阳性克隆菌pMD18T-OLAⅠ-β2 m,经双酶切后与表达载体pET-28a(+)连接,再转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中构建pET-28a(+)-OLAⅠ-β2 m重组表达菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白大小及表达情况;运用SOMPA在线软件预测OLAⅠ-β2 m蛋白的二级结构.PCR扩增结果显示,目的基因大小为357 bp,与理论值相符,扩增片段成功克隆到pMD18-T载体,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切筛选及测序,成功获得阳性克隆菌株pMD18-T-OLAⅠ-β2 m,插入的目的片段大小为357 bp.阳性克隆菌株与表达载体pET-28a(+)经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后获得pET-28a(+)-OLAⅠ-β2 m重组表达菌,经IPTG诱导表达,Western blotting检测目的蛋白大小为17.3 ku,目的蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达,经洗涤、变性、纯化、初步获得SDS-PAGE纯化的OLAⅠ-β2 m蛋白;PORTER在线软件预测OLAⅠ-β2 m蛋白的二级结构元件α-螺旋(Hh)、β-折叠(Ee)和无规则卷曲(Cc)分别占22.03％、22.03％和55.93％.本研究成功构建了小尾寒羊β2 m基因的pET-28a(+)重组表达体系,运用SOMPA在线软件预测OLAⅠ-β2 m的二级结构,为下一步绵羊OLAⅠ类分子四聚体的构建奠定基础.
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