论文部分内容阅读
摘要：
为探明再生水补水对河道底泥细菌群落结构的影响，以深圳市西乡河再生水补水为研究对象，在分析河道8处底泥样品理化指标的基础上，运用 Illumina 高通量测序技术探究河道再生水补水后底泥细菌群落结构的空间差异特征以及对环境因子所产生的影响，并借助冗余分析方法分析河道底泥细菌群落结构空间差异特征的形成原因。分析结果表明：西乡河中下游底泥含有多种污染物，且中游重金属污染较为严重;河道底泥中的细菌群落结构与多样性在空间上存在显著的差异，补水口附近底泥的微生物具有较高的多样性;河道底泥中优势菌主要有硫杆菌（Thiobacillus）、拟杆菌（Bacteroides）、脱硫菌属（Desulfatiglans、Desulfococcus、Desulfuromonas）、脱磷菌属（Desulfomicrobicum）以及反硝化菌属（Dechloromonas、Ferritrophicum），占克隆文库的70%以上;再生水中的氮、磷、有机物和Cu和Fe重金属等物质对补水口附近的底泥反硝化菌属和脱硫菌属的多样性及其丰度具有显著的影响，而对距离较远的珠江口底泥微生物影响较小。
关 键 词：
再生水补水; 细菌群落结构; 底泥; 重金属; 西乡河
中图法分类号： X828
文献标志码： A
DOI：10.16232/j.cnki.1001-4179.2021.07.010
0 引 言
随着城市的发展，城市中多数河道变成区域纳污河流，一些河道甚至出现了“无水断流，有水皆黑”的现象，再生水补水是解决这一现象的关键[1]。再生水作为城市的稳定再生水源，在缓解深圳市地表水资源短缺，城市雨源性河道生态基流间歇性缺水等问题发挥了重要作用。然而，再生水补水会影响河道中营养物和污染物的原有状态，其可以改变河道水体环境及污染物迁移路径，进而影响河道水质及底泥的理化性质[2-4]。另外，河道水质及底泥的理化指标特别是营养物和污染物的变化将对底泥微生物群落结构有显著影响[5-8]。
目前，大量的学者对河道补水与底泥微生物群落结构的响应关系进行了相关研究。Wakelin等[9]通过利用基因克隆文库构建与qPCR相结合的方法对污水处理厂排水与河道底泥固氮微生物丰度的响应关系进行了分析，结果表明河道底泥中固氮基因相对丰度与补水水量成正相关;Baniulyte[10]研究分析了以氮、磷等营养盐为主的补水对水域环境的影响，研究表明，在高浓度营养盐污水对河道补水的作用下，底泥中Bacteriodetes类群的相对丰度与有机物降解呈现正相关关系;马栋山等[11]应用限制性片段长度多态性（T-RFLP）技术分析了京市永定河麻峪湿地再生水补水口附近底泥微生物群落结构的空间差异特征以及其與环境因子所产生的响应关系，结果显示，TP和TOC对补水口底泥细菌的多样性及群落结构有较大的影响，而氨氮的净化与再生水补水距离有一定关系。由此可见，补水水质情况会对底泥中的微生物造成影响，进而会影响河道水质净化和污染物修复，因此研究再生水补水与城市纳污河道底泥微生物的响应关系，解析影响微生物群落结构变化的主次要环境因素，探明能够降解污染物的优势菌属，将为深圳市河道补水的生态修复工作提供依据。
1 材料与方法
1.1 研究区概况
研究区域位于深圳市宝安区西南部，属于珠江口流域。流域属亚热带海洋性气候，全年气温较高，温暖无冬。流域内多年平均降雨量为1 667.0 mm，降雨多集中在4～9月，多年平均气温约为22.0 ℃，年内气温变化较小。西乡河全长约为7.62 km，流域面积17.78 km2。流域内有固戍污水处理厂为西乡河进行再生水补水（补水点距离铁岗水库约800 m，见图1），污水厂设计规模为24万m3/d，现状旱季再生水约15万～18万m3/d，通过泵站提升西乡河上游的总量为10万～11万m3/d。河道上游因有补水作用，水流动力足，水质较好;河道下游出口为珠江口伶仃洋海区，因潮汐原因，下游约2.00 km为感潮河段，河道水质受潮汐影响较大，大面积水体呈褐色，且水面经常产生刺激性气味，上下游河道水质及水动力显现出明显的差异。
1.2 样品采集及测定
本研究沿铁岗水库至河道入珠江口8个点进行河道底泥采集。根据铁排河生态功能区划分，取样点分布在补水口的上下游，主要包括补水口上游500 m点XN1（尖岗山大道），补水口点XN2（敬老院桥下）及下游1 km等间隔的点XN3（广深公路）、点XN4（宝安大道）、点XN5（新湖路桥）和点XN6（宝源路桥），距珠江口1 km的点XN7（金科路）及XN8（入珠江口），如图1所示。每个采样点利用GPS定位，并利用挖斗式采泥器在距离上覆水10 cm深度处采样，单个采样点需采集约600 g底泥，置于干净密封无菌塑料袋中，随后带回实验室内冷藏处理。在实验室将样品分为两份，并在24 h内对第一份底泥做TN、TP、TOC、NO3--N及重金属等（再生水中的重要水质因子）常规理化指标的检测与分析;另一份底泥进行细菌群落结构的多样性测定。
1.3 DNA提取与高通量测序
首先提取微生物的DNA，并用NanoDrop2000分光光度计和琼脂糖凝胶电泳（Resp）检测DNA的浓度和完整性，随后可以进行后续实验。然后以提取的DNA为模板，进行第一阶段的PCR产物纯化，随即进行第二阶段PCR扩增，并对磁珠纯化后的PCR产物进行Qubit定量。最后在Illumina MiSeq测序平台上测序。
1.4 统计分析
使用SPSS 21.0 软件（SPSS，USA）对8个底泥的理化参数进行了差异化分析。以细菌群落组成及底泥理化性质数据为基础，利用CANOCO（Version 5.0）进行冗余分析，探明西乡河细菌群落与环境因子的相互联系。采用R软件（Version 2.1.1）制作热图（heat map），分析不同采样点底泥优势菌属在属水平上群落组成差异性。 2 结果与讨论
2.1 底泥沉积物理化性质分析
西乡河8个样点底泥的理化指标如表1所列。根据各个点理化参数的单因素分析可知：TN、TP、TOC、NH4+-N、NO3--N、Cu、Zn浓度在不同采样点存在明显的差异，补水处底泥的TN、TP、TOC、NH4+-N和NO3--N浓度较补水上游都有大幅提升，河道中下游底泥污染物较为严重，中游底泥重金属较上、下游污染严重，下游水面大面积呈褐色，且常伴恶臭的气味产生。补水点下游采样点随着补水的距离增加，底泥中理化指标的含量逐渐减少，这是由于底泥中的微生物对TN、TOC、NH4+-N和NO3--N进行了转化消耗。但在入珠江口处的底泥含量有明显的突变，这主要是因为下游河道为感潮河段，受到潮汐的顶托效应严重，河道翻泥覆新较快，河道中大量的富营养污染物迁移到珠江中，致使水体及底泥中污染物大幅减少。
2.2 细菌群落结构
2.2.1 细菌群落多样性
通过Miseq高通量测序，对西乡河8个样点底泥97%的高质量序列相似度进行OTUs划分，共取得18 470条OTUs，所有样点底泥的OTUs数量最高为2 726条，最低为1 967条。各样点的微生物多样性指数如表2所示，8个底泥样品中相同的OTUs共有468个，约占OTUs总数的2.5%，表明西乡河不同空间的底泥的细菌群落多样性显著。所有样本文库的覆盖度为92.72%～97.74%，说明测序能够深度揭示西乡河河道底泥中微生物群落的真实情况。由Chao1多样性指数显示，上游XN1、补水点XN2样点及河道下游感潮河段的Chao1指数较低，说明下游底泥中微生物丰度较低;XN4、XN5、XN6样点的Chao1指数较高，表明底泥中微生物丰度较好。另外，底泥样品的Simpson指数在0.80～0.90之间，其中XN4、XN5和XN6样点Simpson指数值较高，说明这3处河道底泥具有相对较丰富的群落结构。由Shannon细菌群落多样性指数可知：西乡河河道8个底泥样品中的Shannon指数变化范围较大，XN1样品Shannon指数最低，为4.67，说明XN1处的细菌多样性最低;除此之外，在入珠江口的2个点（XN7和XN8）底泥Shannon指数也较小，分别为5.33和5.42，且数值相差较小，说明珠江口处细菌的多样性存在较小的差异。
用等级-多度（Rank-abundance）曲线[12]比较了8个样本底泥中微生物的物种丰度和均匀度。由图2可知：在水平方向上，XN4、XN5 和XN6三个样点的曲线宽度较宽，其丰度较大;相反，其余样点的曲线宽度较窄，样点的微生物丰富度也较小;XN2（补水点）、XN3及XN8三个样点的Rank-abundance曲线较为光滑，表明这3处河道底泥中的物种均匀度较好;其余5处河道底泥中的物种均匀度较差。
2.2.2 细菌群落组成与结构
对底泥样品的测试进行生物信息统计分析，结果表明，18 470条OTUs主要属于8个门，30个属。由图3可知：8个底泥样品的细菌种群结构在门水平上相似，但每种门的丰度确有着很大的差异，在门的水平上，相对丰度从高到低依次是变形菌门（Proteonacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、螺旋藻（Spirochaetes）、放线菌门（Actinobateria）、变形菌门（Epsilonbacteraeota）。其中：主要细菌群为变形菌门Proteonacteria，且在每个样品中占比均高于50%;其次占比较高的为拟杆菌门，占比均超15%;其余门属占比較低;这表明了变形菌门和拟杆菌门是西乡河河道底泥的优势门属。
为了进一步揭示各样本底泥微生物的丰度和群落结构，本研究在属的水平上制作了热图（heat map），如图4所示：西乡河河道底泥的细菌群落结构相对丰富，但样品之间的主要菌属存在明显差别。XN3、XN4、XN5和XN6 四个样点底泥拥有丰富的群落结构，而XN7和XN8样点底泥的群落结构却相对单一。这主要是因为XN3、XN4、XN5和XN6 四个点位于补水点下游，且与补水点距离较近，补水中的氮、磷及有机物沉积到底泥中，其能够为细菌提供了较好的营养物质，这4处采样点为河道的中游，河道中长期有水积存，水流速度较缓，为底泥微生物提供了稳定的生存场所。点XN7和XN8距离补水口超过5km，距离较远，补水对河道底泥微生物的影响较小;另外，XN7和XN8两个采样点处于感潮河段，河道水体与珠江水交换频繁，底泥翻泥换新频率较高，大量营养物质流向珠江，不利于底泥及水体中微生物的生存，说明潮汐对微生物群落的影响远远大于补水的作用。从主要优势属来看：底泥中微生物的优势菌主要有硫杆菌（Thiobacillus）、拟杆菌（Bacteroides）、脱硫菌属（Desulfatiglans、Desulfococcus、Desulfuromonas）、脱磷菌属（Desulfomicrobicum）以及反硝化菌属（Dechloromonas、Ferritrophicum），这些菌属在克隆文库中占比超70%，其均对不同形态的氮、磷、硫等相关物质的生态循环有着直接响应，并对底泥中物质的降解有着显著作用。从单个样品来分析：补水点（XN2）的底泥样品中主要菌属为反硝化菌属，可降解补水中的硝态氮及亚硝态氮;XN4、XN5和XN6 三个样品中优势菌属主要为脱硫菌属和反硝化菌属，这对水体及底泥中的硝酸盐和硫酸盐的分解还原起着较大作用，产生硫化氢等恶臭气体;XN7和XN8因受到潮水和渔业的影响，底泥中氮、磷及硫等物质相比较少，而烃类物质较多，因此优势菌属主要以烃降解菌（Smithella）为主，此菌属可以参与珠江口水体及底泥中烃类物质的降解。
2.3 再生水补水对河道底泥微生物环境响应 在再生水对河道补水的作用下，基于底泥样品中细菌菌属类别及底泥理化数据基础，对底泥微生物群落组成与环境因子进行冗余分析。冗余分析可以解释微生物群落组成的95.6%，其中PC1轴解释了多数微生物菌属组成，其能够解释总变异的70.1%，PC2能够解释总变异的25.5%。如图5所示：XN2、XN3、XN4、XN5和XN6样点的微生物群落丰富度指数和多样性指数分别与TN、TP、NO3--N、TOC、Cu和Fe 等有较好的相关性，西乡河补水下游XN4、XN5和XN6 3个点处的缓慢水流和水环境较长的更新周期，致使再生水中有机物和营养物质沉积河道的底泥中，导致补水下游底泥中碳氮磷浓度显著高于上游，进而影响底泥中细菌的群落结构和多样性;河道下游XN7和XN8两个采样点底泥中烃类降解菌（Simtjella）和苯类污染物降解菌（Syntrophorhabdus）丰度较高，主要因为珠江口有渔业存在，水体及底泥中会含有一定量的烃类和苯类物质，为烃类降解菌提供很好的营养物质。
再生水河道补水，不仅为河道加强了水动力，而且为河道带了大量的氮、磷等物质，多种形态的氮素循环可通过水中植物根际微生物固氮、好氧硝化、厌氧反硝化和氨化作用这4个阶段进行[13-15]。多种硝化与反硝化微生物对沉积物中无机氮的迁移转化具有很好的促进作用，大气中的氮素首先通过固氮、硝化等作用进入生物圈，然后由微生物进行反硝化后再次回到大气中，进而实现自然界的氮素循环[16-18]。本研究中补水口（XN2）处有丰度较高的梭菌属（Dechloromonas），占克隆文库的32.5%，此菌属属于反硝化细菌，在反硝化作用中发挥重要的作用。另外，在下游XN3、XN4、XN5和XN6 四个采样点处具有丰度较高的有反硝化菌屬（Dechloromonas、Ferritrophicum）和脱硫菌属（Desulfatiglans，Desulfococcus，Desulfuromonas），这些菌属与TN、TP和TOC等物质呈显著的正相关关系，而Dechloromonas，Ferritrophicum与NO-3-N呈负相关关系，反硝化菌属将对氮素的转化有良好促进作用。但随着采样点逐渐远离补水口，反硝化菌属和脱硫菌属的克隆文库占比逐渐下降。再生水中含有少量的病原菌、抗生素等，这将对微生物产生较大的危害，再生水补水中大量的有机质为有机厌氧类病原菌的生长供给了优越的生境条件。
重金属是再生水对底微生环境效应的次要因素。有研究表明不同微生物受到重金属的影响程度不同，重金属Cu、Fe、Zn和Pb等污染会影响微生物细胞的代谢功能，使其生物多样性下降[19]。另外，重金属也会对微生物群落结构造成影响，本研究通过冗余分析得到河道底泥中不同微生物对重金属的群落结构的影响。如图5所示：XN2、XN3和XN4 三处的底泥微生物与重金属Cu和Fe的具有显著的相关性，说明Cu和Fe重金属是这些菌属群落结构的主要影响因子;点XN7和XN8中的底泥中烃类降解菌（Simtjella）和苯类污染物降解菌（Syntrophorhabdus）与重金属Zn有一定的相关性，进而解释了重金属Zn对珠江口底泥微生物群落结构的具有一定的影响。
3 结 论
（1） 西乡河河道底泥中的细菌群落结构与多样性在空间上存在显著的差异，补水口处底泥的微生物多样性较高，补水口下游连续3处采样点的底泥微生物丰度指数较高，且有相似的群落结构。
（2） 河道底泥中微生物的优势菌主要有硫杆菌（Thiobacillus）、拟杆菌（Bacteroides）、脱硫菌属（Desulfatiglans，Desulfococcus，Desulfuromonas）、脱磷菌属（Desulfomicrobicum）以及反硝化菌属（Dechloromonas，Ferritrophicum），主要菌属占克隆文库的70%以上。
（3） 再生水中的氮、磷、有机物和Cu和Fe重金属等物质对底泥中反硝化菌属和脱硫菌属的多样性及其丰度具有显著的影响;补水对距离较远河道底泥微生物的影响较小，珠江口处底泥微生物受到潮汐的影响远大于补水作用;重金属Zn对其微生物群落结构的具有一定的影响。
参考文献：
[1] 于森，王明玉，刘佳，等.人工补水条件下的缺水河流生态修复综合评价方法[J].环境科学学报，2013，33（2）：626-634.
[2] 邸琰茗，王广煊，黄兴如，等.再生水补水对河道底泥细菌群落组成与功能的影响[J].环境科学，2017，38（2）：743-751.
[3] 阴星望，田伟，丁一，等.丹江口库区表层沉积物细菌多样性及功能预测分析[J].湖泊科学，2018，30（4）：1052-1063.
[4] WASSEN M J，BARENDREGT A.Topographic position and water chemistry of fens in a Dutch river plain[J].Journal of Vegetation Science，1992，3（4）：447-456.
[5] 万甜，何梦夏，任杰辉，等.渭河流域水体细菌群落的环境响应及生态功能预测[J].环境科学，2019，40（8）：3588-3595.
[6] 王鹏，肖汉玉，袁瑞强，等.鄱阳湖入湖河口沉积物真菌群落结构[J].环境科学学报，2018，38（5）：1949-1956.
[7] 赵阳国，任南琪，王爱杰，等.有机污染物对水体真细菌群落结构的影响[J].微生物学报，2007，47（2）：313-318.
[8] 王莹.污染河流中微生物群落结构的空间变化解析[D].长春：东北师范大学，2008.
[9] WAKELIN S A，COLLOFF M J，KOOKANA R S.Effect of wastewater treatment plant effluent on microbial function and community structure in the sediment of a freshwater stream with variable seasonal flow[J].Applied and Environmental Microbiology，2008，74（9）：2659-2668. [10] BANIULYTE D，FAVILA E，KELLY J.Shifts in microbial community composition following surface application of dredged river sediments[J].Microbial Ecology，2009，57（1）：160-169.
[11] 马栋山，郭羿宏，张琼琼，等.再生水补水对河道底泥细菌群落结构的影响[J].生态学报，2014，35（20）：6742-6749.
[12] BATES S T，CLEMENTE J C，FLORES G E，et，al.Global biogeography of highly diverse protistan communities in soil[J].The ISME Journal，2013，7（3）：652-659.
[13] GUO Y H，GONG H L，GUO X Y.Rhizosphere bacterial community of Typhaangustifolia L.and water quality in a river wetland supplied with reclaimed water[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2015，99（6）：2883-2893.
[14] 陈兆进，丁传雨，朱静亚，等.丹江口水库枯水期浮游细菌群落组成及影响因素研究[J].中国环境科学，2017，37（1）：336-344.
[15] 王鹏，陈波，张华.基于高通量测序的鄱阳湖典型湿地土壤细菌群落特征分析[J].生态学报，2017，37（5）：1650-1658.
[16] DRURY B，ROSI-MARSHALL E，KELLY J J.Wastewater treatment effluent reduces the abundance and diversity of benthic bacterial communities in urban and suburban rivers[J].Applied and Environmental Microbiology，2013，79（6）：1897-1905.
[17] 鮑林林，陈永娟，王晓燕.北运河沉积物中氨氧化微生物的群落特征[J].中国环境科学，2015，35（1）：179-189.
[18] 程豹，望雪，徐雅倩，等.澜沧江流域浮游细菌群落结构特征及驱动因子分析[J].环境科学，2018，39（8）：3649-3659.
[19] 刘晋仙，李毳，景炬辉，等.中条山十八河铜尾矿库微生物群落组成与环境适应性[J].环境科学，2017，38（1）：318-326.
（编辑：刘 媛）
Influence of reclaimed water replenishment on bacterial community structure in river sediment
TONG Xiaohui1，WANG Yinlong2，LIU Xiaoning2，SU Yuzheng2
（1.China Communications First Highway Survey and Design Institute Co.，Ltd.，Xi′an 710065，China; 2.Xi′an Zhongjiao Environmental Engineering Co.，Ltd.，Xi′an 710065，China）
Abstract：
To clarify the influence of reclaimed water replenishment on the bacterial community structure of river sediments，the reclaimed water replenishment of the Xixiang River in Shenzhen City was taken as the research object，based on the analysis of the physical and chemical indicators of 8 sediment samples in the river channel，the Illumina high-throughput sequencing technology was used to explore the spatial difference in the bacterial community structure of the sediment after the reclaimed water in the river channel and its impact on environmental factors.In addition，the formation reasons for the spatial difference of the bacterial community structure are analyzed by redundancy analysis method.The analysis results show the sediment in the middle and lower reaches of the Xixiang River contains a variety of pollutants，and the heavy metal pollution is more serious in the middle reaches;there are significant spatial differences in the bacterial community structure and diversity in river sediments，and a high diversity of microorganisms in the bottom mud near the water replenishment port;the dominant bacteria in the river sediments are Thiobacillus，Bacteroides，Desulfatiglans，Desulfococcus，Desulfuromonas，Desulfomicrobicum，and denitrifying bacteria（Dechloromonas，Ferritrophicum），which accounts for more than 70% of the cloned library;Nitrogen，phosphorus，organics，and heavy metals such as Cu and Fe in the reclaimed water are responsible for the diversity and abundance of denitrifying bacteria and desulfurizing bacteria in the sediments near the water intake，it has a significant effect on the degree，but it has little effect on microorganisms in the sediments of the Pearl River Estuary.
Key words：
reclaimed water replenishment;bacterial community structure;sediment;heavy metal;Xixiang River
为探明再生水补水对河道底泥细菌群落结构的影响，以深圳市西乡河再生水补水为研究对象，在分析河道8处底泥样品理化指标的基础上，运用 Illumina 高通量测序技术探究河道再生水补水后底泥细菌群落结构的空间差异特征以及对环境因子所产生的影响，并借助冗余分析方法分析河道底泥细菌群落结构空间差异特征的形成原因。分析结果表明：西乡河中下游底泥含有多种污染物，且中游重金属污染较为严重;河道底泥中的细菌群落结构与多样性在空间上存在显著的差异，补水口附近底泥的微生物具有较高的多样性;河道底泥中优势菌主要有硫杆菌（Thiobacillus）、拟杆菌（Bacteroides）、脱硫菌属（Desulfatiglans、Desulfococcus、Desulfuromonas）、脱磷菌属（Desulfomicrobicum）以及反硝化菌属（Dechloromonas、Ferritrophicum），占克隆文库的70%以上;再生水中的氮、磷、有机物和Cu和Fe重金属等物质对补水口附近的底泥反硝化菌属和脱硫菌属的多样性及其丰度具有显著的影响，而对距离较远的珠江口底泥微生物影响较小。
关 键 词：
再生水补水; 细菌群落结构; 底泥; 重金属; 西乡河
中图法分类号： X828
文献标志码： A
DOI：10.16232/j.cnki.1001-4179.2021.07.010
0 引 言
随着城市的发展，城市中多数河道变成区域纳污河流，一些河道甚至出现了“无水断流，有水皆黑”的现象，再生水补水是解决这一现象的关键[1]。再生水作为城市的稳定再生水源，在缓解深圳市地表水资源短缺，城市雨源性河道生态基流间歇性缺水等问题发挥了重要作用。然而，再生水补水会影响河道中营养物和污染物的原有状态，其可以改变河道水体环境及污染物迁移路径，进而影响河道水质及底泥的理化性质[2-4]。另外，河道水质及底泥的理化指标特别是营养物和污染物的变化将对底泥微生物群落结构有显著影响[5-8]。
目前，大量的学者对河道补水与底泥微生物群落结构的响应关系进行了相关研究。Wakelin等[9]通过利用基因克隆文库构建与qPCR相结合的方法对污水处理厂排水与河道底泥固氮微生物丰度的响应关系进行了分析，结果表明河道底泥中固氮基因相对丰度与补水水量成正相关;Baniulyte[10]研究分析了以氮、磷等营养盐为主的补水对水域环境的影响，研究表明，在高浓度营养盐污水对河道补水的作用下，底泥中Bacteriodetes类群的相对丰度与有机物降解呈现正相关关系;马栋山等[11]应用限制性片段长度多态性（T-RFLP）技术分析了京市永定河麻峪湿地再生水补水口附近底泥微生物群落结构的空间差异特征以及其與环境因子所产生的响应关系，结果显示，TP和TOC对补水口底泥细菌的多样性及群落结构有较大的影响，而氨氮的净化与再生水补水距离有一定关系。由此可见，补水水质情况会对底泥中的微生物造成影响，进而会影响河道水质净化和污染物修复，因此研究再生水补水与城市纳污河道底泥微生物的响应关系，解析影响微生物群落结构变化的主次要环境因素，探明能够降解污染物的优势菌属，将为深圳市河道补水的生态修复工作提供依据。
1 材料与方法
1.1 研究区概况
研究区域位于深圳市宝安区西南部，属于珠江口流域。流域属亚热带海洋性气候，全年气温较高，温暖无冬。流域内多年平均降雨量为1 667.0 mm，降雨多集中在4～9月，多年平均气温约为22.0 ℃，年内气温变化较小。西乡河全长约为7.62 km，流域面积17.78 km2。流域内有固戍污水处理厂为西乡河进行再生水补水（补水点距离铁岗水库约800 m，见图1），污水厂设计规模为24万m3/d，现状旱季再生水约15万～18万m3/d，通过泵站提升西乡河上游的总量为10万～11万m3/d。河道上游因有补水作用，水流动力足，水质较好;河道下游出口为珠江口伶仃洋海区，因潮汐原因，下游约2.00 km为感潮河段，河道水质受潮汐影响较大，大面积水体呈褐色，且水面经常产生刺激性气味，上下游河道水质及水动力显现出明显的差异。
1.2 样品采集及测定
本研究沿铁岗水库至河道入珠江口8个点进行河道底泥采集。根据铁排河生态功能区划分，取样点分布在补水口的上下游，主要包括补水口上游500 m点XN1（尖岗山大道），补水口点XN2（敬老院桥下）及下游1 km等间隔的点XN3（广深公路）、点XN4（宝安大道）、点XN5（新湖路桥）和点XN6（宝源路桥），距珠江口1 km的点XN7（金科路）及XN8（入珠江口），如图1所示。每个采样点利用GPS定位，并利用挖斗式采泥器在距离上覆水10 cm深度处采样，单个采样点需采集约600 g底泥，置于干净密封无菌塑料袋中，随后带回实验室内冷藏处理。在实验室将样品分为两份，并在24 h内对第一份底泥做TN、TP、TOC、NO3--N及重金属等（再生水中的重要水质因子）常规理化指标的检测与分析;另一份底泥进行细菌群落结构的多样性测定。
1.3 DNA提取与高通量测序
首先提取微生物的DNA，并用NanoDrop2000分光光度计和琼脂糖凝胶电泳（Resp）检测DNA的浓度和完整性，随后可以进行后续实验。然后以提取的DNA为模板，进行第一阶段的PCR产物纯化，随即进行第二阶段PCR扩增，并对磁珠纯化后的PCR产物进行Qubit定量。最后在Illumina MiSeq测序平台上测序。
1.4 统计分析
使用SPSS 21.0 软件（SPSS，USA）对8个底泥的理化参数进行了差异化分析。以细菌群落组成及底泥理化性质数据为基础，利用CANOCO（Version 5.0）进行冗余分析，探明西乡河细菌群落与环境因子的相互联系。采用R软件（Version 2.1.1）制作热图（heat map），分析不同采样点底泥优势菌属在属水平上群落组成差异性。 2 结果与讨论
2.1 底泥沉积物理化性质分析
西乡河8个样点底泥的理化指标如表1所列。根据各个点理化参数的单因素分析可知：TN、TP、TOC、NH4+-N、NO3--N、Cu、Zn浓度在不同采样点存在明显的差异，补水处底泥的TN、TP、TOC、NH4+-N和NO3--N浓度较补水上游都有大幅提升，河道中下游底泥污染物较为严重，中游底泥重金属较上、下游污染严重，下游水面大面积呈褐色，且常伴恶臭的气味产生。补水点下游采样点随着补水的距离增加，底泥中理化指标的含量逐渐减少，这是由于底泥中的微生物对TN、TOC、NH4+-N和NO3--N进行了转化消耗。但在入珠江口处的底泥含量有明显的突变，这主要是因为下游河道为感潮河段，受到潮汐的顶托效应严重，河道翻泥覆新较快，河道中大量的富营养污染物迁移到珠江中，致使水体及底泥中污染物大幅减少。
2.2 细菌群落结构
2.2.1 细菌群落多样性
通过Miseq高通量测序，对西乡河8个样点底泥97%的高质量序列相似度进行OTUs划分，共取得18 470条OTUs，所有样点底泥的OTUs数量最高为2 726条，最低为1 967条。各样点的微生物多样性指数如表2所示，8个底泥样品中相同的OTUs共有468个，约占OTUs总数的2.5%，表明西乡河不同空间的底泥的细菌群落多样性显著。所有样本文库的覆盖度为92.72%～97.74%，说明测序能够深度揭示西乡河河道底泥中微生物群落的真实情况。由Chao1多样性指数显示，上游XN1、补水点XN2样点及河道下游感潮河段的Chao1指数较低，说明下游底泥中微生物丰度较低;XN4、XN5、XN6样点的Chao1指数较高，表明底泥中微生物丰度较好。另外，底泥样品的Simpson指数在0.80～0.90之间，其中XN4、XN5和XN6样点Simpson指数值较高，说明这3处河道底泥具有相对较丰富的群落结构。由Shannon细菌群落多样性指数可知：西乡河河道8个底泥样品中的Shannon指数变化范围较大，XN1样品Shannon指数最低，为4.67，说明XN1处的细菌多样性最低;除此之外，在入珠江口的2个点（XN7和XN8）底泥Shannon指数也较小，分别为5.33和5.42，且数值相差较小，说明珠江口处细菌的多样性存在较小的差异。
用等级-多度（Rank-abundance）曲线[12]比较了8个样本底泥中微生物的物种丰度和均匀度。由图2可知：在水平方向上，XN4、XN5 和XN6三个样点的曲线宽度较宽，其丰度较大;相反，其余样点的曲线宽度较窄，样点的微生物丰富度也较小;XN2（补水点）、XN3及XN8三个样点的Rank-abundance曲线较为光滑，表明这3处河道底泥中的物种均匀度较好;其余5处河道底泥中的物种均匀度较差。
2.2.2 细菌群落组成与结构
对底泥样品的测试进行生物信息统计分析，结果表明，18 470条OTUs主要属于8个门，30个属。由图3可知：8个底泥样品的细菌种群结构在门水平上相似，但每种门的丰度确有着很大的差异，在门的水平上，相对丰度从高到低依次是变形菌门（Proteonacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、螺旋藻（Spirochaetes）、放线菌门（Actinobateria）、变形菌门（Epsilonbacteraeota）。其中：主要细菌群为变形菌门Proteonacteria，且在每个样品中占比均高于50%;其次占比较高的为拟杆菌门，占比均超15%;其余门属占比較低;这表明了变形菌门和拟杆菌门是西乡河河道底泥的优势门属。
为了进一步揭示各样本底泥微生物的丰度和群落结构，本研究在属的水平上制作了热图（heat map），如图4所示：西乡河河道底泥的细菌群落结构相对丰富，但样品之间的主要菌属存在明显差别。XN3、XN4、XN5和XN6 四个样点底泥拥有丰富的群落结构，而XN7和XN8样点底泥的群落结构却相对单一。这主要是因为XN3、XN4、XN5和XN6 四个点位于补水点下游，且与补水点距离较近，补水中的氮、磷及有机物沉积到底泥中，其能够为细菌提供了较好的营养物质，这4处采样点为河道的中游，河道中长期有水积存，水流速度较缓，为底泥微生物提供了稳定的生存场所。点XN7和XN8距离补水口超过5km，距离较远，补水对河道底泥微生物的影响较小;另外，XN7和XN8两个采样点处于感潮河段，河道水体与珠江水交换频繁，底泥翻泥换新频率较高，大量营养物质流向珠江，不利于底泥及水体中微生物的生存，说明潮汐对微生物群落的影响远远大于补水的作用。从主要优势属来看：底泥中微生物的优势菌主要有硫杆菌（Thiobacillus）、拟杆菌（Bacteroides）、脱硫菌属（Desulfatiglans、Desulfococcus、Desulfuromonas）、脱磷菌属（Desulfomicrobicum）以及反硝化菌属（Dechloromonas、Ferritrophicum），这些菌属在克隆文库中占比超70%，其均对不同形态的氮、磷、硫等相关物质的生态循环有着直接响应，并对底泥中物质的降解有着显著作用。从单个样品来分析：补水点（XN2）的底泥样品中主要菌属为反硝化菌属，可降解补水中的硝态氮及亚硝态氮;XN4、XN5和XN6 三个样品中优势菌属主要为脱硫菌属和反硝化菌属，这对水体及底泥中的硝酸盐和硫酸盐的分解还原起着较大作用，产生硫化氢等恶臭气体;XN7和XN8因受到潮水和渔业的影响，底泥中氮、磷及硫等物质相比较少，而烃类物质较多，因此优势菌属主要以烃降解菌（Smithella）为主，此菌属可以参与珠江口水体及底泥中烃类物质的降解。
2.3 再生水补水对河道底泥微生物环境响应 在再生水对河道补水的作用下，基于底泥样品中细菌菌属类别及底泥理化数据基础，对底泥微生物群落组成与环境因子进行冗余分析。冗余分析可以解释微生物群落组成的95.6%，其中PC1轴解释了多数微生物菌属组成，其能够解释总变异的70.1%，PC2能够解释总变异的25.5%。如图5所示：XN2、XN3、XN4、XN5和XN6样点的微生物群落丰富度指数和多样性指数分别与TN、TP、NO3--N、TOC、Cu和Fe 等有较好的相关性，西乡河补水下游XN4、XN5和XN6 3个点处的缓慢水流和水环境较长的更新周期，致使再生水中有机物和营养物质沉积河道的底泥中，导致补水下游底泥中碳氮磷浓度显著高于上游，进而影响底泥中细菌的群落结构和多样性;河道下游XN7和XN8两个采样点底泥中烃类降解菌（Simtjella）和苯类污染物降解菌（Syntrophorhabdus）丰度较高，主要因为珠江口有渔业存在，水体及底泥中会含有一定量的烃类和苯类物质，为烃类降解菌提供很好的营养物质。
再生水河道补水，不仅为河道加强了水动力，而且为河道带了大量的氮、磷等物质，多种形态的氮素循环可通过水中植物根际微生物固氮、好氧硝化、厌氧反硝化和氨化作用这4个阶段进行[13-15]。多种硝化与反硝化微生物对沉积物中无机氮的迁移转化具有很好的促进作用，大气中的氮素首先通过固氮、硝化等作用进入生物圈，然后由微生物进行反硝化后再次回到大气中，进而实现自然界的氮素循环[16-18]。本研究中补水口（XN2）处有丰度较高的梭菌属（Dechloromonas），占克隆文库的32.5%，此菌属属于反硝化细菌，在反硝化作用中发挥重要的作用。另外，在下游XN3、XN4、XN5和XN6 四个采样点处具有丰度较高的有反硝化菌屬（Dechloromonas、Ferritrophicum）和脱硫菌属（Desulfatiglans，Desulfococcus，Desulfuromonas），这些菌属与TN、TP和TOC等物质呈显著的正相关关系，而Dechloromonas，Ferritrophicum与NO-3-N呈负相关关系，反硝化菌属将对氮素的转化有良好促进作用。但随着采样点逐渐远离补水口，反硝化菌属和脱硫菌属的克隆文库占比逐渐下降。再生水中含有少量的病原菌、抗生素等，这将对微生物产生较大的危害，再生水补水中大量的有机质为有机厌氧类病原菌的生长供给了优越的生境条件。
重金属是再生水对底微生环境效应的次要因素。有研究表明不同微生物受到重金属的影响程度不同，重金属Cu、Fe、Zn和Pb等污染会影响微生物细胞的代谢功能，使其生物多样性下降[19]。另外，重金属也会对微生物群落结构造成影响，本研究通过冗余分析得到河道底泥中不同微生物对重金属的群落结构的影响。如图5所示：XN2、XN3和XN4 三处的底泥微生物与重金属Cu和Fe的具有显著的相关性，说明Cu和Fe重金属是这些菌属群落结构的主要影响因子;点XN7和XN8中的底泥中烃类降解菌（Simtjella）和苯类污染物降解菌（Syntrophorhabdus）与重金属Zn有一定的相关性，进而解释了重金属Zn对珠江口底泥微生物群落结构的具有一定的影响。
3 结 论
（1） 西乡河河道底泥中的细菌群落结构与多样性在空间上存在显著的差异，补水口处底泥的微生物多样性较高，补水口下游连续3处采样点的底泥微生物丰度指数较高，且有相似的群落结构。
（2） 河道底泥中微生物的优势菌主要有硫杆菌（Thiobacillus）、拟杆菌（Bacteroides）、脱硫菌属（Desulfatiglans，Desulfococcus，Desulfuromonas）、脱磷菌属（Desulfomicrobicum）以及反硝化菌属（Dechloromonas，Ferritrophicum），主要菌属占克隆文库的70%以上。
（3） 再生水中的氮、磷、有机物和Cu和Fe重金属等物质对底泥中反硝化菌属和脱硫菌属的多样性及其丰度具有显著的影响;补水对距离较远河道底泥微生物的影响较小，珠江口处底泥微生物受到潮汐的影响远大于补水作用;重金属Zn对其微生物群落结构的具有一定的影响。
参考文献：
[1] 于森，王明玉，刘佳，等.人工补水条件下的缺水河流生态修复综合评价方法[J].环境科学学报，2013，33（2）：626-634.
[2] 邸琰茗，王广煊，黄兴如，等.再生水补水对河道底泥细菌群落组成与功能的影响[J].环境科学，2017，38（2）：743-751.
[3] 阴星望，田伟，丁一，等.丹江口库区表层沉积物细菌多样性及功能预测分析[J].湖泊科学，2018，30（4）：1052-1063.
[4] WASSEN M J，BARENDREGT A.Topographic position and water chemistry of fens in a Dutch river plain[J].Journal of Vegetation Science，1992，3（4）：447-456.
[5] 万甜，何梦夏，任杰辉，等.渭河流域水体细菌群落的环境响应及生态功能预测[J].环境科学，2019，40（8）：3588-3595.
[6] 王鹏，肖汉玉，袁瑞强，等.鄱阳湖入湖河口沉积物真菌群落结构[J].环境科学学报，2018，38（5）：1949-1956.
[7] 赵阳国，任南琪，王爱杰，等.有机污染物对水体真细菌群落结构的影响[J].微生物学报，2007，47（2）：313-318.
[8] 王莹.污染河流中微生物群落结构的空间变化解析[D].长春：东北师范大学，2008.
[9] WAKELIN S A，COLLOFF M J，KOOKANA R S.Effect of wastewater treatment plant effluent on microbial function and community structure in the sediment of a freshwater stream with variable seasonal flow[J].Applied and Environmental Microbiology，2008，74（9）：2659-2668. [10] BANIULYTE D，FAVILA E，KELLY J.Shifts in microbial community composition following surface application of dredged river sediments[J].Microbial Ecology，2009，57（1）：160-169.
[11] 马栋山，郭羿宏，张琼琼，等.再生水补水对河道底泥细菌群落结构的影响[J].生态学报，2014，35（20）：6742-6749.
[12] BATES S T，CLEMENTE J C，FLORES G E，et，al.Global biogeography of highly diverse protistan communities in soil[J].The ISME Journal，2013，7（3）：652-659.
[13] GUO Y H，GONG H L，GUO X Y.Rhizosphere bacterial community of Typhaangustifolia L.and water quality in a river wetland supplied with reclaimed water[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2015，99（6）：2883-2893.
[14] 陈兆进，丁传雨，朱静亚，等.丹江口水库枯水期浮游细菌群落组成及影响因素研究[J].中国环境科学，2017，37（1）：336-344.
[15] 王鹏，陈波，张华.基于高通量测序的鄱阳湖典型湿地土壤细菌群落特征分析[J].生态学报，2017，37（5）：1650-1658.
[16] DRURY B，ROSI-MARSHALL E，KELLY J J.Wastewater treatment effluent reduces the abundance and diversity of benthic bacterial communities in urban and suburban rivers[J].Applied and Environmental Microbiology，2013，79（6）：1897-1905.
[17] 鮑林林，陈永娟，王晓燕.北运河沉积物中氨氧化微生物的群落特征[J].中国环境科学，2015，35（1）：179-189.
[18] 程豹，望雪，徐雅倩，等.澜沧江流域浮游细菌群落结构特征及驱动因子分析[J].环境科学，2018，39（8）：3649-3659.
[19] 刘晋仙，李毳，景炬辉，等.中条山十八河铜尾矿库微生物群落组成与环境适应性[J].环境科学，2017，38（1）：318-326.
（编辑：刘 媛）
Influence of reclaimed water replenishment on bacterial community structure in river sediment
TONG Xiaohui1，WANG Yinlong2，LIU Xiaoning2，SU Yuzheng2
（1.China Communications First Highway Survey and Design Institute Co.，Ltd.，Xi′an 710065，China; 2.Xi′an Zhongjiao Environmental Engineering Co.，Ltd.，Xi′an 710065，China）
Abstract：
To clarify the influence of reclaimed water replenishment on the bacterial community structure of river sediments，the reclaimed water replenishment of the Xixiang River in Shenzhen City was taken as the research object，based on the analysis of the physical and chemical indicators of 8 sediment samples in the river channel，the Illumina high-throughput sequencing technology was used to explore the spatial difference in the bacterial community structure of the sediment after the reclaimed water in the river channel and its impact on environmental factors.In addition，the formation reasons for the spatial difference of the bacterial community structure are analyzed by redundancy analysis method.The analysis results show the sediment in the middle and lower reaches of the Xixiang River contains a variety of pollutants，and the heavy metal pollution is more serious in the middle reaches;there are significant spatial differences in the bacterial community structure and diversity in river sediments，and a high diversity of microorganisms in the bottom mud near the water replenishment port;the dominant bacteria in the river sediments are Thiobacillus，Bacteroides，Desulfatiglans，Desulfococcus，Desulfuromonas，Desulfomicrobicum，and denitrifying bacteria（Dechloromonas，Ferritrophicum），which accounts for more than 70% of the cloned library;Nitrogen，phosphorus，organics，and heavy metals such as Cu and Fe in the reclaimed water are responsible for the diversity and abundance of denitrifying bacteria and desulfurizing bacteria in the sediments near the water intake，it has a significant effect on the degree，but it has little effect on microorganisms in the sediments of the Pearl River Estuary.
Key words：
reclaimed water replenishment;bacterial community structure;sediment;heavy metal;Xixiang River