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【中图分类号】R730.5【文献标识码】A【文章编号】1550-1868（2014）10
【摘要】目的：探讨冬凌草甲素对P糖蛋白（P-gp）介导的红白血病多药耐药的逆转作用及其可能的分子机制。方法 采用二苯基溴化四氮唑蓝（MTT）法检测人红白血病细胞株加药后的增殖，碘化丙啶（PI）染色法检测细胞凋亡率，Westernblot法检测P-AKT和 P-gp的表达量。结果 冬凌草甲素合用阿霉素处理细胞（k562/A02细胞株）48h，阿霉素的浓度在0.05～5ug/ml 时，加入冬凌草甲素25umol/l，耐药细胞生存率下降明显（P<0.05），尤以阿霉素0.25ug/ml和冬凌草甲素25umol/l二者联合使用时耐药细胞生存率下降最明显。结论 冬凌草甲素不增加阿霉素对K562/A02 细胞毒性作用；对于K562/A02细胞株，冬凌草甲素明显增加阿霉素细胞毒性；冬凌草甲素明显抑制了p-Akt和 P-gp蛋白的表达。
【关键词】冬凌草甲素；P糖蛋白；阿霉素；多药耐药；逆转
急性白血病（Acute Leukemia）是血液系统中的一种恶性疾病或称为血癌，临床上治疗常采用阿霉素基础上联合阿糖胞苷化疗[1]，然而肿瘤多药耐药性的出现严重影响了红白血病的治疗效果，抑制或者逆转红白血病多药耐药对于红白血病的治疗具有重要意义[2]。冬凌草甲素前期研究发现，具有良好的抗肿瘤作用。
1材料与方法
1.1材料 冬凌草甲素、二苯基溴化四氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）均购自美国 Sigma公司，阿霉素（Adria mycin，ADR）购自深圳万乐药业公司。DMEM培养基购自 Gibco公司，红白血病耐药株K562/A02由上海拜力生物科技有限公司提供。细胞在37℃，5%CO2條件下培养，初始时在含0.5mg/l 浓度的阿霉素、10%胎牛血清的 DMEA培养基中培养，实验前2d换无药培养基培养。
1.2方法
1.2.1药物配制冬凌草甲素溶解在DMSO后，采用无血清培养基配成药物浓度5×10mol/L储备液，使DMSO终浓度 <0.1%（V/V），贮存液置于 -20℃冰箱中避光保存。用 5%葡萄糖溶液将阿霉素配成10mg/ml的稀释液，置于 -4℃冰箱中保存，使用前用 10%小牛血清的RPMI1640培养基稀释成所需药物浓度。
1.2.2 MTT法将对数生长期的细胞以 2×10个/mL浓度接种于96孔培养板中，每孔体积200 μg/L。培养箱中培养24h后，吸尽每孔培养液，实验组Ⅰ分别加入不同浓度的阿霉素，实验组Ⅱ在加入不同浓度的阿霉素后联合使用冬凌草甲素。阿霉素终浓度分别为0.05，0.1，0.25，1.5，5ug/ml，冬凌草甲素终浓度为25umol/l。对照组Ⅰ为不加细胞仅含培养液的空白对照，对照组Ⅱ为仅加细胞的阴性对照，培养48h后，每孔加入20μl的MTT 液（浓度为5mg/ml），继续培养4h后终止培养，吸弃上清液后，每孔加150μl的DMSO，振荡器上振荡10min 使结晶物充分溶解。在酶标仪490nm 处的检测光吸收值（A），空白孔较零。以上各浓度组设3个复孔，取平均值，细胞存活率（IC）=实验组平均A值/阴性对照组平均A值。
1.2.3Westernblot法将处于对数生长期的K562/A02细胞调整细胞终浓度为1×10个/mL后，接种于25cm2培养瓶，分为2组：阿霉素组（0.25ug/ml）、阿霉素及冬凌草甲素组（0.25ug/ml、25umol/l）培养48h后，收集2组细胞，用Westernblot法检测pAKT、Akt和 P-gp的表达量。
1.2.4凋亡的检测将对数生长期的K562/A02细胞调整细胞浓度为1×10个/mL后，接种在6孔板中，分组方法：一组加入阿霉素，使其终浓度为血浆峰值浓度2.5g/mL；另外一组加入0.25g/mL阿霉素和2.0mol/mL冬凌草甲素，培养箱中培养48h。收集各组细胞，预冷75%乙醇固定，然后吹打成单细胞悬液，4℃放置30min后，在离心机上采用1000r/min离心20min；加磷酸盐缓冲液（PBS）离心，去除固定液，加入200LIRNaseA（1mg/mL）37℃水浴箱中孵育30min，然后每孔加入500ulPI（10g/mL）染色液，充分混匀，4℃条件下避光30min ，上机检测，记录激发波488nm 处红色荧光。用亚G1期法分析凋亡细胞，测定细胞的凋亡率，以Cell Quest 软件分析检测结果。公式计算细胞凋亡率：细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。
1.3统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，计量数据以（x±s）表示，采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1冬凌草甲素合用阿霉素对细胞生长的影响作用 处理48h，阿霉素的浓度在0.05～5ug/ml时，加入冬凌草甲素25 umol/l，耐药细胞生存率下降明显（P<0.05），尤以阿霉素0.25 ug/ml和冬凌草甲素25umol/l作用时耐药细胞生存率下降最明显，见图1。
2.2阿霉素及冬凌草甲素对K562/A02细胞凋亡率的影响 阿霉素及冬凌草甲素对 K562/A02细胞凋亡率的影响见图2。结果显示，单用阿霉素组细胞的凋亡率为（13.1±2.3）%，采用在阿霉素基础上联合使用冬凌草甲素后细胞凋亡率为（21.6±3.2）%，与单独使用阿霉素比，阿霉素与冬凌草甲素联合使用诱导细胞凋亡的作用显著增强（P<0.05）。
2.3 冬凌草甲素对K562/A02细胞的p-Akt、Akt和P-gp表达的影响 冬凌草甲素对K562/A02细胞的p-Akt、Akt和 P-gp表达的影响详见表1及图3。与单用阿霉素0.25ug/ml相比，联合使用冬凌草甲素后p-Akt和P-gp的表达量明显降低（P<0.05），2组间 Akt的表达量差异无统计学意义（P>0.05）。3讨论
前期大量研究显示磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶信号转导通路，通过诱导肿瘤细胞的增殖、抗凋亡、促进肿瘤血管的形成及拮抗放化疗等作用在肿瘤的演变过程中起着重要的作用，靶向作用于Akt的药物对于肿瘤的治疗具有重要意义，本研究阐明了冬凌草甲素逆转红白血病MDR可能的分子作用机制，为寻找安全、高效、低毒、天然的肿瘤靶向治疗药物提供重要实验依据，将为开拓冬凌草甲素抗肿瘤治疗的新领域提供了新的思路，临床应用前景广阔。
[基金项目] 湖南省科技厅科研项目（项目编号：2013sk3278）
参考文献
[1]Adamusg，ChoiD，RaghunathA，etal.Signicance of Anti-retinal Autoantibodies in Cancer associatedRetinopathy with Gynecologicaical Cancers [J].JClin Expophthalmol，2013，4（6）：307.
[2] Han Li，Zhang Yan，Wang Ning，Guo Xiaojuan， Zang Caihong，Jiang Jinhua，Ma Fang，Wang Qingduan*. Using rhodamine 123 accumulation in CD8 cells as asurrogate indicator to study the P-glycoprotein modulating effect of cepharanthine hydrochloride in vivo. J Biomed Biotechnol.2011.2011：281651.（IF=2.436）
【摘要】目的：探讨冬凌草甲素对P糖蛋白（P-gp）介导的红白血病多药耐药的逆转作用及其可能的分子机制。方法 采用二苯基溴化四氮唑蓝（MTT）法检测人红白血病细胞株加药后的增殖，碘化丙啶（PI）染色法检测细胞凋亡率，Westernblot法检测P-AKT和 P-gp的表达量。结果 冬凌草甲素合用阿霉素处理细胞（k562/A02细胞株）48h，阿霉素的浓度在0.05～5ug/ml 时，加入冬凌草甲素25umol/l，耐药细胞生存率下降明显（P<0.05），尤以阿霉素0.25ug/ml和冬凌草甲素25umol/l二者联合使用时耐药细胞生存率下降最明显。结论 冬凌草甲素不增加阿霉素对K562/A02 细胞毒性作用；对于K562/A02细胞株，冬凌草甲素明显增加阿霉素细胞毒性；冬凌草甲素明显抑制了p-Akt和 P-gp蛋白的表达。
【关键词】冬凌草甲素；P糖蛋白；阿霉素；多药耐药；逆转
急性白血病（Acute Leukemia）是血液系统中的一种恶性疾病或称为血癌，临床上治疗常采用阿霉素基础上联合阿糖胞苷化疗[1]，然而肿瘤多药耐药性的出现严重影响了红白血病的治疗效果，抑制或者逆转红白血病多药耐药对于红白血病的治疗具有重要意义[2]。冬凌草甲素前期研究发现，具有良好的抗肿瘤作用。
1材料与方法
1.1材料 冬凌草甲素、二苯基溴化四氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）均购自美国 Sigma公司，阿霉素（Adria mycin，ADR）购自深圳万乐药业公司。DMEM培养基购自 Gibco公司，红白血病耐药株K562/A02由上海拜力生物科技有限公司提供。细胞在37℃，5%CO2條件下培养，初始时在含0.5mg/l 浓度的阿霉素、10%胎牛血清的 DMEA培养基中培养，实验前2d换无药培养基培养。
1.2方法
1.2.1药物配制冬凌草甲素溶解在DMSO后，采用无血清培养基配成药物浓度5×10mol/L储备液，使DMSO终浓度 <0.1%（V/V），贮存液置于 -20℃冰箱中避光保存。用 5%葡萄糖溶液将阿霉素配成10mg/ml的稀释液，置于 -4℃冰箱中保存，使用前用 10%小牛血清的RPMI1640培养基稀释成所需药物浓度。
1.2.2 MTT法将对数生长期的细胞以 2×10个/mL浓度接种于96孔培养板中，每孔体积200 μg/L。培养箱中培养24h后，吸尽每孔培养液，实验组Ⅰ分别加入不同浓度的阿霉素，实验组Ⅱ在加入不同浓度的阿霉素后联合使用冬凌草甲素。阿霉素终浓度分别为0.05，0.1，0.25，1.5，5ug/ml，冬凌草甲素终浓度为25umol/l。对照组Ⅰ为不加细胞仅含培养液的空白对照，对照组Ⅱ为仅加细胞的阴性对照，培养48h后，每孔加入20μl的MTT 液（浓度为5mg/ml），继续培养4h后终止培养，吸弃上清液后，每孔加150μl的DMSO，振荡器上振荡10min 使结晶物充分溶解。在酶标仪490nm 处的检测光吸收值（A），空白孔较零。以上各浓度组设3个复孔，取平均值，细胞存活率（IC）=实验组平均A值/阴性对照组平均A值。
1.2.3Westernblot法将处于对数生长期的K562/A02细胞调整细胞终浓度为1×10个/mL后，接种于25cm2培养瓶，分为2组：阿霉素组（0.25ug/ml）、阿霉素及冬凌草甲素组（0.25ug/ml、25umol/l）培养48h后，收集2组细胞，用Westernblot法检测pAKT、Akt和 P-gp的表达量。
1.2.4凋亡的检测将对数生长期的K562/A02细胞调整细胞浓度为1×10个/mL后，接种在6孔板中，分组方法：一组加入阿霉素，使其终浓度为血浆峰值浓度2.5g/mL；另外一组加入0.25g/mL阿霉素和2.0mol/mL冬凌草甲素，培养箱中培养48h。收集各组细胞，预冷75%乙醇固定，然后吹打成单细胞悬液，4℃放置30min后，在离心机上采用1000r/min离心20min；加磷酸盐缓冲液（PBS）离心，去除固定液，加入200LIRNaseA（1mg/mL）37℃水浴箱中孵育30min，然后每孔加入500ulPI（10g/mL）染色液，充分混匀，4℃条件下避光30min ，上机检测，记录激发波488nm 处红色荧光。用亚G1期法分析凋亡细胞，测定细胞的凋亡率，以Cell Quest 软件分析检测结果。公式计算细胞凋亡率：细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。
1.3统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，计量数据以（x±s）表示，采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1冬凌草甲素合用阿霉素对细胞生长的影响作用 处理48h，阿霉素的浓度在0.05～5ug/ml时，加入冬凌草甲素25 umol/l，耐药细胞生存率下降明显（P<0.05），尤以阿霉素0.25 ug/ml和冬凌草甲素25umol/l作用时耐药细胞生存率下降最明显，见图1。
2.2阿霉素及冬凌草甲素对K562/A02细胞凋亡率的影响 阿霉素及冬凌草甲素对 K562/A02细胞凋亡率的影响见图2。结果显示，单用阿霉素组细胞的凋亡率为（13.1±2.3）%，采用在阿霉素基础上联合使用冬凌草甲素后细胞凋亡率为（21.6±3.2）%，与单独使用阿霉素比，阿霉素与冬凌草甲素联合使用诱导细胞凋亡的作用显著增强（P<0.05）。
2.3 冬凌草甲素对K562/A02细胞的p-Akt、Akt和P-gp表达的影响 冬凌草甲素对K562/A02细胞的p-Akt、Akt和 P-gp表达的影响详见表1及图3。与单用阿霉素0.25ug/ml相比，联合使用冬凌草甲素后p-Akt和P-gp的表达量明显降低（P<0.05），2组间 Akt的表达量差异无统计学意义（P>0.05）。3讨论
前期大量研究显示磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶信号转导通路，通过诱导肿瘤细胞的增殖、抗凋亡、促进肿瘤血管的形成及拮抗放化疗等作用在肿瘤的演变过程中起着重要的作用，靶向作用于Akt的药物对于肿瘤的治疗具有重要意义，本研究阐明了冬凌草甲素逆转红白血病MDR可能的分子作用机制，为寻找安全、高效、低毒、天然的肿瘤靶向治疗药物提供重要实验依据，将为开拓冬凌草甲素抗肿瘤治疗的新领域提供了新的思路，临床应用前景广阔。
[基金项目] 湖南省科技厅科研项目（项目编号：2013sk3278）
参考文献
[1]Adamusg，ChoiD，RaghunathA，etal.Signicance of Anti-retinal Autoantibodies in Cancer associatedRetinopathy with Gynecologicaical Cancers [J].JClin Expophthalmol，2013，4（6）：307.
[2] Han Li，Zhang Yan，Wang Ning，Guo Xiaojuan， Zang Caihong，Jiang Jinhua，Ma Fang，Wang Qingduan*. Using rhodamine 123 accumulation in CD8 cells as asurrogate indicator to study the P-glycoprotein modulating effect of cepharanthine hydrochloride in vivo. J Biomed Biotechnol.2011.2011：281651.（IF=2.436）