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摘要：以无血清的RPMI-1640培养液灌洗奶牛腹腔，分离获取奶牛腹腔巨噬细胞，在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态，并通过瑞氏染色计算其纯度。结果表明，采用无血清的RPMI-1640培养液灌洗奶牛腹腔，能够获得较高纯度的巨噬细胞，能为奶牛胞内寄生菌存活机制的研究提供很好的试验材料。
关键词：奶牛；巨噬细胞；分离培养
中图分类号：S823.9+1；Q813文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）02-0038-03
巨噬细胞（Macrophage）为免疫活性细胞，是机体免疫系统的重要细胞，在机体固有和适应性免疫功能中扮演着极其重要的角色，可作为抗原呈递细胞在诱导特异性免疫反应中发挥重要作用，其产生的可溶性细胞活素类因子参与调节特异性免疫反应。巨噬细胞也是各类病原的靶细胞[1]，包括分支杆菌、沙门氏菌、衣原体等。
腹腔巨噬细胞是腹腔抗感染的第一道防线，是研究机体自然免疫和获得性免疫关系的重要研究材料。但是迄今为止的报道多为有关小动物如大鼠、豚鼠、小鼠的腹腔巨噬细胞的分离鉴定，绵羊[2]、猪[3]、牛[4]等大家畜也有肺泡巨噬细胞分离的报道，尚未见有关奶牛腹腔巨噬细胞分离鉴定的方法。因此，本研究拟运用RPMI-1640培养液灌洗奶牛腹腔的方法，获得高纯度、高活性的腹腔巨噬细胞并进行相关鉴定，为下一步构建奶牛巨噬细胞噬菌体文库和以巨噬细胞为模型研究奶牛免疫机制奠定基础。
1材料与方法
1.1主要试剂和仪器
RPMI-1640培养基购自Hyclone，小牛血清购自天津灏洋生物工程公司，酸性磷酸酶染液、α-醋酸萘酚酯酶染液，HE染液试剂盒购自南京建成科技有限公司，瑞氏-姬姆萨染色液购自济南百博生物技术有限公司；仪器主要有CO2培养箱、倒置显微镜。
1.2奶牛腹腔巨噬细胞的分离培养
购15日龄雄性奶牛1只，平躺保定，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液500 ml，轻柔奶牛腹部3～5 min，静置7～10 min后，用50 ml注射器抽取腹腔液。离心5 min（1 000 r/min），弃上清，用PBS洗涤3遍，再用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调节细胞浓度至2×106个/ml，接种于培养瓶及6孔培养板，置于37℃、5%CO2培养箱培养2 h，弃上清液，用不含小牛血清的RPMI-1640培养液漂洗2遍，然后加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃、5%CO2培养箱继续培养，并作相关染色和鉴定。
1.3培养细胞的形态学观察
体外培养6 h后，将培养瓶置于倒置显微镜下观察贴壁细胞形态；取已铺满细胞的爬片，晾干后进行姬姆萨染色，光学显微镜下观察细胞形态。
1.4奶牛腹腔巨噬细胞HE染色
取出细胞爬片，固定晾干，按照说明进行染色。
1.5奶牛腹腔巨噬细胞酶化学测定
1.5.1酸性磷酸酶染色（CACP） 取出细胞爬片，固定，晾干，按照说明进行染色。每片计数200个细胞，共观察5片，计算阳性率（胞浆内有棕红色颗粒沉淀物为阳性，胞浆内粉红色为阴性）。
1.5.2非特异性酯酶染色 取出细胞爬片，固定，晾干，放入含10%α-醋酸萘酯的基质液（pH=6.3）中孵育1 h，流水冲洗3 min，晾干。甲基绿复染3 min，流水冲洗，晾干镜检。每片计数200个细胞，共观察5片，并计算阳性率（胞质内有灰黑色沉淀物为阳性，胞质内无沉淀物为阴性。2结果与分析
2.1奶牛巨噬细胞培养及形态特性
关键词：奶牛；巨噬细胞；分离培养
中图分类号：S823.9+1；Q813文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）02-0038-03
巨噬细胞（Macrophage）为免疫活性细胞，是机体免疫系统的重要细胞，在机体固有和适应性免疫功能中扮演着极其重要的角色，可作为抗原呈递细胞在诱导特异性免疫反应中发挥重要作用，其产生的可溶性细胞活素类因子参与调节特异性免疫反应。巨噬细胞也是各类病原的靶细胞[1]，包括分支杆菌、沙门氏菌、衣原体等。
腹腔巨噬细胞是腹腔抗感染的第一道防线，是研究机体自然免疫和获得性免疫关系的重要研究材料。但是迄今为止的报道多为有关小动物如大鼠、豚鼠、小鼠的腹腔巨噬细胞的分离鉴定，绵羊[2]、猪[3]、牛[4]等大家畜也有肺泡巨噬细胞分离的报道，尚未见有关奶牛腹腔巨噬细胞分离鉴定的方法。因此，本研究拟运用RPMI-1640培养液灌洗奶牛腹腔的方法，获得高纯度、高活性的腹腔巨噬细胞并进行相关鉴定，为下一步构建奶牛巨噬细胞噬菌体文库和以巨噬细胞为模型研究奶牛免疫机制奠定基础。
1材料与方法
1.1主要试剂和仪器
RPMI-1640培养基购自Hyclone，小牛血清购自天津灏洋生物工程公司，酸性磷酸酶染液、α-醋酸萘酚酯酶染液，HE染液试剂盒购自南京建成科技有限公司，瑞氏-姬姆萨染色液购自济南百博生物技术有限公司；仪器主要有CO2培养箱、倒置显微镜。
1.2奶牛腹腔巨噬细胞的分离培养
购15日龄雄性奶牛1只，平躺保定，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液500 ml，轻柔奶牛腹部3～5 min，静置7～10 min后，用50 ml注射器抽取腹腔液。离心5 min（1 000 r/min），弃上清，用PBS洗涤3遍，再用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调节细胞浓度至2×106个/ml，接种于培养瓶及6孔培养板，置于37℃、5%CO2培养箱培养2 h，弃上清液，用不含小牛血清的RPMI-1640培养液漂洗2遍，然后加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃、5%CO2培养箱继续培养，并作相关染色和鉴定。
1.3培养细胞的形态学观察
体外培养6 h后，将培养瓶置于倒置显微镜下观察贴壁细胞形态；取已铺满细胞的爬片，晾干后进行姬姆萨染色，光学显微镜下观察细胞形态。
1.4奶牛腹腔巨噬细胞HE染色
取出细胞爬片，固定晾干，按照说明进行染色。
1.5奶牛腹腔巨噬细胞酶化学测定
1.5.1酸性磷酸酶染色（CACP） 取出细胞爬片，固定，晾干，按照说明进行染色。每片计数200个细胞，共观察5片，计算阳性率（胞浆内有棕红色颗粒沉淀物为阳性，胞浆内粉红色为阴性）。
1.5.2非特异性酯酶染色 取出细胞爬片，固定，晾干，放入含10%α-醋酸萘酯的基质液（pH=6.3）中孵育1 h，流水冲洗3 min，晾干。甲基绿复染3 min，流水冲洗，晾干镜检。每片计数200个细胞，共观察5片，并计算阳性率（胞质内有灰黑色沉淀物为阳性，胞质内无沉淀物为阴性。2结果与分析
2.1奶牛巨噬细胞培养及形态特性