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摘要讨论了花药培养、幼胚培养、孤雌生殖、基因工程、外源DNA导入、化学诱变、物理诱变等技术在花生种质创新中的特点及其研究现状，分析了各种生物技术在花生种质创新中的结合途径。
关键词花生；种质创新；复合技术；应用
中图分类号S565.5.035文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）09-0088-02
IntegratingBreedingTechniquesandItsApplicationinPeanut
ZHAO Ming-senKANG Hong-mei
（Institute of Economic Crops，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Fenyang Shanxi 032200）
AbstractThe roles and charactersof various biotechniques，including anther culture，immature ermbryo culture，parthenogenesis，gene engineering，exogenous DNA introduction，chemical and physical inducing in the peanut breeding program were reviewed. Integrating breeding techniques adopted to the creation of new germplasm was analyzed.
Key wordspeanut；germplasm enhancement；integrating breeding techniques；application
花生是重要的植物食用油和蛋白质来源之一，具有较高的经济价值。中国是花生种植大国，拥有丰富的种质资源。与其他农作物一样，由于在育种中大量使用遗传背景相同或相似的亲本，导致栽培花生品种基因大量流失，使其遗传基础日益狭窄、遗传变异率低，对其产量的提高和品质的改良起到一定的限制作用。
花生生产的每一次突破，都与花生资源的发掘与利用密切相关。在我国1953—1995年间育成的所有花生品种中，亲本来源共348个，其中243个品种具有山东地方品种伏花生的血缘，218个品种具有地方品种狮头企的血缘，全国38个祖先亲本的核、质贡献分别达54.18%和56.84%。有利重组体的数量受遗传资源狭窄的限制，将会阻碍育种工作的进程，甚至使育种停滞不前[1-5]。目前花生种质资源的缺乏成为其育种的瓶颈，因此种质的创新工作成为花生育种中亟待解决的问题。
随着近代生物技术的兴起，人们创造变异和利用变异的能力大大提高。为了拓宽生物技术在农业科研与生产的应用，必须了解各种生物技术的优缺点及各种技术相结合的途径[6-8]，以便更好地将其应用于花生种质创新和育种研究领域。
1种质创新技术
1.1花药培养
花药培养是采用杂种1代的花药进行培养，育出的单倍体染色体加倍，从而得到纯合的个体。该方法易于鉴定和选择，而且省时省工，极大地提高了选种效率，对于基础研究和育种有重大意义。但至今在花生育种上没有花药培养技术成功的报道。Mroginski 等[9]（1980年）试验了A.hypogaea、 A.corretina、A.villosa和A.lignosa的花药培养，但未能获得再生植株。Bajaj 等（1981年）用A.hypogaea、A.glabrata及A.villosa的单核后期的花药为外植体，经愈伤组织获得了少量再生植株。Still 等（1987年）采用悬浮培养野花生雄蕊成功获得了花生再生小植株。
1.2幼胚培养
幼胚培养中广泛采用MS培养基作为基本培养基，而2，4-D是诱导愈伤组织产生的唯一激素。花生的幼胚可以用于产生有再生能力的愈伤组织。在培养过程中愈伤组织可以产生体细胞无性系变异[5，10]，因此其可作为一种创造花生新种质的方法。George等[11]（1993年）报道了基因型和外植体来源对体细胞胚形成的影响。Charleen等[12]（1994年）研究了不同激素种类对花生未成熟子叶体细胞胚形成的影响，得出2，4-D和NAA都能诱导未成熟子叶产生体细胞胚，但是2，4-D对体细胞胚的形成效果优于NAA[7-8，11，13]。Charleen 等（1995年）采用改良的MS和B5培养基诱导未成熟的子叶产生体细胞胚，指出培养基类型对细胞胚的形成没有明显的影响。
1.3孤雌生殖
利用孤雌生殖合成纯系进行育种，是单倍体育种的另一种途径。该方法直接获得二倍体的频率较高，并且逾越了染色体加倍的障碍，简便易行，不会出现花培苗越冬的问题。花生的孤雌生殖诱导可经过杂交、温度处理、射线处理、利用异源的细胞质、授粉前后的药物处理以及未授粉子房的培养等方式进行[12，14]，也可以不经过授粉直接通过药物处理进行获得。如采用MH和DMSO的组合、GA3、NAA-KT、N6培养基、6-BA等方法进行诱导。
1.4基因工程
花生的基因工程研究发展迅速，1994年印度Eapen研究获得转基因花生；国内学者在花生基因工程技术也取得了突破性进展，但还有许多路要走，还要逐步完善和使其更加实用化。
1.5外源DNA导入
该方法可以利用整体植株的卵细胞受精卵或者早期的胚细胞进行转化DNA，在单胚珠或者多胚珠的单双子叶植物上均可以应用[4，6]。可以通过任意选择生产中的当家品种进行外源DNA的导入，以达到目的性状的转移。该方法育种时间短，并且易于稳定。李钧等[15]用花生紫皮品种1218的花粉匀浆处理受体品种开封白皮的柱头，然后授与受体的新鲜花粉上，D1代的株高及某些结果性状出现明显变异。
1.6化学诱变
化学诱变效率大约是自发突变的100～1 000倍。在花生上运用的诱变剂主要是：N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）、硫酸二乙酯（DES）叠氮化钠（NaN3）、甲基磺酸乙酯和MNUA等。目前研究中使用最广和效果最好的化学诱变剂是EMS，该试剂诱导的突变大多是点突变。化学诱变采用的材料主要是种子、花粉等[2，9]。目前常用的处理方法是：用EMS等与轻质的石蜡油混合，然后制备成浓度为0.1%～0.2%的处理液，在合适的时间将被处理的花药涂抹在花丝上。化学诱变方法可用来进行自交系的性状改良，其特点是对供体的损伤少，诱变频率低，而且获得的有利突变较多。此为，化学诱变也可以用来进行抗性突变种质的筛选，进而获得新的抗性基因类型。
1.7物理诱变
物理诱变主要采用电离辐射，主要包括X射线、γ射线、β射线、中子等。目前应用最多的是γ射线和X射线。这2种射线穿透力较强[6，10]，可以激活原子内层的电子，使电子离子化可以与其他的原子或者分子相结合，造成原子结合方式的转变[16]。据报道，山东省花生研究所用Go60射线处理花生种子创造优异突变材料300多份，花育16是高产优质大花生新品种就是以辐射和杂交育种相结合育成的。此外，学者们在花生上也进行了一些体细胞杂交、原生质体等方面的研究[11-13]，但由于各方面条件的限制，目前在花生种质创新方面还没有得到实际的应用。
2种质创新技术结合与应用
2.1花药的诱变处理
在γ射线、X射线辐照以后，剥取花药接种于适当的培养基上，间隔2～3 d进行诱导愈伤组织，可以提高其出愈能力。该种方法能够避免射线对培养基的不良反应，但是可能会影响到培养的效果。可先将处于单核靠边期的花药接种到培养基上[9]，然后进行照射，以在一定程度上提高花粉发育的整齐度。
2.2离体培养结合化学诱变技术
植物的组织器官在离体培养过程中自身的遗传性会发生改变，利用该特点可以应用于种质的创新，进行植物品种的改良。两者的结合表现出以下优点：单细胞的培养突变可以迅速表现出来，而且其表现不受相邻细胞的干扰，不会出现嵌和体现象[4，7]；培养密度高，极大地提高了选择的频率，有利于减少土地占用和人力消耗；选用适当的选择剂，能够有效地从混合细胞中选择突变细胞。
2.3愈伤组织导入外源DNA
研究表明，任何具有活跃的代谢活动和持续分裂的地方都具有增加外源DNA导入频率的作用。因此，采取向愈伤组织滴加一定量的DNA溶液的方法，促使DNA的导入[17-18]。比如，利用花粉管通道技术，在形成受精卵而进行的持续胚的分化过程中，在植物分生组织活跃的生长点附近就具有吸收外源DNA的可能性[3]。愈伤组织的细胞间隔或者细胞壁比其活体的细胞甚至生长点的细胞具有更高的DNA转化的频率，从而使得愈伤组织具有持续分裂和增殖的活性。
2.4愈伤组织诱变处理
愈伤组织处于无菌的环境的条件下，可以直接照射生长于培养皿或者三角瓶中的愈伤组织，避免污染[1，4，7]，这是其与常规的材料的处理不同之处。愈伤组织诱变可以明显地增加变异的程度以及离体突变选择的应用，为其作为诱变处理的对象提供了可能。化学诱变也可采取直接向愈伤组织添加或者滴加诱变剂的方法。研究中应用的愈伤组织包括各种组织培养方法如花药培养、幼胚培养、胚培养、子房培养等得到的愈伤组织[19]。
3结语
在实际的育种过程中，单纯使用任何一种育种技术都不能达到预期育种的要求，需要将各种技术结合起来，才能取得较为理想的育种效果。现代生物技术与花生育种的结合趋势是利用物理方法、化学方法或者生物的方法创造变异或者引入外源的基因，然后通过生物技术的方法固定或转移该变异[7，14]，从而实现优良突变基因的重组，再通过常规育种的方法实现杂种优势。
4参考文献
[1] 瞿桢，吴新镛，周蓉，等.花生未成熟胚胎培养与植株再生[J].中国油料，1993（4）：15-18.
[2] 李爱民，吴琦.花生子叶的芽分化和植株再生[J].植物学通报，1988，5（3）：143-145.
[3] 梁连登，庄敏玉.花生茎尖的培养[J].中国油料，1981（4）：79-81.
[4] 瞿桢，廖伯寿，吴新镛，等.花生去子叶幼胚的丛生芽诱导和植株再生[J].中国油料，1994，16（4）：28-31.
[5] 方小平，许泽永，张宗义，等.花生小叶外植体植株再生及农杆菌介导的基因遗传转化[J].中国油料，1996（4）：52-56.
[6] 张书标，庄伟建，刘思衡，等.花生幼苗叶节丛生芽诱导和植株再生[J].福建农业大学学报，1998，27（1）：20-23.
[7] 周蓉，陈小媚，瞿桢，等.花生种间杂交及其胚营救技术研究[J].中国油料，1997，19（1）：19-22.
[8] 庄伟建，刘思衡，蔡俊迈，等.花生未成熟子叶丛生芽培养[J].花生科技，1997（3）：1-4.
[9] MROGINSKI L A，FERNANDEZ A. Obtainment of plantlets by In vitro culture of wild species of Arachis（Leguminosae）[J]. Oleagineux，1980（35）：89-92.
[10] BAJAJ Y P S，RAM A K，LABANA K S，et al.Regeneration of genetically variable plants from anther-derived callus of Arachis hypogaea and A. villosa[J]. Plant Sci Lett，1981（23）：35-39.
[11] GEORGE L，EAPEN S.Influence of genotype and explant source on somatic embryogenesis in peanut[J].Oleagineux，1993，48（8-9）：361-363.
[12] CHARLEEN M B，WETZSTEIN H Y.Influence of auxin type and concentration on peanut somatic embryogenesis[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1994（36）：361-368.
[13] STILL P E，PLATA M I，CAMPBELL R J，et al.Regeneration of fertile Arachis praguariensis plant from callus and suspension culture[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture，1987，9（1）：37-43.
[14] 吴琦.花生幼芽和下胚轴培养[J].植物生理学通讯，1981（4）：40-41.
[15] 李钧，杨余，李瑞娴，等.应用花粉匀浆物质诱导花生遗传性状变异的初步研究[J].遗传学报， 1991（5）：452-456，486.
[16] 马赛斐，张枫叶，王登琪，等.等离子体种子处理技术在花生上的应用效果[J].河南农业科学，2009（8）：54-55，58.
[17] 王传堂，杨新道，于翔，等. DNA分子标记技术在花生品种鉴定上的应用研究[J].华北农学报，2006，21（B11）：110-113.
[18] 刘风珍，万勇善，类承斌.国槐DNA导入花生栽培品种D8代数量性状分析[J].华北农学报，2006，21（6）：30-32.
[19] 汤丰收，张新友，董文召.河南省农科院花生研究的进展与成就[J].河南农业科学，2009（9）：82-86.
关键词花生；种质创新；复合技术；应用
中图分类号S565.5.035文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）09-0088-02
IntegratingBreedingTechniquesandItsApplicationinPeanut
ZHAO Ming-senKANG Hong-mei
（Institute of Economic Crops，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Fenyang Shanxi 032200）
AbstractThe roles and charactersof various biotechniques，including anther culture，immature ermbryo culture，parthenogenesis，gene engineering，exogenous DNA introduction，chemical and physical inducing in the peanut breeding program were reviewed. Integrating breeding techniques adopted to the creation of new germplasm was analyzed.
Key wordspeanut；germplasm enhancement；integrating breeding techniques；application
花生是重要的植物食用油和蛋白质来源之一，具有较高的经济价值。中国是花生种植大国，拥有丰富的种质资源。与其他农作物一样，由于在育种中大量使用遗传背景相同或相似的亲本，导致栽培花生品种基因大量流失，使其遗传基础日益狭窄、遗传变异率低，对其产量的提高和品质的改良起到一定的限制作用。
花生生产的每一次突破，都与花生资源的发掘与利用密切相关。在我国1953—1995年间育成的所有花生品种中，亲本来源共348个，其中243个品种具有山东地方品种伏花生的血缘，218个品种具有地方品种狮头企的血缘，全国38个祖先亲本的核、质贡献分别达54.18%和56.84%。有利重组体的数量受遗传资源狭窄的限制，将会阻碍育种工作的进程，甚至使育种停滞不前[1-5]。目前花生种质资源的缺乏成为其育种的瓶颈，因此种质的创新工作成为花生育种中亟待解决的问题。
随着近代生物技术的兴起，人们创造变异和利用变异的能力大大提高。为了拓宽生物技术在农业科研与生产的应用，必须了解各种生物技术的优缺点及各种技术相结合的途径[6-8]，以便更好地将其应用于花生种质创新和育种研究领域。
1种质创新技术
1.1花药培养
花药培养是采用杂种1代的花药进行培养，育出的单倍体染色体加倍，从而得到纯合的个体。该方法易于鉴定和选择，而且省时省工，极大地提高了选种效率，对于基础研究和育种有重大意义。但至今在花生育种上没有花药培养技术成功的报道。Mroginski 等[9]（1980年）试验了A.hypogaea、 A.corretina、A.villosa和A.lignosa的花药培养，但未能获得再生植株。Bajaj 等（1981年）用A.hypogaea、A.glabrata及A.villosa的单核后期的花药为外植体，经愈伤组织获得了少量再生植株。Still 等（1987年）采用悬浮培养野花生雄蕊成功获得了花生再生小植株。
1.2幼胚培养
幼胚培养中广泛采用MS培养基作为基本培养基，而2，4-D是诱导愈伤组织产生的唯一激素。花生的幼胚可以用于产生有再生能力的愈伤组织。在培养过程中愈伤组织可以产生体细胞无性系变异[5，10]，因此其可作为一种创造花生新种质的方法。George等[11]（1993年）报道了基因型和外植体来源对体细胞胚形成的影响。Charleen等[12]（1994年）研究了不同激素种类对花生未成熟子叶体细胞胚形成的影响，得出2，4-D和NAA都能诱导未成熟子叶产生体细胞胚，但是2，4-D对体细胞胚的形成效果优于NAA[7-8，11，13]。Charleen 等（1995年）采用改良的MS和B5培养基诱导未成熟的子叶产生体细胞胚，指出培养基类型对细胞胚的形成没有明显的影响。
1.3孤雌生殖
利用孤雌生殖合成纯系进行育种，是单倍体育种的另一种途径。该方法直接获得二倍体的频率较高，并且逾越了染色体加倍的障碍，简便易行，不会出现花培苗越冬的问题。花生的孤雌生殖诱导可经过杂交、温度处理、射线处理、利用异源的细胞质、授粉前后的药物处理以及未授粉子房的培养等方式进行[12，14]，也可以不经过授粉直接通过药物处理进行获得。如采用MH和DMSO的组合、GA3、NAA-KT、N6培养基、6-BA等方法进行诱导。
1.4基因工程
花生的基因工程研究发展迅速，1994年印度Eapen研究获得转基因花生；国内学者在花生基因工程技术也取得了突破性进展，但还有许多路要走，还要逐步完善和使其更加实用化。
1.5外源DNA导入
该方法可以利用整体植株的卵细胞受精卵或者早期的胚细胞进行转化DNA，在单胚珠或者多胚珠的单双子叶植物上均可以应用[4，6]。可以通过任意选择生产中的当家品种进行外源DNA的导入，以达到目的性状的转移。该方法育种时间短，并且易于稳定。李钧等[15]用花生紫皮品种1218的花粉匀浆处理受体品种开封白皮的柱头，然后授与受体的新鲜花粉上，D1代的株高及某些结果性状出现明显变异。
1.6化学诱变
化学诱变效率大约是自发突变的100～1 000倍。在花生上运用的诱变剂主要是：N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）、硫酸二乙酯（DES）叠氮化钠（NaN3）、甲基磺酸乙酯和MNUA等。目前研究中使用最广和效果最好的化学诱变剂是EMS，该试剂诱导的突变大多是点突变。化学诱变采用的材料主要是种子、花粉等[2，9]。目前常用的处理方法是：用EMS等与轻质的石蜡油混合，然后制备成浓度为0.1%～0.2%的处理液，在合适的时间将被处理的花药涂抹在花丝上。化学诱变方法可用来进行自交系的性状改良，其特点是对供体的损伤少，诱变频率低，而且获得的有利突变较多。此为，化学诱变也可以用来进行抗性突变种质的筛选，进而获得新的抗性基因类型。
1.7物理诱变
物理诱变主要采用电离辐射，主要包括X射线、γ射线、β射线、中子等。目前应用最多的是γ射线和X射线。这2种射线穿透力较强[6，10]，可以激活原子内层的电子，使电子离子化可以与其他的原子或者分子相结合，造成原子结合方式的转变[16]。据报道，山东省花生研究所用Go60射线处理花生种子创造优异突变材料300多份，花育16是高产优质大花生新品种就是以辐射和杂交育种相结合育成的。此外，学者们在花生上也进行了一些体细胞杂交、原生质体等方面的研究[11-13]，但由于各方面条件的限制，目前在花生种质创新方面还没有得到实际的应用。
2种质创新技术结合与应用
2.1花药的诱变处理
在γ射线、X射线辐照以后，剥取花药接种于适当的培养基上，间隔2～3 d进行诱导愈伤组织，可以提高其出愈能力。该种方法能够避免射线对培养基的不良反应，但是可能会影响到培养的效果。可先将处于单核靠边期的花药接种到培养基上[9]，然后进行照射，以在一定程度上提高花粉发育的整齐度。
2.2离体培养结合化学诱变技术
植物的组织器官在离体培养过程中自身的遗传性会发生改变，利用该特点可以应用于种质的创新，进行植物品种的改良。两者的结合表现出以下优点：单细胞的培养突变可以迅速表现出来，而且其表现不受相邻细胞的干扰，不会出现嵌和体现象[4，7]；培养密度高，极大地提高了选择的频率，有利于减少土地占用和人力消耗；选用适当的选择剂，能够有效地从混合细胞中选择突变细胞。
2.3愈伤组织导入外源DNA
研究表明，任何具有活跃的代谢活动和持续分裂的地方都具有增加外源DNA导入频率的作用。因此，采取向愈伤组织滴加一定量的DNA溶液的方法，促使DNA的导入[17-18]。比如，利用花粉管通道技术，在形成受精卵而进行的持续胚的分化过程中，在植物分生组织活跃的生长点附近就具有吸收外源DNA的可能性[3]。愈伤组织的细胞间隔或者细胞壁比其活体的细胞甚至生长点的细胞具有更高的DNA转化的频率，从而使得愈伤组织具有持续分裂和增殖的活性。
2.4愈伤组织诱变处理
愈伤组织处于无菌的环境的条件下，可以直接照射生长于培养皿或者三角瓶中的愈伤组织，避免污染[1，4，7]，这是其与常规的材料的处理不同之处。愈伤组织诱变可以明显地增加变异的程度以及离体突变选择的应用，为其作为诱变处理的对象提供了可能。化学诱变也可采取直接向愈伤组织添加或者滴加诱变剂的方法。研究中应用的愈伤组织包括各种组织培养方法如花药培养、幼胚培养、胚培养、子房培养等得到的愈伤组织[19]。
3结语
在实际的育种过程中，单纯使用任何一种育种技术都不能达到预期育种的要求，需要将各种技术结合起来，才能取得较为理想的育种效果。现代生物技术与花生育种的结合趋势是利用物理方法、化学方法或者生物的方法创造变异或者引入外源的基因，然后通过生物技术的方法固定或转移该变异[7，14]，从而实现优良突变基因的重组，再通过常规育种的方法实现杂种优势。
4参考文献
[1] 瞿桢，吴新镛，周蓉，等.花生未成熟胚胎培养与植株再生[J].中国油料，1993（4）：15-18.
[2] 李爱民，吴琦.花生子叶的芽分化和植株再生[J].植物学通报，1988，5（3）：143-145.
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[8] 庄伟建，刘思衡，蔡俊迈，等.花生未成熟子叶丛生芽培养[J].花生科技，1997（3）：1-4.
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[10] BAJAJ Y P S，RAM A K，LABANA K S，et al.Regeneration of genetically variable plants from anther-derived callus of Arachis hypogaea and A. villosa[J]. Plant Sci Lett，1981（23）：35-39.
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[12] CHARLEEN M B，WETZSTEIN H Y.Influence of auxin type and concentration on peanut somatic embryogenesis[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1994（36）：361-368.
[13] STILL P E，PLATA M I，CAMPBELL R J，et al.Regeneration of fertile Arachis praguariensis plant from callus and suspension culture[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture，1987，9（1）：37-43.
[14] 吴琦.花生幼芽和下胚轴培养[J].植物生理学通讯，1981（4）：40-41.
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[16] 马赛斐，张枫叶，王登琪，等.等离子体种子处理技术在花生上的应用效果[J].河南农业科学，2009（8）：54-55，58.
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[18] 刘风珍，万勇善，类承斌.国槐DNA导入花生栽培品种D8代数量性状分析[J].华北农学报，2006，21（6）：30-32.
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