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【摘要】 目的 探討乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝剂对假性血小板减少（PTCP）的影响及解决方法。方法：对8例患者用全血自动血液分析仪上进行分析，用EDTA-K2抗凝血,同时用手工计数血小板（PLT）作为参考值，并以不加抗凝剂的指血直接稀释后在全血自动血液分析仪上测定。结果 EDTA-K2抗凝血PLT计数结果与手工法相比，差异有统计学意义（P<0.001）;而手工法PLT计数结果与不使用抗凝剂指血结果相比,差异无统计学意义(P>0.05),患者加EDTA-K2抗凝血作涂片瑞-姬染色,发现血片中有大量PLT聚集,聚集的PLT大小不一,数量不等,而不加抗凝剂的患者指血,则无PLT无聚集现象。结论 EDTA-K2对PLT可产生聚集作用，引起PTCP。
【关键词】 血小板假性减少；血小板计数；乙二胺四乙酸
近年来,随着全自动血液分析仪的普及，全血细胞计数的精密度和准确度明显提高。而应用全自动血液分析仪时,最为广泛采用的抗凝剂是被国际血液学标准委员会(ICSH)认定的乙二胺四乙酸(EDTA)盐[1]。由于EDTA盐有时能引起血小板聚集,导致用EDTA-K2作为抗凝剂时出现PLT假性偏低现象，即EDTA依赖性血小板假性减少症(PTCP).这种假性的PLT计数会导致一些不必要的辅助检查,甚至引起误诊、误治[2]。我们通过对8例PTCP进行了分析讨论，以期选择科学、可行的检测方法，排除干扰因素，准确报告PLT计数结果。
1 资料与方法
1.1 检测对象 2009年8月～2010年8月EDTA-K2抗凝有血小板聚集的患者8例，其中男4例，女4例;年龄15～55岁，平均为34岁。
1.2仪器与试剂 深圳迈瑞公司BC-3000血细胞分析仪及仪器配套试剂，质控品是浙江省临检中心统一配送的室间血细胞质控物(天津美德太平洋科技有限公司 )，EDTA-K2真空抗凝管(温州市高德医疗器械有限公司)，盐酸稀释液、草酸铵血小板稀释液及瑞氏染液。
1.3方法
1.3.1 用质控物监控其稳定性，然后严格按照仪器操作规程用血液分析仪检测并记录EDTA-K2抗凝血的WBC、RBC及PLT的数值；
1.3.2 其次采集指血不使用任何抗凝剂直接稀释后在血液分析仪上用预稀释程度作测定；
1.3.3 然后采集患者末梢血20 μL加0.38 mL盐酸及草酸铵稀释液由有经验的主管技师进行手工WBC、RBC及PLT计数，并制备血涂片，观察血小板数量、形态及血小板聚集情况。
1.4统计学处理 数据以x±s表示，应用配对t检验。
2结果
2.1 BC-3200血细胞分析仪检测和手工计数WBC、RBC、PLT的结果(P<0.001)；而手工法PLT计数结果与不加抗凝剂的指血PLT计数结果相比，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
表1
2.2 对8例患者的EDTA-K2抗凝血作血涂片,瑞-姬染色后发现血片中有大量的PLT聚集,聚集的PLT大小不一,数量不等；而患者未加抗凝剂的指血直接涂片作瑞—姬染色，发现PLT分开散开，无PLT聚集现象。
3讨论
3.1 血液分析仪在各级医疗机构中已广泛应用,与手工法相比有操作迅速、准确等优点，但检测时若用EDTA盐作血液抗凝剂时，偶尔会引起PLT聚集，出现PLT假性减少，其发生率为0.07%~1.0%[3]。究其原因，系个别患者PLT可在EDTA螯合剂中于10S内聚集,而血液分析仪会误将凝集的PLT当作红细胞或白细胞计数。
3.2 EDTA-K2抗凝已在1993年被ICSH(International Council for Standardization in Haematology，国际血液学标准委员会)推荐用作血常规检测的抗凝剂。它对血液中细胞形态和血小板聚集性几乎均无影响，然而在临床的广泛使用中，它偶尔会引起血小板的聚集，且这种聚集不易被溶血素破坏，因为溶血素的主要成分是阳离子表面活性剂，其作用于细胞中的磷脂，使之溶解后与蛋白分离[4]，从而引起血小板假性减低(PTCP)，至今未发现该现象的发生有何病理、生理意义，也与特殊药物的作用无关。EDTA-K2诱导的血小板聚集可能与血小板表面存在某种隐匿性抗原有关。它可导致血小板活化，血小板形态发生变化，由正常的圆盘状变为圆球形，改变了血小板膜表面某种隐匿性抗原构象，与存在血浆中的自身抗体结合，激活细胞膜中的磷酸酯酶A2和磷脂酶C，使血小板膜磷脂水解并释放花生四烯酸、ADP、5-TH、胶原、凝血酶原、内源性钙离子等活性物质。这些物质能活化血小板纤维蛋白原受体，促使血小板与纤维蛋白原聚集成团[5]。对EDTA-K2抗凝血分别进行手工计数和迈瑞BC-3000血细胞分析仪计数，结果仪器法血小板计数明显低于手工法，仪器法白细胞计数明显高于手工法，差异均有显著性(P<0.01)，而红细胞变化不大，差异无显著性(P>0.05)。个别患者体外的EDTA-K2抗凝血在室温条件下发生EDTA依赖性凝集，血液分析仪对凝集体的结构不能辨别，而误以为是白细胞，所以造成血小板计数的偏低和白细胞计数的偏高。而EDTA-K2抗凝血涂片镜检可见大量聚集成堆的血小板，且多分布在片尾部。此时仪器所测的血小板计数和白细胞计数是错误的，应采取手工计数及镜检。
3.3 若实验室血液分析仪检测PLT显著减少,特别是低于50×109/L时，应酌情考虑使用枸橼酸钠抗凝或通过仪器预稀释功能检测患者指血,或用手工法计数。不仅要及时手工计数，还应该涂片观察细胞形态变化，确保检验结果的准确性。另外，采血的过程及血液和抗凝剂的比例都很重要，采血速度慢、多次穿刺和血液比例过高都可能引起血小板凝集，堵塞仪器而无法测得真实的结果。同时与临床取得联系，观察患者有与瘀点、斑点及其他出血现象，并加做凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血酶原时间（APTT）、纤维蛋白原（FIB）等项目，以排除出血倾向。从而给临床提供可靠的诊断依据，以免误诊，或做一些不必要的针对PLT减少的检查与治疗，增加患者负担。
参与文献
[1]徐志明，祁慧，李丰平。乙二胺四乙酸三钾导致血小板假性减少分析[J].检验医学与临床,2008,5(9):539-540
[2]陈虹.EDTA-K2抗凝可引起血小板假性减少2例分析[J].中国医药指南(学术版),2008，6(12)：160.
[3]孙杨，丘江.抗凝剂乙二胺四乙酸致血小板假性减少[J].检验医学与临床,2008，5(8)：504.
[4]Bizzaro N.EDTA-dependent pseudothrombocytopenia;a clini-cal and epidemiological study of 11 case,with 10-year follow up[J]. Am JH ematol,1995,50(2):103-109.
[5]Bragnani G,Bianconcini G,Brogna R,et al.pseudothrom bocytopenia; clinical connent on 37 case[J].M inerva MED,2001,92(1):13.
【关键词】 血小板假性减少；血小板计数；乙二胺四乙酸
近年来,随着全自动血液分析仪的普及，全血细胞计数的精密度和准确度明显提高。而应用全自动血液分析仪时,最为广泛采用的抗凝剂是被国际血液学标准委员会(ICSH)认定的乙二胺四乙酸(EDTA)盐[1]。由于EDTA盐有时能引起血小板聚集,导致用EDTA-K2作为抗凝剂时出现PLT假性偏低现象，即EDTA依赖性血小板假性减少症(PTCP).这种假性的PLT计数会导致一些不必要的辅助检查,甚至引起误诊、误治[2]。我们通过对8例PTCP进行了分析讨论，以期选择科学、可行的检测方法，排除干扰因素，准确报告PLT计数结果。
1 资料与方法
1.1 检测对象 2009年8月～2010年8月EDTA-K2抗凝有血小板聚集的患者8例，其中男4例，女4例;年龄15～55岁，平均为34岁。
1.2仪器与试剂 深圳迈瑞公司BC-3000血细胞分析仪及仪器配套试剂，质控品是浙江省临检中心统一配送的室间血细胞质控物(天津美德太平洋科技有限公司 )，EDTA-K2真空抗凝管(温州市高德医疗器械有限公司)，盐酸稀释液、草酸铵血小板稀释液及瑞氏染液。
1.3方法
1.3.1 用质控物监控其稳定性，然后严格按照仪器操作规程用血液分析仪检测并记录EDTA-K2抗凝血的WBC、RBC及PLT的数值；
1.3.2 其次采集指血不使用任何抗凝剂直接稀释后在血液分析仪上用预稀释程度作测定；
1.3.3 然后采集患者末梢血20 μL加0.38 mL盐酸及草酸铵稀释液由有经验的主管技师进行手工WBC、RBC及PLT计数，并制备血涂片，观察血小板数量、形态及血小板聚集情况。
1.4统计学处理 数据以x±s表示，应用配对t检验。
2结果
2.1 BC-3200血细胞分析仪检测和手工计数WBC、RBC、PLT的结果(P<0.001)；而手工法PLT计数结果与不加抗凝剂的指血PLT计数结果相比，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
表1
2.2 对8例患者的EDTA-K2抗凝血作血涂片,瑞-姬染色后发现血片中有大量的PLT聚集,聚集的PLT大小不一,数量不等；而患者未加抗凝剂的指血直接涂片作瑞—姬染色，发现PLT分开散开，无PLT聚集现象。
3讨论
3.1 血液分析仪在各级医疗机构中已广泛应用,与手工法相比有操作迅速、准确等优点，但检测时若用EDTA盐作血液抗凝剂时，偶尔会引起PLT聚集，出现PLT假性减少，其发生率为0.07%~1.0%[3]。究其原因，系个别患者PLT可在EDTA螯合剂中于10S内聚集,而血液分析仪会误将凝集的PLT当作红细胞或白细胞计数。
3.2 EDTA-K2抗凝已在1993年被ICSH(International Council for Standardization in Haematology，国际血液学标准委员会)推荐用作血常规检测的抗凝剂。它对血液中细胞形态和血小板聚集性几乎均无影响，然而在临床的广泛使用中，它偶尔会引起血小板的聚集，且这种聚集不易被溶血素破坏，因为溶血素的主要成分是阳离子表面活性剂，其作用于细胞中的磷脂，使之溶解后与蛋白分离[4]，从而引起血小板假性减低(PTCP)，至今未发现该现象的发生有何病理、生理意义，也与特殊药物的作用无关。EDTA-K2诱导的血小板聚集可能与血小板表面存在某种隐匿性抗原有关。它可导致血小板活化，血小板形态发生变化，由正常的圆盘状变为圆球形，改变了血小板膜表面某种隐匿性抗原构象，与存在血浆中的自身抗体结合，激活细胞膜中的磷酸酯酶A2和磷脂酶C，使血小板膜磷脂水解并释放花生四烯酸、ADP、5-TH、胶原、凝血酶原、内源性钙离子等活性物质。这些物质能活化血小板纤维蛋白原受体，促使血小板与纤维蛋白原聚集成团[5]。对EDTA-K2抗凝血分别进行手工计数和迈瑞BC-3000血细胞分析仪计数，结果仪器法血小板计数明显低于手工法，仪器法白细胞计数明显高于手工法，差异均有显著性(P<0.01)，而红细胞变化不大，差异无显著性(P>0.05)。个别患者体外的EDTA-K2抗凝血在室温条件下发生EDTA依赖性凝集，血液分析仪对凝集体的结构不能辨别，而误以为是白细胞，所以造成血小板计数的偏低和白细胞计数的偏高。而EDTA-K2抗凝血涂片镜检可见大量聚集成堆的血小板，且多分布在片尾部。此时仪器所测的血小板计数和白细胞计数是错误的，应采取手工计数及镜检。
3.3 若实验室血液分析仪检测PLT显著减少,特别是低于50×109/L时，应酌情考虑使用枸橼酸钠抗凝或通过仪器预稀释功能检测患者指血,或用手工法计数。不仅要及时手工计数，还应该涂片观察细胞形态变化，确保检验结果的准确性。另外，采血的过程及血液和抗凝剂的比例都很重要，采血速度慢、多次穿刺和血液比例过高都可能引起血小板凝集，堵塞仪器而无法测得真实的结果。同时与临床取得联系，观察患者有与瘀点、斑点及其他出血现象，并加做凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血酶原时间（APTT）、纤维蛋白原（FIB）等项目，以排除出血倾向。从而给临床提供可靠的诊断依据，以免误诊，或做一些不必要的针对PLT减少的检查与治疗，增加患者负担。
参与文献
[1]徐志明，祁慧，李丰平。乙二胺四乙酸三钾导致血小板假性减少分析[J].检验医学与临床,2008,5(9):539-540
[2]陈虹.EDTA-K2抗凝可引起血小板假性减少2例分析[J].中国医药指南(学术版),2008，6(12)：160.
[3]孙杨，丘江.抗凝剂乙二胺四乙酸致血小板假性减少[J].检验医学与临床,2008，5(8)：504.
[4]Bizzaro N.EDTA-dependent pseudothrombocytopenia;a clini-cal and epidemiological study of 11 case,with 10-year follow up[J]. Am JH ematol,1995,50(2):103-109.
[5]Bragnani G,Bianconcini G,Brogna R,et al.pseudothrom bocytopenia; clinical connent on 37 case[J].M inerva MED,2001,92(1):13.