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[摘要]目的：研究高分子聚合体表面润湿性对成纤维细胞初期贴附能力的影响。方法：使用薄膜等离子体聚合法在圆形盖玻片表面生成六甲基二硅氧烷(Hexamethyldisiloxane, HMDSO)薄膜聚合体，然后用低温氧等离子体轰击聚合体表面，根据轰击时间的不同形成一系列的不同润湿性表面，将成纤维细胞系L929接种于不同润湿性表面，观察6h、12h时细胞的贴附率，并观察细胞的形态。结果：随着氧等离子体轰击时间的增加，HMDSO聚合体表面接触角从106°下降为0°，显示表面由高度憎水变为高度亲水。成纤维细胞在亲水表面较憎水表面有更高的早期贴附率，细胞伸展更充分。结论：高分子聚合体的表面润湿性对成纤维细胞的早期贴附和伸展有显著的影响。亲水性表面更有利于细胞的早期贴附和伸展。
[关键词]表面润湿性；等离子体聚合物；接触角；细胞贴附
[中图分类号]Q647[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）07-1018-03
Adhesion of fibroblast on polymer surfaces with Different Wettability
WEI Jian-hua 1，FENG Xing-hua1，ZHANG Jun-rui1，LIU Bao-lin3, Masao YOS HINARI2
(1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery,School of Stomatology,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China; 2.Department of Dental Materials Science; Tokyo Dental College，1-2-2 Masago; Mihama-ku, Chiba 261-8502,Japan)
Abstract:ObjectiveTo study the initial stage cell attachment of fibroblast on polymer surfaces with different wettability. MethodsHexamethyldisiloxane polymer film was obtained by plasma polymerization method on coverslips. Oxygen (O2) plasma treatment was employed to modify the surfaces with different time so that a series of surface with different wettability were produced. L929 cell were cultured on these surfaces to observe the cell attachment rate and cell spreading in 6 and 12 hours. ResultsThe contact angle of HMDSO surface decreased gradually with the increasing duration of the plasma treatment. Fibroblasts tended to attach more on hydrophilic surfaces than on hydrophobic ones. ConclusionCells initial attachment and spreading is significantly affected by polymer surface wettability. The hydrophilic surfaces shows more favorable for cell initial attachment than the hydrophobic ones.
Key words:surface wettability; plasma-polymerized polymer; contact angle; cell attachment
生物高分子聚合材料在整形美容外科有着广泛的应用，这些材料的生物学相容性对于手术的成败有着重要影响。这些聚合材料的表面性状研究也一直是生物材料研究关注的热点，其中表面能是影响材料生物学相容性的重要因素之一[1-5]。表面能可以用表面润湿性来体现，有研究表明表面润湿性对细胞的生物学相容性有一定的影响。本课题研究了高分子聚合体表面润湿性对成纤维细胞早期贴附和伸展的影响。
1材料和方法
1.1 六甲基二硅氧烷聚合体表面的制作：使用薄膜等离子体聚合法（plasma polymerization），在圆形盖玻片（Thermanox, Nalge Nunc International, USA）表面生成六甲基二硅氧烷薄膜聚合体。具体步骤如下：①将圆形15mm盖玻片置入等离子聚合仪(VEP-1000,ULVAC Inc,Japan)，聚合温度为125℃；②将聚合腔抽真空，真空度设定5×10-3 Pa。3 HMDSO单体被加热70℃气化后按照流量为45sccm (standard cubic centimeter/min,ml/min)被引入聚合腔内；③当腔内压力达到10Pa且稳定以后，开始等离子放电过程（frequency generator at 13.56 MHz），输出功率200W，放电时间10min；④聚合结束后将氮气引入反应腔至大气压。处理过的盖玻片表面生成厚度约为100nm的HMDSO聚合薄膜。将处理好的盖玻片表面以氮气清洁后放置到细胞培养用灭菌24孔板内备用。
1.2 低温等离子体处理：将部分步骤1.1制作的HMDSO盖玻片重新引入等离子聚合仪的反应腔内，处理面向上，用低能量氧进行低温等离子轰击，处理条件为功率10W, 腔内压强1.8 Pa，流量 50 sccm。处理时间分别为20s，40s和80s。 轰击后将氮气引入反应腔至大气压，取出后进行表面接触角的测量。
1.3 表面接触角测定：每种条件取3个样本，用接触角测定仪（CA-P, Kyowa Interface Co. Ltd., Japan）测定试样的表面接触角，在每个标本的3个不同位置滴双蒸水10μl，读取接触角并取平均值。
1.4 细胞贴附率测定：将以上处理的三组标本及未行氧等离子体处理的标本每种6片放入24孔细胞培养板中。将L929细胞配制2.5×104cells/ml的细胞悬液，每个培养孔内加入细胞悬液1ml，相当于每个试样上接种的细胞数量为2.5× 104。在细胞培养箱内培养时间在第6h和第12h时，每组标本取出3片，以PBS轻轻漂洗未贴附的细胞后，置入新的24孔板内，每个孔内加0.5ml1%胰蛋白酶溶液，消化细胞5min后加入0.5ml MEM+10% FBS终止消化作用，每孔内溶液量为1ml。细胞计数采用细胞技术仪Coulter Counter Z1 (Beckman Coulter, Inc. USA)。取平均值作为细胞贴附值，将细胞贴附数除以接种基数后可以得出细胞贴附率。
1.5 细胞形态电镜观察：将部分试样用于电镜标本观察，首先将标本用PBS漂洗未贴附的细胞，用2%多聚甲醛固定后，系列酒精脱水，冻干喷金后用扫描电镜(JSM-6340F；JEOL, Japan)观察细胞形态。
1.6 统计分析：采用SPSS11.0软件对实验数据进方差分析。
2结果
2.1 表面接触角数据：HMDSO聚合体表面的接触角为106°，属于高度疏水性表面。经过低温氧或氮等离子体处理后表面接触角明显降低，在氧等离子体处理80s后表面接触角降为0°，转化为高度亲水性表面。接触角与等离子体处理时间呈现负相关性。如表1所示。
2.2 细胞贴附测定：L929细胞贴附测定结果如表2所示，细胞贴附率见图1所示。结果表明在接触角为106°的HMDSO表面上细胞贴附很差，而随着表面润湿性的增加（接触角减小），细胞贴附显著性增高。
2.3 扫描电镜结果：如图2所示，可见在106°的HMDSO表面上细胞呈球形，细胞伸展很差，而在氧等离子体处理80s，接触角为0°的表面上，细胞伸展良好，呈片状。
3讨论
在整形美容外科领域，生物高分子材料应用越来越广泛，从软组织扩张器、输血材料到衬垫材料。有关材料学表面的研究也层出不穷，实验证明，材料的许多表面性状都直接影响到其生物学相容性，如表面形貌、表面电荷、表面能、表面基团等等都会影响到细胞的贴附增殖或者蛋白质的粘附[1,2,5]。相应的，学者们使用了许多方法来改变生物材料的表面性状以改善其生物学相容性，其中低温等离子体处理越来越引起研究者的关注。在本研究中我们着重观察了氧及氮等离子体处理对六甲基二硅氧烷薄膜聚合体表面性状的影响。
HMDSO【(CH3)3SiOSi(CH3)3】是一种有机化工及医药化工生产中常用的原料，主要用作封头剂、清洗剂、脱膜剂等，沸点100℃，该材料无毒，是一种生物惰性材料。该材料可以用等离子聚合的方法成膜，聚合体表面接触角较大，适合用来作为研究低温等离子体轰击效应的靶材料。
低温等离子体用来改善表面的应用曾有学者报道过[6-7]，均证明各种等离子体包括Ar,O2,NH3及N2等都能在一定程度上改善材料的表面润湿性。本研究结果也证明经过低温等离子体处理后，HMDSO表面接触角明显下降，80s的氧等离子体处理由未处理前的106°降低到0°实现了由憎水性表面向亲水性表面的转化。说明表面润湿性有了明显的增加。
根据高分子材料不同的用途，需要细胞尽快贴附或者延迟贴附。本研究着眼于观察材料的表面润湿性对细胞早期贴附的影响。以往也有一些学者做过这方面的研究，但是采用的是不同的材料或者表面润湿性模型的接触角范围很窄，难以很好的反映单纯表面润湿性的生物学效应[8-10]。在本研究中，采用了单一的材料，表面接触角范围从106°到0°，对于研究表面润湿性是一种合适的模型，实验结果表明，未经氧等离子体处理的HMDSO表面接触角为106°，属于高度疏水性表面，细胞在这种表面上初期贴附量很少，而且电镜结果也显示，细胞的伸展性较差，呈球形，细胞突起较少。而在经过氧等离子体80s处理后，材料表面的接触角变为0°，属于高度亲水性表面，细胞早期就可见到良好的贴附，细胞的贴附率与表面接触角呈显著的负相关性，在亲水表面上细胞伸展良好，突起很多，呈梭形。这个结果和大部学者的研究结果一致[10-11]。
有关这种结果的机理，我们的前期实验结果证明经过等离子体处理后，表面亲水基团明显增加，从而增加了表面的润湿性，表现为接触角的下降，这种效应可能对于一些粘附蛋白如Fibronectin、Vitronectin等的吸附有着直接的影响，从而影响到细胞的初期贴附和伸展能力。
总之，本研究利用氧等离子体处理的方法，在很大范围内改变了高分子聚合物的表面润湿性，表面润湿性的降低有利于成纤维细胞的早期贴附和伸展。
[参考文献]
[1]Ikada Y. Surface modification of polymers for medical applications[J]. Biomaterials,1994,15: 725-736.
[2]van Wachem PB, Hogt AH, Beugeling T, et al. Adhesion of cultured human endothelial cells onto methacrylate polymers with varying surface wettability and charge[J]. Biomaterials,1987,8:323-328.
[3]Wang YX, Robertson JL, Spillman WB, et al. Effects of the chemical structure and the surface properties of polymeric biomaterials on their biocompatibility[J]. Pharm Res, 2004,21: 1362-1373.
[4]Spijker HT, Graaff R, Boonstra PW, et al. On the influence of flow conditions and wettability on blood material interactions[J]. Biomaterials,2003,24: 4717-4727.
[5]Dalby MJ, Di Silvio L, Gurav N, et al. Optimizing HAPEX topography influences osteoblast response[J]. Tissue Eng,2002,8:453-467.
[6]Pignataro B, Conte E, Scandurra A, et al. Improved cell adhesion to ion beam-irradiated polymer surfaces[J]. Biomaterials,1997,1877): 1461-1470.
[7]Chen M, Zamora PO, Som P, et al. Cell attachment and biocompatibility of polytetrafluoroethylene (PTFE) treated with glow-discharge plasma of mixed ammonia and oxygen[J]. J Biomater Sci Polym Ed,2003,14: 917-935.
[8]Wang YW, Wu Q, Chen GQ. Reduced mouse fibroblast cell growth by increased hydrophilicity of microbial polyhydroxyalkanoates via hyaluronan coating[J]. Biomaterials,2003, 24: 4621-4629.
[9]Bumgardner JD, Wiser R, Elder SH, et al. Contact angle, protein adsorption and osteoblast precursor cell attachment to chitosan coatings bonded to titanium[J]. J Biomater Sci Polym Ed,2003,14: 1401-1409.
[10]Hao L, Lawrence J. On the role of CO2 laser treatment in the human serum albumin and human plasma fibronectin adsorption on zirconia (MGO-PSZ) bioceramic surface[J]. J Biomed Mater Res A,2004,69A: 748-756.
[11]Groth T, Altankov G. Studies on cell-biomaterial interaction: role of tyrosine phosphorylation during fibroblast spreading on surfaces varying in wettability[J]. Biomaterials,1996,17: 1227-1234.
[收稿日期]2008-05-15[修回日期]2008-07-06
编辑/张惠娟
[关键词]表面润湿性；等离子体聚合物；接触角；细胞贴附
[中图分类号]Q647[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）07-1018-03
Adhesion of fibroblast on polymer surfaces with Different Wettability
WEI Jian-hua 1，FENG Xing-hua1，ZHANG Jun-rui1，LIU Bao-lin3, Masao YOS HINARI2
(1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery,School of Stomatology,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China; 2.Department of Dental Materials Science; Tokyo Dental College，1-2-2 Masago; Mihama-ku, Chiba 261-8502,Japan)
Abstract:ObjectiveTo study the initial stage cell attachment of fibroblast on polymer surfaces with different wettability. MethodsHexamethyldisiloxane polymer film was obtained by plasma polymerization method on coverslips. Oxygen (O2) plasma treatment was employed to modify the surfaces with different time so that a series of surface with different wettability were produced. L929 cell were cultured on these surfaces to observe the cell attachment rate and cell spreading in 6 and 12 hours. ResultsThe contact angle of HMDSO surface decreased gradually with the increasing duration of the plasma treatment. Fibroblasts tended to attach more on hydrophilic surfaces than on hydrophobic ones. ConclusionCells initial attachment and spreading is significantly affected by polymer surface wettability. The hydrophilic surfaces shows more favorable for cell initial attachment than the hydrophobic ones.
Key words:surface wettability; plasma-polymerized polymer; contact angle; cell attachment
生物高分子聚合材料在整形美容外科有着广泛的应用，这些材料的生物学相容性对于手术的成败有着重要影响。这些聚合材料的表面性状研究也一直是生物材料研究关注的热点，其中表面能是影响材料生物学相容性的重要因素之一[1-5]。表面能可以用表面润湿性来体现，有研究表明表面润湿性对细胞的生物学相容性有一定的影响。本课题研究了高分子聚合体表面润湿性对成纤维细胞早期贴附和伸展的影响。
1材料和方法
1.1 六甲基二硅氧烷聚合体表面的制作：使用薄膜等离子体聚合法（plasma polymerization），在圆形盖玻片（Thermanox, Nalge Nunc International, USA）表面生成六甲基二硅氧烷薄膜聚合体。具体步骤如下：①将圆形15mm盖玻片置入等离子聚合仪(VEP-1000,ULVAC Inc,Japan)，聚合温度为125℃；②将聚合腔抽真空，真空度设定5×10-3 Pa。3 HMDSO单体被加热70℃气化后按照流量为45sccm (standard cubic centimeter/min,ml/min)被引入聚合腔内；③当腔内压力达到10Pa且稳定以后，开始等离子放电过程（frequency generator at 13.56 MHz），输出功率200W，放电时间10min；④聚合结束后将氮气引入反应腔至大气压。处理过的盖玻片表面生成厚度约为100nm的HMDSO聚合薄膜。将处理好的盖玻片表面以氮气清洁后放置到细胞培养用灭菌24孔板内备用。
1.2 低温等离子体处理：将部分步骤1.1制作的HMDSO盖玻片重新引入等离子聚合仪的反应腔内，处理面向上，用低能量氧进行低温等离子轰击，处理条件为功率10W, 腔内压强1.8 Pa，流量 50 sccm。处理时间分别为20s，40s和80s。 轰击后将氮气引入反应腔至大气压，取出后进行表面接触角的测量。
1.3 表面接触角测定：每种条件取3个样本，用接触角测定仪（CA-P, Kyowa Interface Co. Ltd., Japan）测定试样的表面接触角，在每个标本的3个不同位置滴双蒸水10μl，读取接触角并取平均值。
1.4 细胞贴附率测定：将以上处理的三组标本及未行氧等离子体处理的标本每种6片放入24孔细胞培养板中。将L929细胞配制2.5×104cells/ml的细胞悬液，每个培养孔内加入细胞悬液1ml，相当于每个试样上接种的细胞数量为2.5× 104。在细胞培养箱内培养时间在第6h和第12h时，每组标本取出3片，以PBS轻轻漂洗未贴附的细胞后，置入新的24孔板内，每个孔内加0.5ml1%胰蛋白酶溶液，消化细胞5min后加入0.5ml MEM+10% FBS终止消化作用，每孔内溶液量为1ml。细胞计数采用细胞技术仪Coulter Counter Z1 (Beckman Coulter, Inc. USA)。取平均值作为细胞贴附值，将细胞贴附数除以接种基数后可以得出细胞贴附率。
1.5 细胞形态电镜观察：将部分试样用于电镜标本观察，首先将标本用PBS漂洗未贴附的细胞，用2%多聚甲醛固定后，系列酒精脱水，冻干喷金后用扫描电镜(JSM-6340F；JEOL, Japan)观察细胞形态。
1.6 统计分析：采用SPSS11.0软件对实验数据进方差分析。
2结果
2.1 表面接触角数据：HMDSO聚合体表面的接触角为106°，属于高度疏水性表面。经过低温氧或氮等离子体处理后表面接触角明显降低，在氧等离子体处理80s后表面接触角降为0°，转化为高度亲水性表面。接触角与等离子体处理时间呈现负相关性。如表1所示。
2.2 细胞贴附测定：L929细胞贴附测定结果如表2所示，细胞贴附率见图1所示。结果表明在接触角为106°的HMDSO表面上细胞贴附很差，而随着表面润湿性的增加（接触角减小），细胞贴附显著性增高。
2.3 扫描电镜结果：如图2所示，可见在106°的HMDSO表面上细胞呈球形，细胞伸展很差，而在氧等离子体处理80s，接触角为0°的表面上，细胞伸展良好，呈片状。
3讨论
在整形美容外科领域，生物高分子材料应用越来越广泛，从软组织扩张器、输血材料到衬垫材料。有关材料学表面的研究也层出不穷，实验证明，材料的许多表面性状都直接影响到其生物学相容性，如表面形貌、表面电荷、表面能、表面基团等等都会影响到细胞的贴附增殖或者蛋白质的粘附[1,2,5]。相应的，学者们使用了许多方法来改变生物材料的表面性状以改善其生物学相容性，其中低温等离子体处理越来越引起研究者的关注。在本研究中我们着重观察了氧及氮等离子体处理对六甲基二硅氧烷薄膜聚合体表面性状的影响。
HMDSO【(CH3)3SiOSi(CH3)3】是一种有机化工及医药化工生产中常用的原料，主要用作封头剂、清洗剂、脱膜剂等，沸点100℃，该材料无毒，是一种生物惰性材料。该材料可以用等离子聚合的方法成膜，聚合体表面接触角较大，适合用来作为研究低温等离子体轰击效应的靶材料。
低温等离子体用来改善表面的应用曾有学者报道过[6-7]，均证明各种等离子体包括Ar,O2,NH3及N2等都能在一定程度上改善材料的表面润湿性。本研究结果也证明经过低温等离子体处理后，HMDSO表面接触角明显下降，80s的氧等离子体处理由未处理前的106°降低到0°实现了由憎水性表面向亲水性表面的转化。说明表面润湿性有了明显的增加。
根据高分子材料不同的用途，需要细胞尽快贴附或者延迟贴附。本研究着眼于观察材料的表面润湿性对细胞早期贴附的影响。以往也有一些学者做过这方面的研究，但是采用的是不同的材料或者表面润湿性模型的接触角范围很窄，难以很好的反映单纯表面润湿性的生物学效应[8-10]。在本研究中，采用了单一的材料，表面接触角范围从106°到0°，对于研究表面润湿性是一种合适的模型，实验结果表明，未经氧等离子体处理的HMDSO表面接触角为106°，属于高度疏水性表面，细胞在这种表面上初期贴附量很少，而且电镜结果也显示，细胞的伸展性较差，呈球形，细胞突起较少。而在经过氧等离子体80s处理后，材料表面的接触角变为0°，属于高度亲水性表面，细胞早期就可见到良好的贴附，细胞的贴附率与表面接触角呈显著的负相关性，在亲水表面上细胞伸展良好，突起很多，呈梭形。这个结果和大部学者的研究结果一致[10-11]。
有关这种结果的机理，我们的前期实验结果证明经过等离子体处理后，表面亲水基团明显增加，从而增加了表面的润湿性，表现为接触角的下降，这种效应可能对于一些粘附蛋白如Fibronectin、Vitronectin等的吸附有着直接的影响，从而影响到细胞的初期贴附和伸展能力。
总之，本研究利用氧等离子体处理的方法，在很大范围内改变了高分子聚合物的表面润湿性，表面润湿性的降低有利于成纤维细胞的早期贴附和伸展。
[参考文献]
[1]Ikada Y. Surface modification of polymers for medical applications[J]. Biomaterials,1994,15: 725-736.
[2]van Wachem PB, Hogt AH, Beugeling T, et al. Adhesion of cultured human endothelial cells onto methacrylate polymers with varying surface wettability and charge[J]. Biomaterials,1987,8:323-328.
[3]Wang YX, Robertson JL, Spillman WB, et al. Effects of the chemical structure and the surface properties of polymeric biomaterials on their biocompatibility[J]. Pharm Res, 2004,21: 1362-1373.
[4]Spijker HT, Graaff R, Boonstra PW, et al. On the influence of flow conditions and wettability on blood material interactions[J]. Biomaterials,2003,24: 4717-4727.
[5]Dalby MJ, Di Silvio L, Gurav N, et al. Optimizing HAPEX topography influences osteoblast response[J]. Tissue Eng,2002,8:453-467.
[6]Pignataro B, Conte E, Scandurra A, et al. Improved cell adhesion to ion beam-irradiated polymer surfaces[J]. Biomaterials,1997,1877): 1461-1470.
[7]Chen M, Zamora PO, Som P, et al. Cell attachment and biocompatibility of polytetrafluoroethylene (PTFE) treated with glow-discharge plasma of mixed ammonia and oxygen[J]. J Biomater Sci Polym Ed,2003,14: 917-935.
[8]Wang YW, Wu Q, Chen GQ. Reduced mouse fibroblast cell growth by increased hydrophilicity of microbial polyhydroxyalkanoates via hyaluronan coating[J]. Biomaterials,2003, 24: 4621-4629.
[9]Bumgardner JD, Wiser R, Elder SH, et al. Contact angle, protein adsorption and osteoblast precursor cell attachment to chitosan coatings bonded to titanium[J]. J Biomater Sci Polym Ed,2003,14: 1401-1409.
[10]Hao L, Lawrence J. On the role of CO2 laser treatment in the human serum albumin and human plasma fibronectin adsorption on zirconia (MGO-PSZ) bioceramic surface[J]. J Biomed Mater Res A,2004,69A: 748-756.
[11]Groth T, Altankov G. Studies on cell-biomaterial interaction: role of tyrosine phosphorylation during fibroblast spreading on surfaces varying in wettability[J]. Biomaterials,1996,17: 1227-1234.
[收稿日期]2008-05-15[修回日期]2008-07-06
编辑/张惠娟