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【摘 要】针对传统大肠杆菌表达凝乳酶发酵工艺的不足，在 10 m 3 新型高溶氧发酵罐上，对重组大肠杆菌（ Recombinant E. Coli）连续流加补料发酵生产凝乳酶进行了工业化研究，优化了培养基配方和工艺条件。 结果表明：优化后的培养基以及工艺条件比优化前菌体浓度与酶活均具有较大的提升，对凝乳酶工业化发展提供了重要的技术支持。
【关键词】凝乳酶;高密度发酵;培养基;流加培养;优化
【中图分类号】R715 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2019）12-0112-01
引言
凝乳酶（Chymosin）是奶酪工艺中不可或缺的酶制剂，能使乳中蛋白质凝结成乳酪，在欧美等地制酪市场广泛应用[1]。凝乳酶早期来源于未断奶的小牛胃粘膜提取获得，原料来源受局限，产能较低，成本较高[2]。随着重组DNA技术和发酵工程的快速发展，凝乳酶基因成功在基因工程菌大肠杆菌中得到表达。但是局限于大肠杆菌一般为胞内酶，且菌体密度难以提高，总体产量不高等因素的制约，整体产能相对较低，在工业化上的应用带来的经济效益较差[3-4]。
本研究在常规大肠杆菌发酵所用LB培养基的基础上进行配方改进，采取高营养以及无机盐混合配方，并结合在生物反应器中对重组大肠杆菌高密度发酵工艺进行优化，以此达到提升产量的目的。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 产凝乳酶重组大肠杆菌，由本公司生化实验室提供
1.1.2 主要仪器 电子分析天平、20L发酵罐及补料系统、显微镜、离心机、紫外分光光度计、恒温摇床等
1.1.3 主要试剂 蛋白胨、酵母粉、氯化铵、消泡剂、甘油、盐酸硫胺、葡萄糖、微量元素、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、氨苄、乳糖、IPTG
1.2 试验方法
1.2.1 培养基配制 改进前培养基（g/L）
基础料：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、葡萄糖20g、消泡剂。
补料培养基：蛋白胨30g、酵母粉30g、氯化钠2g、葡萄糖60g、硫酸镁3g，磷酸二氢钠12g、磷酸氢二钠24g。
改进培养基（g/L）
（1）基础料：蛋白胨15.65g、酵母粉31.3g、氯化铵2.35g、甘油31.5g、消泡剂、HDM缓冲液43.88ml。
（2）补料培养基：蛋白胨55g、酵母粉110g、氯化铵8.25g、葡萄糖105g、HDM缓冲液150ml、盐酸硫胺0.055g、微量元素。
（3）HDM缓冲液：磷酸二氢钾26.6g、磷酸氢二钾80g、氯化铵26.7g、硫酸钠13.3g。
1.2.2 菌种培养 从平板上挑取单菌落划线于LB固体平板，30±1℃培养27h后，在平板上挑选单菌落接入15ml*4（100ml三角瓶）LB液体培养基中，30±1℃，180rpm摇床培养，约15h，转接至150ml*4（1L三角瓶）扩大培养，培养时间约25小时，测定其OD600值6.0±0.5。
1.2.3 发酵培养 发酵基础培养基经过高温灭菌后接入培养好的菌种开始培养，温度37±1℃，pH值利用氢氧化钠和盐酸自动控制维持6.5-7.5，溶氧控制在30%以上。通过补料维持发酵所需碳源和氮源。通过添加IPTG诱导表达凝乳酶，发酵结束收集菌体。
2 结果与分析
2.1 培养基优化后对产量的影响
由表1对比试验的数据结果可知，菌体总量增加了74.65%，过程数据显示优势明显，目的产物包涵体的单位酶活力有所提高。这是因为新配方在复合碳源氮源方面丰富于原LB培养基，发酵过程启动速度较快，生长优势明显，优化后培养基用甘油替代了优化前培养基的葡萄糖，甘油更有利于微生物的代谢利用。同时，优化后培养基中增加几种缓冲盐类，使得反应体系pH值变化相对较缓和，不会因为菌体生长较快，导致的反应体系中pH值变化剧烈，影响菌体生长代谢。微量元素的加入也有利于微生物的生长，微量元素能够构成有机化合物，调节培养基的渗透压，恒定微生物发育生长条件，参与酶系反应，维持酶的活性，也可以作为自养微生物的能源，供给生命活动所需的能量。
2.2 不同比生长速率对产量的影响 为了进一步提高菌体密度和蛋白产量，我们采用了指数流加策略。指数流加方式是目前较为有效的流加策略，它不仅可以根据菌体密度的增加和发酵液体积的增大，改变流加速率， 还可以控制恒定的比生长速率，从而避免乙酸的抑制和副产物的形成[5-6]。实验将比生长速率分别设定为0.1h-1、0.2h-1、0.3h-1，在A600达到100时，开始添加IPTG诱导12h。结果见表2。
由上表可知，在指数流加方式下，0.2h-1的比生长速率较其它比生长速率相比，能够在较短的时间内获得较高的菌体浓度，且获得较高的酶活。这是因为，发酵过程中，过低的补料速度会导致营养缺陷，菌体生长得不到充分的营养和能量需求。而过高的补料速度则会导致乙酸及代谢副产物过多，会导致其它代谢途径过于旺盛，争夺营养与能量，溶氧需求急剧增加，进而影响菌体生长及蛋白表达途径正常代谢。
3 结论
重组大肠杆菌高密度发酵是酶制剂产业化的关键问题。目前主要问题包括工程菌的表达稳定性、针对性培养基优化、发酵机理的调控以及如何去避免染菌的威胁。这些问题的解决与丰富工程菌理论、完备检测与调控手段以及生物反应器的改进息息相关。随着生物技术工艺与设备的不断高质量发展，高密度高表达的酶制剂产品将越来越多的能够实现产业化。
参考文献
[1] 孟广震. 凝乳酶研究进展[J]. 微生物学通报， 1987（02）：46-48.
[2] 孙海蛟， 吕敏， 黄艾祥. 我国干酪凝乳酶研究及应用现状[J]. 中国乳业， 2008， 000（005）：50-52.
[3] 曾祺， 张志国. 微生物凝乳酶研究进展[J]. 中国乳品工业， 2019， 047（003）：30-36.
[4] 龍建银， 王会信. 外源基因在大肠杆菌中表达的研究进展[J]. 生物化学与生物物理进展， 1997， 024（002）：126-132.
[5] 李民， 陈常庆. 重组大肠杆菌高密度发酵研究进展[J]. 生物工程进展， 2000.
[6]孙艳， 王长城， 张玲， et al. 重组大肠杆菌产胆固醇氧化酶的指数流加策略[J]. 化工进展， 2010（01）：130-133.
作者简介：王延山（1985.04.06），男，汉，江苏省盐城市，本科，化工工程助理工程师，研究方向：酶制剂产业化。
【关键词】凝乳酶;高密度发酵;培养基;流加培养;优化
【中图分类号】R715 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2019）12-0112-01
引言
凝乳酶（Chymosin）是奶酪工艺中不可或缺的酶制剂，能使乳中蛋白质凝结成乳酪，在欧美等地制酪市场广泛应用[1]。凝乳酶早期来源于未断奶的小牛胃粘膜提取获得，原料来源受局限，产能较低，成本较高[2]。随着重组DNA技术和发酵工程的快速发展，凝乳酶基因成功在基因工程菌大肠杆菌中得到表达。但是局限于大肠杆菌一般为胞内酶，且菌体密度难以提高，总体产量不高等因素的制约，整体产能相对较低，在工业化上的应用带来的经济效益较差[3-4]。
本研究在常规大肠杆菌发酵所用LB培养基的基础上进行配方改进，采取高营养以及无机盐混合配方，并结合在生物反应器中对重组大肠杆菌高密度发酵工艺进行优化，以此达到提升产量的目的。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 产凝乳酶重组大肠杆菌，由本公司生化实验室提供
1.1.2 主要仪器 电子分析天平、20L发酵罐及补料系统、显微镜、离心机、紫外分光光度计、恒温摇床等
1.1.3 主要试剂 蛋白胨、酵母粉、氯化铵、消泡剂、甘油、盐酸硫胺、葡萄糖、微量元素、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、氨苄、乳糖、IPTG
1.2 试验方法
1.2.1 培养基配制 改进前培养基（g/L）
基础料：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、葡萄糖20g、消泡剂。
补料培养基：蛋白胨30g、酵母粉30g、氯化钠2g、葡萄糖60g、硫酸镁3g，磷酸二氢钠12g、磷酸氢二钠24g。
改进培养基（g/L）
（1）基础料：蛋白胨15.65g、酵母粉31.3g、氯化铵2.35g、甘油31.5g、消泡剂、HDM缓冲液43.88ml。
（2）补料培养基：蛋白胨55g、酵母粉110g、氯化铵8.25g、葡萄糖105g、HDM缓冲液150ml、盐酸硫胺0.055g、微量元素。
（3）HDM缓冲液：磷酸二氢钾26.6g、磷酸氢二钾80g、氯化铵26.7g、硫酸钠13.3g。
1.2.2 菌种培养 从平板上挑取单菌落划线于LB固体平板，30±1℃培养27h后，在平板上挑选单菌落接入15ml*4（100ml三角瓶）LB液体培养基中，30±1℃，180rpm摇床培养，约15h，转接至150ml*4（1L三角瓶）扩大培养，培养时间约25小时，测定其OD600值6.0±0.5。
1.2.3 发酵培养 发酵基础培养基经过高温灭菌后接入培养好的菌种开始培养，温度37±1℃，pH值利用氢氧化钠和盐酸自动控制维持6.5-7.5，溶氧控制在30%以上。通过补料维持发酵所需碳源和氮源。通过添加IPTG诱导表达凝乳酶，发酵结束收集菌体。
2 结果与分析
2.1 培养基优化后对产量的影响
由表1对比试验的数据结果可知，菌体总量增加了74.65%，过程数据显示优势明显，目的产物包涵体的单位酶活力有所提高。这是因为新配方在复合碳源氮源方面丰富于原LB培养基，发酵过程启动速度较快，生长优势明显，优化后培养基用甘油替代了优化前培养基的葡萄糖，甘油更有利于微生物的代谢利用。同时，优化后培养基中增加几种缓冲盐类，使得反应体系pH值变化相对较缓和，不会因为菌体生长较快，导致的反应体系中pH值变化剧烈，影响菌体生长代谢。微量元素的加入也有利于微生物的生长，微量元素能够构成有机化合物，调节培养基的渗透压，恒定微生物发育生长条件，参与酶系反应，维持酶的活性，也可以作为自养微生物的能源，供给生命活动所需的能量。
2.2 不同比生长速率对产量的影响 为了进一步提高菌体密度和蛋白产量，我们采用了指数流加策略。指数流加方式是目前较为有效的流加策略，它不仅可以根据菌体密度的增加和发酵液体积的增大，改变流加速率， 还可以控制恒定的比生长速率，从而避免乙酸的抑制和副产物的形成[5-6]。实验将比生长速率分别设定为0.1h-1、0.2h-1、0.3h-1，在A600达到100时，开始添加IPTG诱导12h。结果见表2。
由上表可知，在指数流加方式下，0.2h-1的比生长速率较其它比生长速率相比，能够在较短的时间内获得较高的菌体浓度，且获得较高的酶活。这是因为，发酵过程中，过低的补料速度会导致营养缺陷，菌体生长得不到充分的营养和能量需求。而过高的补料速度则会导致乙酸及代谢副产物过多，会导致其它代谢途径过于旺盛，争夺营养与能量，溶氧需求急剧增加，进而影响菌体生长及蛋白表达途径正常代谢。
3 结论
重组大肠杆菌高密度发酵是酶制剂产业化的关键问题。目前主要问题包括工程菌的表达稳定性、针对性培养基优化、发酵机理的调控以及如何去避免染菌的威胁。这些问题的解决与丰富工程菌理论、完备检测与调控手段以及生物反应器的改进息息相关。随着生物技术工艺与设备的不断高质量发展，高密度高表达的酶制剂产品将越来越多的能够实现产业化。
参考文献
[1] 孟广震. 凝乳酶研究进展[J]. 微生物学通报， 1987（02）：46-48.
[2] 孙海蛟， 吕敏， 黄艾祥. 我国干酪凝乳酶研究及应用现状[J]. 中国乳业， 2008， 000（005）：50-52.
[3] 曾祺， 张志国. 微生物凝乳酶研究进展[J]. 中国乳品工业， 2019， 047（003）：30-36.
[4] 龍建银， 王会信. 外源基因在大肠杆菌中表达的研究进展[J]. 生物化学与生物物理进展， 1997， 024（002）：126-132.
[5] 李民， 陈常庆. 重组大肠杆菌高密度发酵研究进展[J]. 生物工程进展， 2000.
[6]孙艳， 王长城， 张玲， et al. 重组大肠杆菌产胆固醇氧化酶的指数流加策略[J]. 化工进展， 2010（01）：130-133.
作者简介：王延山（1985.04.06），男，汉，江苏省盐城市，本科，化工工程助理工程师，研究方向：酶制剂产业化。