论文部分内容阅读
摘要目的：采用拟缺血再灌注损伤结合zVADFMK（BenzyloxyearbonylValAlaAspfluoromethylketone，zVADFMK）干预，探索一种脑微血管内皮细胞（Brain Microvascular Endothelial Cells，BMECs）Necroptosis模型。方法：首先利用原代大鼠脑微血管内皮细胞，采用氧糖剥夺及复氧复糖方法，筛选出拟缺血再灌注损伤时间点。在拟缺血再灌注模型基础上，予Casepase抑制剂zVADFMK 20 μmol/L干预，采用CCK8检测细胞活性；透射电镜观察细胞超微结构；Annexin VFITC/PI（Propidium Iodide）双染色法检测细胞死亡方式。结果：确定氧糖剥夺2 h复氧复糖8 h，作为拟缺血再灌注时间点；zVADFMK作用于拟缺血再灌注损伤BMECs后，细胞活性无统计学意义；zVADFMK干预组在电镜下呈现明显的Necroptosis特征；流式检测显示，各象限细胞比率无明显变化，但Necroptosis特异性抑制剂Nec1可显著降低Q2象限细胞比率，提示zVADFMK干预抑制了细胞晚期凋亡，诱导了Necroptosis的发生。结论：zVADFMK可诱导拟缺血再灌注脑微血管内皮细胞发生Necroptosis，为以后研究缺血性脑中风necroptosis机制提供了细胞实验模型。
关键词脑微血管内皮细胞；Necroptosis；zVADFMK；缺血再灌注损伤
AbstractObjective：To explore a model of necroptosis in brain microvascular endothelial cells （BMECs） by mimic ischemiareperfusion injury combined with zVADFMK （BenzyloxyearbonylValAlaAspfluoromethylketone， zVADFMK）. Methods：First， primary rat BMECs were cultured in oxygenglucose deprivation （OGD） and reintroduction conditions for various time points to screen a time of mimic ischemiareperfusion injury. Then， zVADFMK， the casepase inhibitor， was administrated at 20 μmol/L concentration on the ischemiareperfusion injured BMECs. The cell activity was detected by CCK8. The ultrastucture was observed using the transmission electron microscope. The death mode of BMECs was detected using cell ultrastructure； Annexin VFIT C/PI （propidium iodide） double staining to detect the type of cell death. Results：OGD 2 h and reintroduction 8 h was determined to be the time point of mimic ischemiareperfusion injury. After zVADFMK was administrated on ischemiareperfusion injuried BMECs， the cells viability didn′t change significantly. The necroptosis characteristic was presented under transmission electron microscope. The flowcytometry results showed that ratio of cells in each quadrant had no significant change. However， Nec1， a specific inhibitor of necroptosis， could significantly decrease the ratio of cells in quadrant Q2， suggesting that intervention of zVADFMK inhibited the late apoptosis and induced necroptosis occurrence. Conclusion：The necroptosis may be induced by zVADFMK in ischemiareperfusion injured BMECs， which provides the cell experimental model for researching necroptosis mechanism in the ischemic stroke in the future.
Key WordsBrain microvascular endothelial cells； Necroptosis； zVADFMK； Ischemiareperfusion injury
中圖分类号：R965文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.043
脑中风是严重影响人类身体健康，甚至威胁生命的疾病。在我国，位列疾病死因第一位，每年发生脑中风的患者达200万，其中缺血性脑中风所占的比率为70%～80%[1]。缺血再灌注损伤（Ischemiareperfusion Injury，IRI）是该病的重要病理生理过程，缺血再灌注损伤形式有多种，其中细胞死亡是主要损伤形式之一。除传统的凋亡和坏死外，近些年又发现一种新的细胞死亡形式—Necroptosis。已有证据表明，缺血缺氧模型的心肌细胞、神经细胞以及肿瘤存在Necroptosis[24]。脑微血管内皮细胞（Brain Microvascular Endothelial Cells，BMECs）作为血脑屏障的主要构成细胞，其功能受损和死亡参与了脑缺血的病理演变过程，但目前关于缺血诱导的脑微血管内皮细胞Necroptosis的研究甚少。本实验利用原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞，在氧糖剥夺诱导缺血再灌注损伤的基础上，选用目前应用最为广泛的caspase广谱性蛋白抑制剂zVADFMK（BenzyloxyearbonylValAlaAspfluoromethylketone）进行处理，以建立一种脑微血管内皮细胞Necroptosis体外模型，为今后深入研究脑缺血后脑微血管内皮细胞Necroptosis的发生机制及血管保护药物的疗效靶点奠定基础。 1材料与方法
11材料
111细胞采用本课题组已建立的大鼠脑微血管内皮细胞培养技术[5]，对20 g左右雄性SD大鼠进行细胞取材、培养和传代。实验中使用的第3代内皮细胞，其纯度达到98%以上[6]。
112试剂与仪器zVADFMK（美国Enzo Life Sciences公司），Nec1（美國Enzo Life Sciences公司），DMSO（美国Sigma公司），胎牛血清（excell bio南美血缘胎牛血清），DMEM/F12培养基干粉（美国Gibco公司），内皮细胞生长添加剂（ECGS，中科迈晨（北京）科技有限公司），明胶（美国Sigma公司），胰蛋白酶（美国Sigma公司），胶原酶Ⅱ型（美国Sigma公司），CCK8试剂盒（日本同仁化学研究所），Annexin VFITC and PI双染试剂盒（美国BD公司），倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司），XMark型酶标仪（美国BIORAD公司），流式细胞仪（美国BD公司），透射电子显微镜（日本H7650公司）。
12方法
121分组与模型制备将传至第3代的脑微血管内皮细胞随机分成3组：正常组、IRI组和IRI+zVADFMK组。筛选和制备拟缺血再灌注模型：在本室已建立的拟缺血损伤模型的基础上，重新筛选氧糖剥夺时间和复糖复氧时间，以制备稳定的拟缺血再灌注模型。第3代BMECs铺满瓶底约80%～90%时，吸出培养瓶内原培养液，用DHank′s洗涤两遍，换成无糖Kreb′s液，放置37 ℃含1%O2、95%N2和5% CO2的培养箱中培养2 h或3 h，然后取出培养瓶弃掉上清，换成DMEM/F12基础培养基，放进37 ℃、217%O2和5% CO2正常培养箱分别孵育0、4、8、12 h，每个时间点均设立正常对照组。造模结束后用CCK8试剂盒检测细胞活性，筛选合适的氧糖剥夺时间和复糖复氧时间，建立拟缺血再灌注损伤模型。
122干预方法除正常组外，其余2组按上述筛选出的拟缺血再灌注模型进行造模。IRI+zVADFMK组，造模前30 min及造模过程中按20 μmol/L浓度加入zVADFMK。造模及处理结束后，进行下列指标检测。
123检测指标与方法CCK8检测各组细胞活性：造模完成后弃上清，加入DMEM/F12培养基，每孔再加入10 μL CCK8溶液，在培养箱中继续孵育2 h后，用酶标仪测定各组的吸光光度值，检测波长为450 nm，每组设6个复孔。透射电镜观察细胞超微结构：造模结束后，消化并收集细胞，用DHank′s洗涤细胞2次，将细胞悬液置于15 mL EP管中，200 g水平离心10 min。用预冷25%戊二醛（pH 73）1 mL/管进行固定，PBS漂洗，之后用1%锇酸固定。以不同浓度的丙酮顺次脱水，环氧树脂包埋，光镜下进行修块，超薄切片机切成60 nm的薄片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，放于电子显微镜下观察并拍片。Annexin VFITC/PI双染色法检测细胞死亡方式：因细胞发生Necroptosis与晚期凋亡染色特征相似，因此本实验在上述3组的基础上，增加IRI+zVADFMK+Nec1（Necstatin1，Necroptosis特异性阻滞剂）组，即在造模前30 min及造模过程中加入20 μmol/L zVADFMK和10 μmol/Lnecstatin1。造模结束后，用不含EDTA的胰酶消化细胞，200 g离心5 min，弃上清；用预冷的DHank′s洗涤细胞两次，400 g离心5 min；每管加500 μL 1×Binding Buffer、5 μL Annexin VFITC吹打混匀，室温避光放置15 min后，在检测前5 min加入10 μLPI后，上流式细胞仪进行检测。
13统计学方法应用统计学软件SPSS 200进行数据分析，实验结果用均数±标准差（±s）表示，本实验数据处理应用t检验和单因素方差进行分析，以P<005为差异有统计学意义。
2结果
21确定拟缺血及再灌注时间图1为氧糖剥夺2 h，复氧复糖不同时间点的结果。造模前，正常组和模型组无统计学意义。与正常组比较，氧糖剥夺2 h时，细胞活性开始下降，但组间无统计学意义；复氧复糖4 h时，细胞活性显著下降（P<001），复氧复糖8 h时，细胞活性持续下降（P<001），复氧复糖12 h时，细胞活性降低，但与复氧复糖8 h组比较，变化不大。
从图1和图2综合来看，BMECs氧糖剥夺2 h后，细胞活性稍有下降，但无统计学意义，复氧复糖4～8 h是细胞明显损伤期。而氧糖剥夺3 h及复氧复糖各时间点细胞活性均显著下降，复氧复糖0～4 h是细胞明显损伤期，该损伤更接近于急性缺血性损伤。我们认为，氧糖剥夺2 h复氧复糖8 h，细胞损伤主要发生在再灌注过程中，更符合缺血再灌注损伤的特征，因此确定了氧糖剥夺2 h复氧复糖8 h来制备拟缺血再灌注损伤模型，以下实验均采用此条件造模。
22CCK8检测各组的细胞活性如表1结果所示，IRI组OD值较正常组显著降低（P<001），提示IRI组细胞活性显著下降；与IRI组比较，IRI+zVADFMK组OD值变化不明显。这一结果显示加入zVADFMK后，细胞活性没有明显升高，与本实验验证zVADFMK可能会诱导另一种细胞死亡形式相一致。
23透射电镜观察各组细胞形态学改变如图3所示，在透射电镜下，正常的脑微血管内皮细胞的细胞膜完整，细胞核呈椭圆形，染色质均匀，细胞器状态良好（图3a）。IRI组大多细胞核固缩或破裂，染色质凝聚，但细胞膜基本完整（图3b、3c）。IRI+zVADFMK组（图3d、e、f）：细胞膜完整性被破坏和内容物从胞内释放，细胞器肿胀，线粒体内脊消失呈空泡化，细胞核基本完整，这些变化与Necroptosis的形态特征相符合，提示zVADFMK可诱导拟缺血再灌注损伤BMECs发生Necroptosis。 24Annexin VFITC/PI双染色法检测细胞死亡方式如图4结果所示：与正常组相比，IRI组Q1、Q2、Q4象限细胞比率均显著升高（Q2、Q4象限P<001），Q3象限细胞比率显著降低（P<001），提示拟缺血再灌注损伤造成BMECs早期凋亡、晚期凋亡以及坏死率均显著增加；与IRI组相比，IRI+zVADFMK组Q1、Q2、Q3和Q4象限细胞比率變化不明显，无统计学意义。为了证明Q2象限细胞为Necroptosis，我们另设了IRI+zVADFMK+Nec1组，即在上述处理的基础上，利用Necroptosis抑制剂Nec1进行干预，结果显示，与IRI+zVADFMK组相比，IRI+zVADFMK+Nec1组Q2象限细胞比率显著降低（P<005），Q3象限比率显著升高（P<001），具有统计学意义，说明Nec1可显著降低Q2象限细胞比率，提示OGD+zVADFMK组Q2象限细胞死亡形式可能是Necroptosis。
3讨论
脑缺血后公认的细胞死亡类型包括缺血核心区即刻发生的细胞坏死，以及随后再灌注过程中的细胞凋亡。因此以往关于缺血再灌注损伤的研究多集中在细胞凋亡。2005年由哈佛大学课题组发现一种新型的细胞死亡形式，命名为Necroptosis，在国内被翻译为程序性坏死或坏死性凋亡，但以前者更被认可[7]。研究表明，Necroptosis是由死亡受体介导的，被一系列信号传导通路所调控的caspase非依赖性细胞死亡方式，同时具有坏死和凋亡的特征。在形态学方面，Necroptosis具有明显的坏死特征，主要表现为细胞器肿胀、细胞膜完整性破坏，细胞核完整等[8]。此外，在Necroptosis过程中，会释放大量损伤相关分子，引发严重的局部炎性反应，导致大量炎性反应细胞浸润和激活[9]；而在其发生机制方面类似于凋亡，由特定因子启动，依赖于死亡受体并按照一定信号通路和程序发生，可以对其过程进行调控，但其过程不依赖于caspase系统。随着研究的深入，发现Necroptosis与脑缺血再灌注损伤关系十分密切，在缺血性脑中风发病机制中占有重要地位，现已成为研究的热点[10]，这也为研制开发神经保护药物提供了新的靶点。
为了深入研究抑制Necroptosis对缺血性脑损伤的意义，人们探索了一些体外诱导细胞发生Necroptosis的方法，其中最常用的是在诱导凋亡的基础上加用zVADFMK进行干预[11]。其原理为细胞的死亡受体激活后，如果凋亡通路活化则诱导凋亡，凋亡过程是依赖caspase的，在caspase活性被抑制时会启动Necroptosis。zVADFMK是一种人工合成的广谱caspase抑制剂，能够抑制细胞凋亡发生过程中多种caspase酶的活性，因此可以诱导Necroptosis的发生。
本实验采用拟缺血再灌注损伤结合zVADFMK，探索了脑微血管内皮细胞Necroptosis模型。首先用cck8筛选了缺血再灌注时间，由于实验室前期发现氧糖剥夺6 h时，脑微血管内皮细胞已经发生急性缺血性损伤，因此本次实验从氧糖剥夺5 h以内摸索缺氧缺糖时间，再摸索再灌时间。结果缺氧4 h和5 h时，细胞损伤已很严重（数据未显示），最后弃掉，只做了缺氧缺糖2 h和3 h不同再灌时间点的模型。实验结果显示缺氧缺糖2 h再灌注8 h时，细胞损伤明显，且损伤主要发生在再灌后4～8 h，比较符合缺血再灌注损伤特点，因此确定该时间点作为模拟缺血再灌注损伤的时间点，建立了稳定的IRI模型。
然后，在IRI的基础上利用zVADFMK进行诱导，cck8结果显示IRI组OD值降低，IRI+zVADFMK组与IRI组相比无统计学意义，可能的原因为zVADFMK在抑制凋亡的同时诱导了另一种细胞死亡形式Necroptosis的发生，因此该组细胞活性总体没有明显升高。为了进一步揭示zVADFMK诱导的细胞死亡形式，本实验又用Annexin VFITC/PI双染色法通过流式细胞仪来检测，结果显示zVADFMK干预后各象限细胞比率变化不大。这一结果可能与Annexin VFITC/PI双染色法的原理和Necroptosis的细胞形态变化特征有关。在细胞发生凋亡的早期，Annexin VFITC可与外翻到细胞表面的磷酯酰丝氨酸结合，因此Annexin VFITC阳性被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。PI是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红。zVADFMK主要通过阻断caspase来抑制凋亡，对早期凋亡影响不大；Q2象限为Annexin V和PI染色均为阳性的细胞，一般代表晚期凋亡细胞，zVADFMK阻断caspase后，通过磷酸化RIP3诱导Necroptosis的发生，Necroptosis细胞Annexin V和PI染色也表现为双阳性，因此，zVADFMK抑制了晚期凋亡，但增加了Necroptosis的发生，使得Q2象限细胞比率变化不明显。为了证明Q2象限细胞的死亡方式为Necroptosis，我们另设了IRI+zVADFMK+Nec1组，即在上述处理的基础上，增加了Necroptosis特异性抑制剂Nec1干预，结果显示Nec1可有效降低Q2象限细胞比率，证明了Q2象限的细胞发生Necroptosis。该结果在投射电镜中再次被证实，IRI+zVADFMK组细胞膜破坏明显，线粒体肿胀，内脊消失呈空泡化，细胞核基本完整，这些变化符合Necroptosis的形态特征。总之，综合以上实验结果证实了：zVADFMK可诱导拟缺血再灌注脑微血管内皮细胞发生Necroptosis，为以后研究缺血性脑中风发生Necroptosis提供了细胞实验模型。
参考文献
[1]贾建平，陈生弟.神经病学[M].北京：人民卫生出版社，2013：170.
[2]Liu X，Zhang C，Zhang C，et al.Heat shock protein 70 inhibits cardiomyocyte necroptosis through repressing autophagy in myocardial ischemia/reperfusion injury[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim，2016，52（6）：690698. [3]Zhao Y，Huang G，Chen S，et al.Homocysteine Aggravates Cortical Neural Cell Injury through Neuronal Autophagy Overactivation following Rat Cerebral IschemiaReperfusion[J].Int J Mol Sci，2016，17（8）：523.
[4]Hu X，Han W，Li L.Targeting the Weak Point of Cancer by Induction of Necroptosis[J].Autophagy，2014，3（5）：490492.
[5]李卫红，李澎涛，华茜，等.不同内皮细胞条件培养液对皮层神经元线粒体功能的影响及通络救脑注射液的保护作用[J].中国中西医结合杂志，2007，27（2）：131134.
[6]青雪梅，李澎涛，胡京红，等.不同脑微血管内皮细胞条件培养液抗缺血及再灌神经元损伤的比较[J].中西医结合学报，2007，5（2）：183188.
[7]Degterev A，Huang Z，Boyce M，et al.Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury[J].Nat Chem Biol，2005，1（2）：112119.
[8]Vanden Berghe T，Kaiser WJ，Bertrand MJ，et al.Molecular crosstalk between apoptosis，necroptosis，and survival signaling[J].Mol Cell Oncol，2015，2（4）：e975093.
[9]Gautheron J，Vucur M，Schneider AT，et al.The necroptosisinducing kinase RIPK3 dampens adipose tissue inflammation and glucose intolerance[J].Nat Commun，2016，7：11869.
[10]Dong Y，Bao C，Yu J，et al.Receptorinteracting protein kinase 3mediated programmed cell necrosis in rats subjected to focal cerebal ischemiareperfusion injury[J].Mol Med Rep，2016，14（1）：728736.
[11]張翠翠.HIF1α在缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元Necroptosis中的表达及其意义[D].徐州：徐州医学院，2011.
（2016-08-16收稿责任编辑：徐颖）
关键词脑微血管内皮细胞；Necroptosis；zVADFMK；缺血再灌注损伤
AbstractObjective：To explore a model of necroptosis in brain microvascular endothelial cells （BMECs） by mimic ischemiareperfusion injury combined with zVADFMK （BenzyloxyearbonylValAlaAspfluoromethylketone， zVADFMK）. Methods：First， primary rat BMECs were cultured in oxygenglucose deprivation （OGD） and reintroduction conditions for various time points to screen a time of mimic ischemiareperfusion injury. Then， zVADFMK， the casepase inhibitor， was administrated at 20 μmol/L concentration on the ischemiareperfusion injured BMECs. The cell activity was detected by CCK8. The ultrastucture was observed using the transmission electron microscope. The death mode of BMECs was detected using cell ultrastructure； Annexin VFIT C/PI （propidium iodide） double staining to detect the type of cell death. Results：OGD 2 h and reintroduction 8 h was determined to be the time point of mimic ischemiareperfusion injury. After zVADFMK was administrated on ischemiareperfusion injuried BMECs， the cells viability didn′t change significantly. The necroptosis characteristic was presented under transmission electron microscope. The flowcytometry results showed that ratio of cells in each quadrant had no significant change. However， Nec1， a specific inhibitor of necroptosis， could significantly decrease the ratio of cells in quadrant Q2， suggesting that intervention of zVADFMK inhibited the late apoptosis and induced necroptosis occurrence. Conclusion：The necroptosis may be induced by zVADFMK in ischemiareperfusion injured BMECs， which provides the cell experimental model for researching necroptosis mechanism in the ischemic stroke in the future.
Key WordsBrain microvascular endothelial cells； Necroptosis； zVADFMK； Ischemiareperfusion injury
中圖分类号：R965文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.043
脑中风是严重影响人类身体健康，甚至威胁生命的疾病。在我国，位列疾病死因第一位，每年发生脑中风的患者达200万，其中缺血性脑中风所占的比率为70%～80%[1]。缺血再灌注损伤（Ischemiareperfusion Injury，IRI）是该病的重要病理生理过程，缺血再灌注损伤形式有多种，其中细胞死亡是主要损伤形式之一。除传统的凋亡和坏死外，近些年又发现一种新的细胞死亡形式—Necroptosis。已有证据表明，缺血缺氧模型的心肌细胞、神经细胞以及肿瘤存在Necroptosis[24]。脑微血管内皮细胞（Brain Microvascular Endothelial Cells，BMECs）作为血脑屏障的主要构成细胞，其功能受损和死亡参与了脑缺血的病理演变过程，但目前关于缺血诱导的脑微血管内皮细胞Necroptosis的研究甚少。本实验利用原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞，在氧糖剥夺诱导缺血再灌注损伤的基础上，选用目前应用最为广泛的caspase广谱性蛋白抑制剂zVADFMK（BenzyloxyearbonylValAlaAspfluoromethylketone）进行处理，以建立一种脑微血管内皮细胞Necroptosis体外模型，为今后深入研究脑缺血后脑微血管内皮细胞Necroptosis的发生机制及血管保护药物的疗效靶点奠定基础。 1材料与方法
11材料
111细胞采用本课题组已建立的大鼠脑微血管内皮细胞培养技术[5]，对20 g左右雄性SD大鼠进行细胞取材、培养和传代。实验中使用的第3代内皮细胞，其纯度达到98%以上[6]。
112试剂与仪器zVADFMK（美国Enzo Life Sciences公司），Nec1（美國Enzo Life Sciences公司），DMSO（美国Sigma公司），胎牛血清（excell bio南美血缘胎牛血清），DMEM/F12培养基干粉（美国Gibco公司），内皮细胞生长添加剂（ECGS，中科迈晨（北京）科技有限公司），明胶（美国Sigma公司），胰蛋白酶（美国Sigma公司），胶原酶Ⅱ型（美国Sigma公司），CCK8试剂盒（日本同仁化学研究所），Annexin VFITC and PI双染试剂盒（美国BD公司），倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司），XMark型酶标仪（美国BIORAD公司），流式细胞仪（美国BD公司），透射电子显微镜（日本H7650公司）。
12方法
121分组与模型制备将传至第3代的脑微血管内皮细胞随机分成3组：正常组、IRI组和IRI+zVADFMK组。筛选和制备拟缺血再灌注模型：在本室已建立的拟缺血损伤模型的基础上，重新筛选氧糖剥夺时间和复糖复氧时间，以制备稳定的拟缺血再灌注模型。第3代BMECs铺满瓶底约80%～90%时，吸出培养瓶内原培养液，用DHank′s洗涤两遍，换成无糖Kreb′s液，放置37 ℃含1%O2、95%N2和5% CO2的培养箱中培养2 h或3 h，然后取出培养瓶弃掉上清，换成DMEM/F12基础培养基，放进37 ℃、217%O2和5% CO2正常培养箱分别孵育0、4、8、12 h，每个时间点均设立正常对照组。造模结束后用CCK8试剂盒检测细胞活性，筛选合适的氧糖剥夺时间和复糖复氧时间，建立拟缺血再灌注损伤模型。
122干预方法除正常组外，其余2组按上述筛选出的拟缺血再灌注模型进行造模。IRI+zVADFMK组，造模前30 min及造模过程中按20 μmol/L浓度加入zVADFMK。造模及处理结束后，进行下列指标检测。
123检测指标与方法CCK8检测各组细胞活性：造模完成后弃上清，加入DMEM/F12培养基，每孔再加入10 μL CCK8溶液，在培养箱中继续孵育2 h后，用酶标仪测定各组的吸光光度值，检测波长为450 nm，每组设6个复孔。透射电镜观察细胞超微结构：造模结束后，消化并收集细胞，用DHank′s洗涤细胞2次，将细胞悬液置于15 mL EP管中，200 g水平离心10 min。用预冷25%戊二醛（pH 73）1 mL/管进行固定，PBS漂洗，之后用1%锇酸固定。以不同浓度的丙酮顺次脱水，环氧树脂包埋，光镜下进行修块，超薄切片机切成60 nm的薄片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，放于电子显微镜下观察并拍片。Annexin VFITC/PI双染色法检测细胞死亡方式：因细胞发生Necroptosis与晚期凋亡染色特征相似，因此本实验在上述3组的基础上，增加IRI+zVADFMK+Nec1（Necstatin1，Necroptosis特异性阻滞剂）组，即在造模前30 min及造模过程中加入20 μmol/L zVADFMK和10 μmol/Lnecstatin1。造模结束后，用不含EDTA的胰酶消化细胞，200 g离心5 min，弃上清；用预冷的DHank′s洗涤细胞两次，400 g离心5 min；每管加500 μL 1×Binding Buffer、5 μL Annexin VFITC吹打混匀，室温避光放置15 min后，在检测前5 min加入10 μLPI后，上流式细胞仪进行检测。
13统计学方法应用统计学软件SPSS 200进行数据分析，实验结果用均数±标准差（±s）表示，本实验数据处理应用t检验和单因素方差进行分析，以P<005为差异有统计学意义。
2结果
21确定拟缺血及再灌注时间图1为氧糖剥夺2 h，复氧复糖不同时间点的结果。造模前，正常组和模型组无统计学意义。与正常组比较，氧糖剥夺2 h时，细胞活性开始下降，但组间无统计学意义；复氧复糖4 h时，细胞活性显著下降（P<001），复氧复糖8 h时，细胞活性持续下降（P<001），复氧复糖12 h时，细胞活性降低，但与复氧复糖8 h组比较，变化不大。
从图1和图2综合来看，BMECs氧糖剥夺2 h后，细胞活性稍有下降，但无统计学意义，复氧复糖4～8 h是细胞明显损伤期。而氧糖剥夺3 h及复氧复糖各时间点细胞活性均显著下降，复氧复糖0～4 h是细胞明显损伤期，该损伤更接近于急性缺血性损伤。我们认为，氧糖剥夺2 h复氧复糖8 h，细胞损伤主要发生在再灌注过程中，更符合缺血再灌注损伤的特征，因此确定了氧糖剥夺2 h复氧复糖8 h来制备拟缺血再灌注损伤模型，以下实验均采用此条件造模。
22CCK8检测各组的细胞活性如表1结果所示，IRI组OD值较正常组显著降低（P<001），提示IRI组细胞活性显著下降；与IRI组比较，IRI+zVADFMK组OD值变化不明显。这一结果显示加入zVADFMK后，细胞活性没有明显升高，与本实验验证zVADFMK可能会诱导另一种细胞死亡形式相一致。
23透射电镜观察各组细胞形态学改变如图3所示，在透射电镜下，正常的脑微血管内皮细胞的细胞膜完整，细胞核呈椭圆形，染色质均匀，细胞器状态良好（图3a）。IRI组大多细胞核固缩或破裂，染色质凝聚，但细胞膜基本完整（图3b、3c）。IRI+zVADFMK组（图3d、e、f）：细胞膜完整性被破坏和内容物从胞内释放，细胞器肿胀，线粒体内脊消失呈空泡化，细胞核基本完整，这些变化与Necroptosis的形态特征相符合，提示zVADFMK可诱导拟缺血再灌注损伤BMECs发生Necroptosis。 24Annexin VFITC/PI双染色法检测细胞死亡方式如图4结果所示：与正常组相比，IRI组Q1、Q2、Q4象限细胞比率均显著升高（Q2、Q4象限P<001），Q3象限细胞比率显著降低（P<001），提示拟缺血再灌注损伤造成BMECs早期凋亡、晚期凋亡以及坏死率均显著增加；与IRI组相比，IRI+zVADFMK组Q1、Q2、Q3和Q4象限细胞比率變化不明显，无统计学意义。为了证明Q2象限细胞为Necroptosis，我们另设了IRI+zVADFMK+Nec1组，即在上述处理的基础上，利用Necroptosis抑制剂Nec1进行干预，结果显示，与IRI+zVADFMK组相比，IRI+zVADFMK+Nec1组Q2象限细胞比率显著降低（P<005），Q3象限比率显著升高（P<001），具有统计学意义，说明Nec1可显著降低Q2象限细胞比率，提示OGD+zVADFMK组Q2象限细胞死亡形式可能是Necroptosis。
3讨论
脑缺血后公认的细胞死亡类型包括缺血核心区即刻发生的细胞坏死，以及随后再灌注过程中的细胞凋亡。因此以往关于缺血再灌注损伤的研究多集中在细胞凋亡。2005年由哈佛大学课题组发现一种新型的细胞死亡形式，命名为Necroptosis，在国内被翻译为程序性坏死或坏死性凋亡，但以前者更被认可[7]。研究表明，Necroptosis是由死亡受体介导的，被一系列信号传导通路所调控的caspase非依赖性细胞死亡方式，同时具有坏死和凋亡的特征。在形态学方面，Necroptosis具有明显的坏死特征，主要表现为细胞器肿胀、细胞膜完整性破坏，细胞核完整等[8]。此外，在Necroptosis过程中，会释放大量损伤相关分子，引发严重的局部炎性反应，导致大量炎性反应细胞浸润和激活[9]；而在其发生机制方面类似于凋亡，由特定因子启动，依赖于死亡受体并按照一定信号通路和程序发生，可以对其过程进行调控，但其过程不依赖于caspase系统。随着研究的深入，发现Necroptosis与脑缺血再灌注损伤关系十分密切，在缺血性脑中风发病机制中占有重要地位，现已成为研究的热点[10]，这也为研制开发神经保护药物提供了新的靶点。
为了深入研究抑制Necroptosis对缺血性脑损伤的意义，人们探索了一些体外诱导细胞发生Necroptosis的方法，其中最常用的是在诱导凋亡的基础上加用zVADFMK进行干预[11]。其原理为细胞的死亡受体激活后，如果凋亡通路活化则诱导凋亡，凋亡过程是依赖caspase的，在caspase活性被抑制时会启动Necroptosis。zVADFMK是一种人工合成的广谱caspase抑制剂，能够抑制细胞凋亡发生过程中多种caspase酶的活性，因此可以诱导Necroptosis的发生。
本实验采用拟缺血再灌注损伤结合zVADFMK，探索了脑微血管内皮细胞Necroptosis模型。首先用cck8筛选了缺血再灌注时间，由于实验室前期发现氧糖剥夺6 h时，脑微血管内皮细胞已经发生急性缺血性损伤，因此本次实验从氧糖剥夺5 h以内摸索缺氧缺糖时间，再摸索再灌时间。结果缺氧4 h和5 h时，细胞损伤已很严重（数据未显示），最后弃掉，只做了缺氧缺糖2 h和3 h不同再灌时间点的模型。实验结果显示缺氧缺糖2 h再灌注8 h时，细胞损伤明显，且损伤主要发生在再灌后4～8 h，比较符合缺血再灌注损伤特点，因此确定该时间点作为模拟缺血再灌注损伤的时间点，建立了稳定的IRI模型。
然后，在IRI的基础上利用zVADFMK进行诱导，cck8结果显示IRI组OD值降低，IRI+zVADFMK组与IRI组相比无统计学意义，可能的原因为zVADFMK在抑制凋亡的同时诱导了另一种细胞死亡形式Necroptosis的发生，因此该组细胞活性总体没有明显升高。为了进一步揭示zVADFMK诱导的细胞死亡形式，本实验又用Annexin VFITC/PI双染色法通过流式细胞仪来检测，结果显示zVADFMK干预后各象限细胞比率变化不大。这一结果可能与Annexin VFITC/PI双染色法的原理和Necroptosis的细胞形态变化特征有关。在细胞发生凋亡的早期，Annexin VFITC可与外翻到细胞表面的磷酯酰丝氨酸结合，因此Annexin VFITC阳性被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。PI是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红。zVADFMK主要通过阻断caspase来抑制凋亡，对早期凋亡影响不大；Q2象限为Annexin V和PI染色均为阳性的细胞，一般代表晚期凋亡细胞，zVADFMK阻断caspase后，通过磷酸化RIP3诱导Necroptosis的发生，Necroptosis细胞Annexin V和PI染色也表现为双阳性，因此，zVADFMK抑制了晚期凋亡，但增加了Necroptosis的发生，使得Q2象限细胞比率变化不明显。为了证明Q2象限细胞的死亡方式为Necroptosis，我们另设了IRI+zVADFMK+Nec1组，即在上述处理的基础上，增加了Necroptosis特异性抑制剂Nec1干预，结果显示Nec1可有效降低Q2象限细胞比率，证明了Q2象限的细胞发生Necroptosis。该结果在投射电镜中再次被证实，IRI+zVADFMK组细胞膜破坏明显，线粒体肿胀，内脊消失呈空泡化，细胞核基本完整，这些变化符合Necroptosis的形态特征。总之，综合以上实验结果证实了：zVADFMK可诱导拟缺血再灌注脑微血管内皮细胞发生Necroptosis，为以后研究缺血性脑中风发生Necroptosis提供了细胞实验模型。
参考文献
[1]贾建平，陈生弟.神经病学[M].北京：人民卫生出版社，2013：170.
[2]Liu X，Zhang C，Zhang C，et al.Heat shock protein 70 inhibits cardiomyocyte necroptosis through repressing autophagy in myocardial ischemia/reperfusion injury[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim，2016，52（6）：690698. [3]Zhao Y，Huang G，Chen S，et al.Homocysteine Aggravates Cortical Neural Cell Injury through Neuronal Autophagy Overactivation following Rat Cerebral IschemiaReperfusion[J].Int J Mol Sci，2016，17（8）：523.
[4]Hu X，Han W，Li L.Targeting the Weak Point of Cancer by Induction of Necroptosis[J].Autophagy，2014，3（5）：490492.
[5]李卫红，李澎涛，华茜，等.不同内皮细胞条件培养液对皮层神经元线粒体功能的影响及通络救脑注射液的保护作用[J].中国中西医结合杂志，2007，27（2）：131134.
[6]青雪梅，李澎涛，胡京红，等.不同脑微血管内皮细胞条件培养液抗缺血及再灌神经元损伤的比较[J].中西医结合学报，2007，5（2）：183188.
[7]Degterev A，Huang Z，Boyce M，et al.Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury[J].Nat Chem Biol，2005，1（2）：112119.
[8]Vanden Berghe T，Kaiser WJ，Bertrand MJ，et al.Molecular crosstalk between apoptosis，necroptosis，and survival signaling[J].Mol Cell Oncol，2015，2（4）：e975093.
[9]Gautheron J，Vucur M，Schneider AT，et al.The necroptosisinducing kinase RIPK3 dampens adipose tissue inflammation and glucose intolerance[J].Nat Commun，2016，7：11869.
[10]Dong Y，Bao C，Yu J，et al.Receptorinteracting protein kinase 3mediated programmed cell necrosis in rats subjected to focal cerebal ischemiareperfusion injury[J].Mol Med Rep，2016，14（1）：728736.
[11]張翠翠.HIF1α在缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元Necroptosis中的表达及其意义[D].徐州：徐州医学院，2011.
（2016-08-16收稿责任编辑：徐颖）