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【摘要】目的：了解20株肺炎克雷伯菌(KPN)耐药性及β-内酰胺酶产生状况。方法：对20株KPN菌进行了16种β－内酰胺酶基因(TEM、SHV、CTX-M-1群、CTX-M-2群、CTX-M-9群、OXA-1群、OXA-2群、OXA-10群、PER、GES、VEB、CARB、DHA、ACT-1)检测。结果：20株KPN菌检出TEM、SHV、CTX-M-1群、CTX-M-9群、OXA-1群、DHA等6种β-内酰胺酶基因，阳性率分别为85%、25%、25%、20%、25%、70%。20株KPN菌中有19株至少检出1种β-内酰胺酶基因，最多同时检出6种β-内酰胺酶基因。并在国内首次发现CTX-M-55型。结论：该20株KPN菌β－内酰胺类抗菌药物耐药与产β-内酰胺酶密切相关。
【关键词】肺炎克雷伯菌β－内酰胺酶基因
【Abstract】Objective: To investigate the drug resistance and generation of β-lactamase of 20 strains of Klebsiella Pneumonia (KPN). Methods: Detection of 16 β-lactamase genes including TEM, SHV, CTX-M-1 group, CTX-M-2 group, CTX-M-9 group, OXA-1 group, OXA-2 group, OXA-10 group, PER, GES, VEB, CARB, DHA and ACT-1 were performed in 20 strains of KPN.Results: 6 β-lactamase genes such as TEM, SHV, CTX-M-1 group, CTX-M-9 group, OXA-1 group and DHA were detected in the 20 strains of KPN, with the positive rates were 85%, 25%, 25%, 20%, 25% and 70% respectively.In 19 of 20 strains of KPN, at least 1β-lactamase gene was detected, at most 6 β-lactamase genes were detected together in a strain of KPN. Furthermore, the CTX -M-55 type was found in our country for the first time. Conclusions: There is close relation between the drug resistance to β-lactamas and the produce of β-lactamase in the 20 strains of KPN.
【Keywords】Klebsiella Pneumoniaβ-lactamase genesgene
近年来肺炎克雷伯菌（K.pneumoniae,KPN）已成为医院感染的重要病原菌。国家细菌耐药监测网和全国医院感染监控网报告,KPN菌分离率列第2或3位［1,2］。新近国内尽管已有KPN菌的β－内酰胺酶部分基因研究报道，但所涉及基因种类不够全面［3~9］。为了解我院KPN菌产β－内酰胺酶存在状况，我们对20株分离自病人的KPN菌进行了16种β－内酰胺酶基因(TEM、SHV、CTX-M-1群、CTX-M-2群、CTX-M-9群、OXA-1群、OXA-2群、OXA-10群、PER、GES、VEB、CARB、DHA、ACT-1)检测，现报告如下。
1 材料与方法
1.1菌株来源及鉴定：17株为ICU患者之痰液，2株为其它科住院患者之痰液，1株为肾内科患者之中段尿。菌种鉴定为PhoenixTM-100全自动细菌鉴定药敏系统。
1.2抗菌药物敏感性试验：药敏试验按美国CLSI2006年版要求。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、铜绿假单胞菌ATCC27853均购自卫生部临床检验中心。
1.3药敏试验：抗菌药物敏感试验微量肉汤稀释法，抗菌药物包括氨苄西林、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢拉啶、头孢曲松、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢西丁、氨曲南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、左旋氧氟沙星、加替沙星、呋喃妥因、四环素、亚胺培南。
1.4β－内酰胺酶基因检测：
1.4.1模板制备:挑纯培养菌落置入0.5ml离心管内（内预置200ng/ml蛋白酶K溶液200μl）,56℃水浴2h，改95℃水浴10min，加入Chelex-100 40μl,离心（15000 rpm）30 s。上清液即为基因检测的模板液，-20℃冰箱保存备用。
1.4.2基因的检测:均为聚合酶链反应(PCR)法。引物序列见表1。各种靶基因PCR扩增体系均为: 每反应体系P1、P2引物各0.5μM,dNTPs各200mM, KCl 10mM,（NH4）2SO4 8mM，MgCl2 2mM，Tris-HCl（pH9.0） 10mM，NP40 0.5%，BSA 0.02%（wt/vol），Taq DNA pol 1U。总反应体积20μl（其中模板液5μl）。PCR扩增产物>500bp热循环参数均为：93℃预变性2min，然后93℃60s→55℃60s→72℃60s，热循环数35，最后一个72℃延长至5min。PCR扩增产物<500bp热循环参数均为：93℃预变性2min，然后93℃30s→55℃30s→72℃60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性。试剂盒、阳性对照DNA和PCR引物序列由无锡市克隆遗传技术研究所提供。
2 结果
2.1KPN菌对17种抗菌药物的敏感性,见表2。
2.2β内酰胺酶基因检测结果：20株KPN菌检出TEM、SHV、CTX-M-1群、CTX-M-9群、OXA-1群、DHA等6种β-内酰胺酶基因，阳性率分别为85%、25%、25%、20%、25%、70%。20株KPN菌中有19株至少检出1种β-内酰胺酶基因，15株同时检出2种以上β-内酰胺酶基因，最多同时检出6种β-内酰胺酶基因，只有1株没有检出β-内酰胺酶基因。TEM、DHA基因PCR电泳图见图1、2。1株CTX-M-1群PCR阳性产物经DNA测序和上网(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn)比对为CTX-M-55型(与登录号为ABI34705序列完全一致)；1株OXA-1群PCR阳性产物经DNA测序和上网比对为OXA-1型(与登录号为ABB99435序列完全一致)。图3、4为CTX-M-55型和OXA-1型测序图。
［M:分子量标记,由上而下分别为1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp,P:阳性对照,N:阴性对照,S:标本阳性］
［M:分子量标记,由上而下分别为1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp,P:阳性对照,N:阴性对照,S:标本阳性］
3 讨论
3.1国内研究情况:新近国内报道，KPN菌对β－内酰胺类和氨基糖苷类在内的常用抗菌药物出现多重耐药性,并且不断有KPN菌携带β－内酰胺酶基因的报道［3~9］。本组20株KPN菌氨苄西林、头孢拉啶、头孢曲松、头孢噻肟、头孢吡肟均为耐药，20株KPN菌中有19株至少检出1种β-内酰胺酶基因，15株同时检出2种以上β-内酰胺酶基因，最多同时检出6种β-内酰胺酶基因。国内曾报道的同时携带多种β-内酰胺酶基因的有昆明(3种)［3］、深圳与南京(4种)［5,8］。
3.2本组研究情况:本组耐药表型与β-内酰胺酶基因检测状况基本相符。DHA型β-内酰胺酶可耐头孢西丁，并对β-内酰胺酶抑制剂不敏感。20株KPN菌DHA型β-内酰胺酶基因阳性率70%，与头孢西丁75%耐药、哌拉西林/他唑巴坦70%耐药也基本相符。可见本组20株KPN菌β－内酰胺类抗菌药物耐药与产β-内酰胺酶密切相关。1株CTX-M-1群PCR阳性产物经DNA测序和上网(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn)比对为CTX-M-55型，为国内首次发现该基因型。
(PCR引物由无锡市克隆遗传技术研究所糜祖煌老师根据2006年10月30日之前已在www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotid登录各基因及其亚型序列的保守区域完成设计,特此致谢)
参考文献
1 马越、李景云、张新妹等.2002年临床常见细菌耐药性监测［J］.中华检验医学杂志，2004，27(1)：38~45
2 吴安华、文细毛、任南等.全国医院感染监控网医院呼吸道、泌尿道、胃肠道感染病原学及其变迁［J］.中国感染控制杂志,2003,2(4):252~255
3 胡大春、邵剑春、杨绍敏等.肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶的基因研究.中国抗生素杂志,2006;31(1):19~22
4 杜敏、陈旭、马尚柱等.新疆地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶的基因型研究［J］.中华医院感染学杂志,2006,16(4):361~364
5 陈生汶、卢月梅、张阮章等.大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌超广谱β－内酰胺酶的基因分型研究［J］.中华检验医学杂志,2006,29(2):166~167
6 孙自镛、程黎明、朱旭慧等.产超广谱β－内酰胺酶49株细菌耐药基因凋查［J］,中华检验医学杂志,2006;29(9):793~796
7 宁永忠、王辉、孙宏莉等.大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产生的超广谱β－内酰胺酶和质粒AmpC型β-内酰胺酶分子流行病学研究［J］,中华微生物学和免疫学杂志，2006,26(10):944~949
8 王文晶、黄茂、赵旺胜等.下呼吸道感染产ESBLs肺炎克雷伯菌基因型分析［J］.中国感染与化疗杂志,2006;6(6):389~392
9 刘朝晖、张盛斌、杨银悔等.产超广谱β-大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌blaCTX-M基因型及耐药性检测［J］.世界感染杂志,2006,6(6):504~508
作者单位:213003江苏省常州市第一人民医院呼吸内科
【关键词】肺炎克雷伯菌β－内酰胺酶基因
【Abstract】Objective: To investigate the drug resistance and generation of β-lactamase of 20 strains of Klebsiella Pneumonia (KPN). Methods: Detection of 16 β-lactamase genes including TEM, SHV, CTX-M-1 group, CTX-M-2 group, CTX-M-9 group, OXA-1 group, OXA-2 group, OXA-10 group, PER, GES, VEB, CARB, DHA and ACT-1 were performed in 20 strains of KPN.Results: 6 β-lactamase genes such as TEM, SHV, CTX-M-1 group, CTX-M-9 group, OXA-1 group and DHA were detected in the 20 strains of KPN, with the positive rates were 85%, 25%, 25%, 20%, 25% and 70% respectively.In 19 of 20 strains of KPN, at least 1β-lactamase gene was detected, at most 6 β-lactamase genes were detected together in a strain of KPN. Furthermore, the CTX -M-55 type was found in our country for the first time. Conclusions: There is close relation between the drug resistance to β-lactamas and the produce of β-lactamase in the 20 strains of KPN.
【Keywords】Klebsiella Pneumoniaβ-lactamase genesgene
近年来肺炎克雷伯菌（K.pneumoniae,KPN）已成为医院感染的重要病原菌。国家细菌耐药监测网和全国医院感染监控网报告,KPN菌分离率列第2或3位［1,2］。新近国内尽管已有KPN菌的β－内酰胺酶部分基因研究报道，但所涉及基因种类不够全面［3~9］。为了解我院KPN菌产β－内酰胺酶存在状况，我们对20株分离自病人的KPN菌进行了16种β－内酰胺酶基因(TEM、SHV、CTX-M-1群、CTX-M-2群、CTX-M-9群、OXA-1群、OXA-2群、OXA-10群、PER、GES、VEB、CARB、DHA、ACT-1)检测，现报告如下。
1 材料与方法
1.1菌株来源及鉴定：17株为ICU患者之痰液，2株为其它科住院患者之痰液，1株为肾内科患者之中段尿。菌种鉴定为PhoenixTM-100全自动细菌鉴定药敏系统。
1.2抗菌药物敏感性试验：药敏试验按美国CLSI2006年版要求。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、铜绿假单胞菌ATCC27853均购自卫生部临床检验中心。
1.3药敏试验：抗菌药物敏感试验微量肉汤稀释法，抗菌药物包括氨苄西林、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢拉啶、头孢曲松、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢西丁、氨曲南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、左旋氧氟沙星、加替沙星、呋喃妥因、四环素、亚胺培南。
1.4β－内酰胺酶基因检测：
1.4.1模板制备:挑纯培养菌落置入0.5ml离心管内（内预置200ng/ml蛋白酶K溶液200μl）,56℃水浴2h，改95℃水浴10min，加入Chelex-100 40μl,离心（15000 rpm）30 s。上清液即为基因检测的模板液，-20℃冰箱保存备用。
1.4.2基因的检测:均为聚合酶链反应(PCR)法。引物序列见表1。各种靶基因PCR扩增体系均为: 每反应体系P1、P2引物各0.5μM,dNTPs各200mM, KCl 10mM,（NH4）2SO4 8mM，MgCl2 2mM，Tris-HCl（pH9.0） 10mM，NP40 0.5%，BSA 0.02%（wt/vol），Taq DNA pol 1U。总反应体积20μl（其中模板液5μl）。PCR扩增产物>500bp热循环参数均为：93℃预变性2min，然后93℃60s→55℃60s→72℃60s，热循环数35，最后一个72℃延长至5min。PCR扩增产物<500bp热循环参数均为：93℃预变性2min，然后93℃30s→55℃30s→72℃60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性。试剂盒、阳性对照DNA和PCR引物序列由无锡市克隆遗传技术研究所提供。
2 结果
2.1KPN菌对17种抗菌药物的敏感性,见表2。
2.2β内酰胺酶基因检测结果：20株KPN菌检出TEM、SHV、CTX-M-1群、CTX-M-9群、OXA-1群、DHA等6种β-内酰胺酶基因，阳性率分别为85%、25%、25%、20%、25%、70%。20株KPN菌中有19株至少检出1种β-内酰胺酶基因，15株同时检出2种以上β-内酰胺酶基因，最多同时检出6种β-内酰胺酶基因，只有1株没有检出β-内酰胺酶基因。TEM、DHA基因PCR电泳图见图1、2。1株CTX-M-1群PCR阳性产物经DNA测序和上网(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn)比对为CTX-M-55型(与登录号为ABI34705序列完全一致)；1株OXA-1群PCR阳性产物经DNA测序和上网比对为OXA-1型(与登录号为ABB99435序列完全一致)。图3、4为CTX-M-55型和OXA-1型测序图。
［M:分子量标记,由上而下分别为1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp,P:阳性对照,N:阴性对照,S:标本阳性］
［M:分子量标记,由上而下分别为1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp,P:阳性对照,N:阴性对照,S:标本阳性］
3 讨论
3.1国内研究情况:新近国内报道，KPN菌对β－内酰胺类和氨基糖苷类在内的常用抗菌药物出现多重耐药性,并且不断有KPN菌携带β－内酰胺酶基因的报道［3~9］。本组20株KPN菌氨苄西林、头孢拉啶、头孢曲松、头孢噻肟、头孢吡肟均为耐药，20株KPN菌中有19株至少检出1种β-内酰胺酶基因，15株同时检出2种以上β-内酰胺酶基因，最多同时检出6种β-内酰胺酶基因。国内曾报道的同时携带多种β-内酰胺酶基因的有昆明(3种)［3］、深圳与南京(4种)［5,8］。
3.2本组研究情况:本组耐药表型与β-内酰胺酶基因检测状况基本相符。DHA型β-内酰胺酶可耐头孢西丁，并对β-内酰胺酶抑制剂不敏感。20株KPN菌DHA型β-内酰胺酶基因阳性率70%，与头孢西丁75%耐药、哌拉西林/他唑巴坦70%耐药也基本相符。可见本组20株KPN菌β－内酰胺类抗菌药物耐药与产β-内酰胺酶密切相关。1株CTX-M-1群PCR阳性产物经DNA测序和上网(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn)比对为CTX-M-55型，为国内首次发现该基因型。
(PCR引物由无锡市克隆遗传技术研究所糜祖煌老师根据2006年10月30日之前已在www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotid登录各基因及其亚型序列的保守区域完成设计,特此致谢)
参考文献
1 马越、李景云、张新妹等.2002年临床常见细菌耐药性监测［J］.中华检验医学杂志，2004，27(1)：38~45
2 吴安华、文细毛、任南等.全国医院感染监控网医院呼吸道、泌尿道、胃肠道感染病原学及其变迁［J］.中国感染控制杂志,2003,2(4):252~255
3 胡大春、邵剑春、杨绍敏等.肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶的基因研究.中国抗生素杂志,2006;31(1):19~22
4 杜敏、陈旭、马尚柱等.新疆地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶的基因型研究［J］.中华医院感染学杂志,2006,16(4):361~364
5 陈生汶、卢月梅、张阮章等.大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌超广谱β－内酰胺酶的基因分型研究［J］.中华检验医学杂志,2006,29(2):166~167
6 孙自镛、程黎明、朱旭慧等.产超广谱β－内酰胺酶49株细菌耐药基因凋查［J］,中华检验医学杂志,2006;29(9):793~796
7 宁永忠、王辉、孙宏莉等.大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产生的超广谱β－内酰胺酶和质粒AmpC型β-内酰胺酶分子流行病学研究［J］,中华微生物学和免疫学杂志，2006,26(10):944~949
8 王文晶、黄茂、赵旺胜等.下呼吸道感染产ESBLs肺炎克雷伯菌基因型分析［J］.中国感染与化疗杂志,2006;6(6):389~392
9 刘朝晖、张盛斌、杨银悔等.产超广谱β-大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌blaCTX-M基因型及耐药性检测［J］.世界感染杂志,2006,6(6):504~508
作者单位:213003江苏省常州市第一人民医院呼吸内科