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摘要：干细胞分为全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞。其中专能干細胞只能在某一特定的组织器官应用中修复一种组织。本次试验，基于骨干细胞治疗骨疾病的应用研究，36只试验兔子构建动物模型。将试验兔分为2组进行试验。其中一个组使用干细胞分泌因子修复液，另一个对照组未使用。结果证明：干细胞分泌因子在相同动物的骨损伤上的应用呈显著差异性，有修复骨细胞功效。通过本次试验说明了干细胞分泌因子在骨修复临床应用上有一定效果。
关键词：干细胞分泌因子、专能干细胞、0.5 ml甲基纤维素凝胶、动物模型
前言
这些成年干细胞已得到广泛的研究并在医疗上有所应用。蒋桃[1]等人用犬做过研究。蒋桃的试验方法：采用12只幼年中华田园犬，按幼犬免疫和驱虫程序进行免疫、驱虫后进行全面体检合格后作试验犬。在每只试验犬背部作3个30mm*30mm皮肤损伤模型，结论：干细胞分泌因子治疗创面愈合速度明显提高，显著缩短疗程，创面肉芽组织、血管、汗腺、毛囊等生长更好。研究结果表明，采用干细胞分泌因子修复犬皮肤损伤（包括车祸、皮肤病、外科损伤）具有良好效果，能加快修复皮肤速度 。作者采用36只兔随机分为实验组和对照组，每组18只，构建动物模型。其中一个组使用干细胞分泌因子修复液，另一个对照组未使用。试验从干细胞分泌物因子在实验兔骨损伤的应用，对动物骨病治疗方面提供生物制剂治疗提供依据。
一、干细胞分泌因子相关内容
（一）干细胞分泌因子的概念：
1、干细胞分泌因子的概念
是指那些未分化的、因而有可能分化成不同类型细胞的细胞，具有自我更新，高度分化的细胞。
2、干细胞分泌因子的来源
2.1干细胞按其功能分化分为全 能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。全能干细胞可以形成完整组织器官;多能干细胞可以用于血管，软组织的修复;专能干细胞是只能形成一种组织。[2]
3、课题研究的目的
成年实验兔干细胞分泌因子动物模型已得到广泛研究并为医疗上应用提供依据。本次研究基于专能干细胞的应用。
（二）干细胞分泌因子的研究路径设想
在宠物临床诊疗时，发现宠物在治疗组织器官损伤时，骨骼组织的损伤手术过程繁琐，医疗费用较高，后遗症严重，希望用干细胞修复组织器官能力修复骨骼，动物能够痊愈，并且减少后遗症。故采用试验动物兔子进行试验。
二、材料方法
1、药物试剂及设备
500ml生物化学制品*Biological Industries， 1g/支甲基纤维素，10%水合氯醛2 ml，辛伐他汀乙醇。4 ℃冰箱，磁力搅拌器，180升烤箱
2、实验对象
36只成年雄性新西兰大耳白兔（体重2-3 kg，动物实验中心提供），所有实验兔均在清洁级动物房内饲养[3]，实验过程对动物的处置符合伦理学标准，本次实验材料使用的是体外干细胞增殖分化为干细胞分泌因子，没有杀伤动物的方法试验，所以符合伦理学标准。
36只兔随机分为实验组和对照组，每组18只。其中18只不做处理，作为①对照组;[4]行单侧（左上肢）冈上肌肩袖组织撕裂修补术，另外18只作为②实验组;行单侧（左上肢）冈上肌肩袖组织撕裂修补术，同时给予干细胞分泌因子。术后所有兔均按标准条件饲养并分别于术后14天，28天，56天各处死6只兔子，留取手术部位局部标本[5]，进行生物力学检测和组织学观察，观察比较两种模型愈合过程中的相似程度。对照组不做处理，观察在相同条件下自然发病的临床症状。使用自己制备的干细胞分泌因子。[5]
3、手术方式
3.1常规饲养7天，开始做动物模型，确认饮食活动正常，用直径为0.8 mm的克氏针自骨槽内侧向肱骨大结节外侧皮质钻两个骨孔，用丝线缝合穿过骨孔将冈上肌肌腱断端拉回骨槽[4]。
3.3在打结固定前，实验组在骨槽内注入 0.5 ml干细胞分泌因子/甲基纤维素凝胶;【4引证】
3.4对照组注入 0.5 ml甲基纤维素凝胶，逐层缝合切口。
4.4西安百奥普生物有限公司进行。干细胞分泌因子修复液由该公司提供。试验使用在云南昆明某试验农场完成。
5、检测方法
5.1实验标本收集
5.1.1实验组和对照组兔子于术后第14、28、56天各处死6只，以冈上肌止点为中心，截除近端的肩胛骨和远端肱骨，仅保留冈上肌腱与近端肱骨，剔除其余软组织，用浸过生理盐水的湿纱布包裹后行生物力学测试，测试完毕后，将标本浸泡在10%的中性福尔马林溶液中，4 ℃冰箱保存。[5]
5.2生物力学测试
将标本同定在Instron 3300电子万能材料试验机上进行拉伸试验，每个标本先以6N的拉力预处理1分钟，然后以载荷率为5 mm/min行拉断试验，测量最大载荷与刚度。
5.3 组织学染色
5.3.1将生物力学测试完的标本置于10%多醛溶液固定24 h后EDTA脱钙，然后再经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，石蜡包埋，沿腱一骨界面纵轴切片，制成4 μm厚的切片，术后14、28、56天进行HE染色和甲苯胺蓝染色，观察软骨细胞和成纤维细胞的含量。[6]
5.3.2 HE染色操作。用蜡笔在血膜两头画线，以防染液溢出。然后将血涂片平放在染色架上。[9]用瑞氏染液3～5滴覆盖整个血膜固定细胞0.5～1 min。滴加等量或稍多的缓冲液，用洗耳球将其与染液吹匀，染色5～10 min。慢慢摇动玻片，然后用流动水从玻片的一侧冲去染液，待血涂片自然干燥后（或用滤纸吸干），即可镜检。加蓝流由天青-伊红组成，对细胞核着色较好，结构显示更清[9]。
5.4统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件处理数據，该方法是目前通用的的生物统计方法，数据以均数±标准差（±s）表示，组间差异采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），以P<0.05验证差异是否有统计学意义。[7]
三、结果
1一般结果
实验组和对照组中动物在术后出现运动机能障碍，手术侧肢体活动失调的情况，其中有一部分兔局部组织感染化脓的现象（感染率约5%）;饮食无明显变化，体重无明显变化。
对照组有化脓性滑膜炎，临床症状为跛行，触摸肩关节肿胀，髋关节不易触摸。
2对照组实验室血常规结果表1-2[8]
3对照组临床检查 表1-2[8]
4发病原理：
化脓的体温升高的原因是由炎症引起的，表现为粘膜充血、水肿和出血，并被覆多量黄白色脓样分泌物。
5组织切片染色结果
5.1取第56天骨做骨组织切片，同时进行组织切片HE和Masson染色。HE染色观察：细胞核呈蓝色，细胞质呈淡红色。Masson染色观察：胶原纤维呈蓝色，肌纤维、细胞质、纤维素、角蛋白和红细胞呈红色，细胞核呈蓝褐色。[10]
5.2实验结果显示，术后56天，实验组肌腱与骨结合紧密，肌腱胶原纤维粗大规则，与正常的腱骨界面结构相似;
5.3对照组腱骨间隙模糊，胶原纤维连接紊乱。
5.4生物力学检测结果，如下表
四、结论：
1、通过本次试验证明干细胞分泌因子在相同动物的骨损伤上的应用呈显著差异性，有修复骨细胞功效。
2、通过本次试验解决干细胞分泌因子在骨修复临床应用上有一定效果。因为干细胞分泌因属于自体细胞，最具活力，最具影响力，未来干细胞分泌因子可以解决动物骨坏死的新型治疗方法。
3、安全性由于采用体外复制技术，已具备自体细胞移植能力，对传统治疗的一种革命。
4、在骨损伤修复过程中创口愈合期最少14天能够愈合。所以设置时间分别为14天、28天、56天。说明骨损伤愈合效果，用药时间越长，愈合效果越好。
五、干细胞研究前景
1、干细胞分化为诱导分化细胞注射到动物机体，没有形成肿瘤，说明对疾病治疗是安全的。
2、成年干细胞也具有一定的可塑性，形成个体发育机制的材料
3、研究新药开发，直接用于疾病治疗，如骨干细胞分泌在兔机体形成骨组织修复骨损伤。
参考文献：
[1]蒋桃，犬干细胞分泌因子对皮肤损伤修复的应用研究[D];云南农业大学;2017年 [1]
[2]斐雪涛、干细胞生物学，科学出版社，2003;4-15
[3]中华人民共和国卫生行业标准（WS233-2002）对生物安全三级（P3）实验室进行了规定《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》。 2015年7月6日
[4]李肯、于腾波等，辛伐他汀作兔肩袖损伤修复术骨腱-骨愈合的实验研究 中国运动医学杂志 2019年1月
[5]陈喆（导师：汪益民），中国人民解放军海军愈合模型的比较 2019年6月
[6]任俊玲，血液常规检验 ， 兽医实验室诊断（第1版）[D]中国农业出版社 2019年 [24页]
[7]目前国内通用的试验技术方法。
[8]简载华， 兽医手册[D]（第3版）江西科学技术出版社 2000年[20页]
[9]任俊玲 兽医实验室诊断 [D] （第1版）中国农业大学出版社
致谢感谢西安百奥普生物科技公司为本次试验提供试剂、试验材料、检测。
关键词：干细胞分泌因子、专能干细胞、0.5 ml甲基纤维素凝胶、动物模型
前言
这些成年干细胞已得到广泛的研究并在医疗上有所应用。蒋桃[1]等人用犬做过研究。蒋桃的试验方法：采用12只幼年中华田园犬，按幼犬免疫和驱虫程序进行免疫、驱虫后进行全面体检合格后作试验犬。在每只试验犬背部作3个30mm*30mm皮肤损伤模型，结论：干细胞分泌因子治疗创面愈合速度明显提高，显著缩短疗程，创面肉芽组织、血管、汗腺、毛囊等生长更好。研究结果表明，采用干细胞分泌因子修复犬皮肤损伤（包括车祸、皮肤病、外科损伤）具有良好效果，能加快修复皮肤速度 。作者采用36只兔随机分为实验组和对照组，每组18只，构建动物模型。其中一个组使用干细胞分泌因子修复液，另一个对照组未使用。试验从干细胞分泌物因子在实验兔骨损伤的应用，对动物骨病治疗方面提供生物制剂治疗提供依据。
一、干细胞分泌因子相关内容
（一）干细胞分泌因子的概念：
1、干细胞分泌因子的概念
是指那些未分化的、因而有可能分化成不同类型细胞的细胞，具有自我更新，高度分化的细胞。
2、干细胞分泌因子的来源
2.1干细胞按其功能分化分为全 能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。全能干细胞可以形成完整组织器官;多能干细胞可以用于血管，软组织的修复;专能干细胞是只能形成一种组织。[2]
3、课题研究的目的
成年实验兔干细胞分泌因子动物模型已得到广泛研究并为医疗上应用提供依据。本次研究基于专能干细胞的应用。
（二）干细胞分泌因子的研究路径设想
在宠物临床诊疗时，发现宠物在治疗组织器官损伤时，骨骼组织的损伤手术过程繁琐，医疗费用较高，后遗症严重，希望用干细胞修复组织器官能力修复骨骼，动物能够痊愈，并且减少后遗症。故采用试验动物兔子进行试验。
二、材料方法
1、药物试剂及设备
500ml生物化学制品*Biological Industries， 1g/支甲基纤维素，10%水合氯醛2 ml，辛伐他汀乙醇。4 ℃冰箱，磁力搅拌器，180升烤箱
2、实验对象
36只成年雄性新西兰大耳白兔（体重2-3 kg，动物实验中心提供），所有实验兔均在清洁级动物房内饲养[3]，实验过程对动物的处置符合伦理学标准，本次实验材料使用的是体外干细胞增殖分化为干细胞分泌因子，没有杀伤动物的方法试验，所以符合伦理学标准。
36只兔随机分为实验组和对照组，每组18只。其中18只不做处理，作为①对照组;[4]行单侧（左上肢）冈上肌肩袖组织撕裂修补术，另外18只作为②实验组;行单侧（左上肢）冈上肌肩袖组织撕裂修补术，同时给予干细胞分泌因子。术后所有兔均按标准条件饲养并分别于术后14天，28天，56天各处死6只兔子，留取手术部位局部标本[5]，进行生物力学检测和组织学观察，观察比较两种模型愈合过程中的相似程度。对照组不做处理，观察在相同条件下自然发病的临床症状。使用自己制备的干细胞分泌因子。[5]
3、手术方式
3.1常规饲养7天，开始做动物模型，确认饮食活动正常，用直径为0.8 mm的克氏针自骨槽内侧向肱骨大结节外侧皮质钻两个骨孔，用丝线缝合穿过骨孔将冈上肌肌腱断端拉回骨槽[4]。
3.3在打结固定前，实验组在骨槽内注入 0.5 ml干细胞分泌因子/甲基纤维素凝胶;【4引证】
3.4对照组注入 0.5 ml甲基纤维素凝胶，逐层缝合切口。
4.4西安百奥普生物有限公司进行。干细胞分泌因子修复液由该公司提供。试验使用在云南昆明某试验农场完成。
5、检测方法
5.1实验标本收集
5.1.1实验组和对照组兔子于术后第14、28、56天各处死6只，以冈上肌止点为中心，截除近端的肩胛骨和远端肱骨，仅保留冈上肌腱与近端肱骨，剔除其余软组织，用浸过生理盐水的湿纱布包裹后行生物力学测试，测试完毕后，将标本浸泡在10%的中性福尔马林溶液中，4 ℃冰箱保存。[5]
5.2生物力学测试
将标本同定在Instron 3300电子万能材料试验机上进行拉伸试验，每个标本先以6N的拉力预处理1分钟，然后以载荷率为5 mm/min行拉断试验，测量最大载荷与刚度。
5.3 组织学染色
5.3.1将生物力学测试完的标本置于10%多醛溶液固定24 h后EDTA脱钙，然后再经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，石蜡包埋，沿腱一骨界面纵轴切片，制成4 μm厚的切片，术后14、28、56天进行HE染色和甲苯胺蓝染色，观察软骨细胞和成纤维细胞的含量。[6]
5.3.2 HE染色操作。用蜡笔在血膜两头画线，以防染液溢出。然后将血涂片平放在染色架上。[9]用瑞氏染液3～5滴覆盖整个血膜固定细胞0.5～1 min。滴加等量或稍多的缓冲液，用洗耳球将其与染液吹匀，染色5～10 min。慢慢摇动玻片，然后用流动水从玻片的一侧冲去染液，待血涂片自然干燥后（或用滤纸吸干），即可镜检。加蓝流由天青-伊红组成，对细胞核着色较好，结构显示更清[9]。
5.4统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件处理数據，该方法是目前通用的的生物统计方法，数据以均数±标准差（±s）表示，组间差异采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），以P<0.05验证差异是否有统计学意义。[7]
三、结果
1一般结果
实验组和对照组中动物在术后出现运动机能障碍，手术侧肢体活动失调的情况，其中有一部分兔局部组织感染化脓的现象（感染率约5%）;饮食无明显变化，体重无明显变化。
对照组有化脓性滑膜炎，临床症状为跛行，触摸肩关节肿胀，髋关节不易触摸。
2对照组实验室血常规结果表1-2[8]
3对照组临床检查 表1-2[8]
4发病原理：
化脓的体温升高的原因是由炎症引起的，表现为粘膜充血、水肿和出血，并被覆多量黄白色脓样分泌物。
5组织切片染色结果
5.1取第56天骨做骨组织切片，同时进行组织切片HE和Masson染色。HE染色观察：细胞核呈蓝色，细胞质呈淡红色。Masson染色观察：胶原纤维呈蓝色，肌纤维、细胞质、纤维素、角蛋白和红细胞呈红色，细胞核呈蓝褐色。[10]
5.2实验结果显示，术后56天，实验组肌腱与骨结合紧密，肌腱胶原纤维粗大规则，与正常的腱骨界面结构相似;
5.3对照组腱骨间隙模糊，胶原纤维连接紊乱。
5.4生物力学检测结果，如下表
四、结论：
1、通过本次试验证明干细胞分泌因子在相同动物的骨损伤上的应用呈显著差异性，有修复骨细胞功效。
2、通过本次试验解决干细胞分泌因子在骨修复临床应用上有一定效果。因为干细胞分泌因属于自体细胞，最具活力，最具影响力，未来干细胞分泌因子可以解决动物骨坏死的新型治疗方法。
3、安全性由于采用体外复制技术，已具备自体细胞移植能力，对传统治疗的一种革命。
4、在骨损伤修复过程中创口愈合期最少14天能够愈合。所以设置时间分别为14天、28天、56天。说明骨损伤愈合效果，用药时间越长，愈合效果越好。
五、干细胞研究前景
1、干细胞分化为诱导分化细胞注射到动物机体，没有形成肿瘤，说明对疾病治疗是安全的。
2、成年干细胞也具有一定的可塑性，形成个体发育机制的材料
3、研究新药开发，直接用于疾病治疗，如骨干细胞分泌在兔机体形成骨组织修复骨损伤。
参考文献：
[1]蒋桃，犬干细胞分泌因子对皮肤损伤修复的应用研究[D];云南农业大学;2017年 [1]
[2]斐雪涛、干细胞生物学，科学出版社，2003;4-15
[3]中华人民共和国卫生行业标准（WS233-2002）对生物安全三级（P3）实验室进行了规定《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》。 2015年7月6日
[4]李肯、于腾波等，辛伐他汀作兔肩袖损伤修复术骨腱-骨愈合的实验研究 中国运动医学杂志 2019年1月
[5]陈喆（导师：汪益民），中国人民解放军海军愈合模型的比较 2019年6月
[6]任俊玲，血液常规检验 ， 兽医实验室诊断（第1版）[D]中国农业出版社 2019年 [24页]
[7]目前国内通用的试验技术方法。
[8]简载华， 兽医手册[D]（第3版）江西科学技术出版社 2000年[20页]
[9]任俊玲 兽医实验室诊断 [D] （第1版）中国农业大学出版社
致谢感谢西安百奥普生物科技公司为本次试验提供试剂、试验材料、检测。