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摘要：近年来，糖化血红蛋白的检测已成为糖尿病诊断及监测的有效指标，现就目前糖化血红蛋白检测方法的研究进展进行综述。
关键词：糖化血红蛋白，检测技术，综述
【中图分类号】R331.1+41 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2021）05-112-01
1 概述
近年来，我国糖尿病患者的人数逐年攀升，据中国官方统计数据，2020版的指南更新的流调数据显示，糖尿病患病率已达11.2%。糖尿病的治疗是一个漫长的过程，因而对糖尿病的健康管理显得尤为重要，手段主要以饮食管理和降糖药物控制为主，联合空腹血糖与糖化血红蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）定期监测血糖水平，有效控糖。HbA1c是在长时间、高浓度血糖存在的条件下，血红蛋白与葡萄糖进行非酶促反应结合形成的一种产物，其生成过程缓慢且不可逆，并且贯穿存在于红细胞的整个生命周期中（120天），浓度相对稳定，反映的是患者过去2～3个月的平均血液中葡萄糖水平，可以联合空腹血糖等其他指标诊断及监测糖尿病。现就目前检测糖化血红蛋白的检测方法研究进展进行综述。
2 HbA1c的检测方法
HbA1c为属于血红蛋白p链的一个或两个n端缬草上的d-葡萄糖，是一种生物标记物，用于诊断和识别患糖尿病（DM）的高危患者。根据糖尿病的诊断标准， HbA1c 水平>6.5%（>48mmol/mol）可导致糖尿病;而把HbA1c水平介于5.7-6.4%（39-46mmol/mol）归为糖尿病前期。近年来，糖化血红蛋白的检测技术也越来越标准化，目前可分为以下几大类。
2.1 免疫反应法 利用抗原抗体特异性反应检测糖化血红蛋白，以血红蛋白β链糖化N末端的4～8个氨基酸残基作为识别位点，生产单克隆抗体，按照反应结合物质的不同，可形成不同的检测方法。
2.1.1胶乳凝集抑制法 检测试剂中以数个HbA1c抗原决定簇形成的聚集物作为凝集素，抗-HbA1c抗体抗原与之结合形成不溶性的抗原抗体复合物，加入全血样本后，血液中的HbA1c将与聚集物产生竞争关系，争夺乳胶颗粒上的抗-HbA1c抗体，抑制凝集物生成，根据测定的吸光度值可计算出HbA1c在总血红蛋白（Hb）中的百分含量。该方法成本低、快速、基本能保证检测准确性，可在全自动生化仪上完成，适用于大批量样本检测，但易受高浓度的葡萄糖、三酰甘油及胆红素等物质干扰[2]。
2.1.2胶乳凝集免疫比浊法 HbA1c与抗-HbA1c抗体复合物是可溶性的，再加入多聚半抗原缓冲液抗原与剩余的抗-HbA1c抗体结合成不可溶性物质，双通道分别测定溶液中Hb和HbA1c的含量，即可求得HbA1c在总Hb中的百分含量，该方法精密度高，线性良好，虽然影响因素较多，但鉴于成本低，可进行自动化的临床优势，还是具有一定的替代价值。
2.1.3离子捕获法 即化学发光法，将荧光标记物结合到HbA1c抗原抗体复合物上，再联结带负电荷的多聚阴离子形成复合物，该复合物会吸附于试剂中的带正电荷的纤维表面，经反复清洗后可测定其荧光强度，从而得到HbA1c的濃度。该方法与上述两种方法具有相似的检测优越性，且回收率高，交叉污染率低[3]。
2.1.4荧光免疫法与放射免疫法 荧光法为离子捕获法的衍生方法，原理相同，但可计算HbA1c的浓度。荧光法和放射法的检测优略势几乎相同，可批量、重复检测，且准确度、精密度、特异性都较为良好，干扰因素也极少，但前者仪器及试剂成本高昂，后者制备试剂困难，故两种方法在临床上难以作为常规检测方法[4]。
2.2电荷间差异检测
2.2.1离子交换层析法 原理为血红蛋白糖化后所带电荷改变，在不同pH的磷酸盐缓冲液中，可以将树脂上不同吸附力的GHb组分（包括HbA及HbA1的各组分）分批依次洗脱出来，绘制相应Hb的层析谱，即可求得HbA1c在GHb的百分率。常见的离子交换层析法主要有树脂微柱法、低效液相色谱法（LPLC）及高效液相色谱法（HPLC），其中HPLC 是目前为国际公认的检验HbA1c的金标准，但此法相关仪器、试剂及耗材昂贵，在基层医院难以推广普及;LPLC 测定原理与HPLC一致，但LPLC难以分辨变异血红蛋白，往往将其归为HbA1c，使假阳性率偏高，树脂微柱法适合检测大量标本，但干扰因素极多，且重复性较差。
2.2.2电泳法 常用的有琼脂糖凝胶电泳法、等电聚焦电泳法和毛细管电泳法等，基于GHb各组分泳动速度不同从而将其分离再测量含量，该方法的干扰因素较少，且分辨率高，可提示变异Hb的存在，毛细管电泳法对血红蛋白变异体的抗干扰能力优于HPLC，但自动化程度低，且仪器昂贵[5，6]。
2.3 基于结构差异进行检测
2.3.1亲和层析法 原理为硼酸根离子可逆性地与GHb中葡萄糖分子的顺位二醇基联结，加入血液样本后，非糖化血红蛋白会直接流出层析柱进入洗脱液，再加入高浓度的含顺位二醇基的山梨醇替换GHb，GHb也进入洗脱液，此时通过测定洗脱液吸光度可计算出GHb所占百分比。该方法仅能用于检测总GHb，不能分离组分，检测结果与平均血糖值、HPLC 等法所测HbA1c百分率呈高度相关性，所以使用该方法时可以允许经验算法计算HbA1c。
2. 4 基于化学反应性质差异检测
利用特异性内切酶切断GHb的糖化甘氨酰谷氨酰胺，减少了血浆中其他蛋白对检测结果的干扰，测出Hb浓度;在果糖氨基酸氧化酶和过氧化物酶的催化下，生成的过氧化氢与显色剂发生反应，产生颜色改变，在通过相关的测量后即可求得HbA1c的百分率。该反应系统快速、单一，适用于全自动生化分析仪测试，精密度高。 2.5 免疫传感器
Lee[7]利用金纳米颗粒开发了两种传感器盒检测HbA1c水平，一个是基于光学原理的聚合物基薄膜传感器盒，另外一个是石英晶体微天平传感器盒。王潇[8]等人构建了16通道无标记型特异检测HbA1c的电化学免疫传感器，经HbA1c抗体修饰的优化型16-SPCE电化学免疫传感器具有较好的电化学响应性能、选择性、稳定性，能稳定、有效地检测复杂体系中的HbA1c，提高准确度，对于糖尿病患者来说，易于小型化、即时检测和操作简单的优势极大地方便了他们的生活，减少频繁奔于医院的疲惫[8]。
3 结语
目前市面上检测HbA1c的试剂很多，应用的方法原理也各不相同，精密度和准确度以及抗干扰能力也千差万别。有的適合于辅助诊断，则要求有较高的精密度和准确度比如高效液相色谱法（HPLC），是目前为国际公认的检测HbA1c的金标准，但其缺点是易受异常血红蛋白的影响，且价格较高;有的适合于床边检测（POCT），目前主要方法有两种，第一种是显色亲和层析法，在亲和层析法的基础上将硼酸根阴离子改成水溶性蓝色苯硼酸染料，第二种是荧光免疫法[9]，其是糖代谢控制情况和糖尿病性昏迷等并发症风险评判的最好的方法[10];现有一种HbA1c检测试剂刚上市，它不须要投入任何设备，检测卡上有个云实验室的识别码，在卡上加血样反应后用安装有相应APP的手机同时扫描检测区和识别码，信号传输到云实验室检测，几秒后检测结果便传到手机上，这很适合于基层社区医院推广使用。
参考文献：
[1]Rizza Stefano et al.Alterations in Rev-ERBα/BMAL1 ratio and glycated hemoglobin in rotating shift workers：the EuRhythDia study.[J].Acta diabetologica，2021.
[2]王少婷，刘倩，于洋，王艳，曹永彤.糖化血红蛋白的检测方法及标准化研究进展[J].中日友好医院学报，2019，33（01）：38-40+44.
[3]杨日东.糖化血红蛋白临床检测方法的研究进展[J].医学理论与实践，2017，30（11）：1594-1596.
[4]赵莹.糖化血红蛋白实验室检测技术及方法学进展[J].中国医疗器械信息，2020，26（10）：25-26
[5]李洋.电泳法在糖化血红蛋白检查中的效果[J].中国城乡企业卫生，2020，35（10）：85-86.
[6]肖翔，钟阳青，陈艳清，贾建，张伟龙，潘理想.毛细管电泳法检测糖化血红蛋白的方法学性能评价[J].中国医学创新，2018，15（11）：126-130.
[7]Lee Soo Suk. Novel Detection Technology for Glycated Hemoglobin using Gold Nanoparticles[J].Journal of Sensor Science and Technology，2016，25（6） ： 435-439.
[8]王潇，宓现强.16通道无标记型糖化血红蛋白检测免疫传感器的构建[J].检验医学，2019，34（09）：835-840.
[9]李新华，赵珂，魏芳，丁文宇，张勇，黄亚丽.显色型亲和层析法检测糖化血红蛋白的建立及性能评估[J].中国糖尿病杂志，2016，24（10）：892-896.
[10]Girlescu Nona et al.Thanatochemical Study of Glycated Hemoglobin in Diabetic Status Assessment[J]. Medicina， 2021， 57（4）：342-342.
关键词：糖化血红蛋白，检测技术，综述
【中图分类号】R331.1+41 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2021）05-112-01
1 概述
近年来，我国糖尿病患者的人数逐年攀升，据中国官方统计数据，2020版的指南更新的流调数据显示，糖尿病患病率已达11.2%。糖尿病的治疗是一个漫长的过程，因而对糖尿病的健康管理显得尤为重要，手段主要以饮食管理和降糖药物控制为主，联合空腹血糖与糖化血红蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）定期监测血糖水平，有效控糖。HbA1c是在长时间、高浓度血糖存在的条件下，血红蛋白与葡萄糖进行非酶促反应结合形成的一种产物，其生成过程缓慢且不可逆，并且贯穿存在于红细胞的整个生命周期中（120天），浓度相对稳定，反映的是患者过去2～3个月的平均血液中葡萄糖水平，可以联合空腹血糖等其他指标诊断及监测糖尿病。现就目前检测糖化血红蛋白的检测方法研究进展进行综述。
2 HbA1c的检测方法
HbA1c为属于血红蛋白p链的一个或两个n端缬草上的d-葡萄糖，是一种生物标记物，用于诊断和识别患糖尿病（DM）的高危患者。根据糖尿病的诊断标准， HbA1c 水平>6.5%（>48mmol/mol）可导致糖尿病;而把HbA1c水平介于5.7-6.4%（39-46mmol/mol）归为糖尿病前期。近年来，糖化血红蛋白的检测技术也越来越标准化，目前可分为以下几大类。
2.1 免疫反应法 利用抗原抗体特异性反应检测糖化血红蛋白，以血红蛋白β链糖化N末端的4～8个氨基酸残基作为识别位点，生产单克隆抗体，按照反应结合物质的不同，可形成不同的检测方法。
2.1.1胶乳凝集抑制法 检测试剂中以数个HbA1c抗原决定簇形成的聚集物作为凝集素，抗-HbA1c抗体抗原与之结合形成不溶性的抗原抗体复合物，加入全血样本后，血液中的HbA1c将与聚集物产生竞争关系，争夺乳胶颗粒上的抗-HbA1c抗体，抑制凝集物生成，根据测定的吸光度值可计算出HbA1c在总血红蛋白（Hb）中的百分含量。该方法成本低、快速、基本能保证检测准确性，可在全自动生化仪上完成，适用于大批量样本检测，但易受高浓度的葡萄糖、三酰甘油及胆红素等物质干扰[2]。
2.1.2胶乳凝集免疫比浊法 HbA1c与抗-HbA1c抗体复合物是可溶性的，再加入多聚半抗原缓冲液抗原与剩余的抗-HbA1c抗体结合成不可溶性物质，双通道分别测定溶液中Hb和HbA1c的含量，即可求得HbA1c在总Hb中的百分含量，该方法精密度高，线性良好，虽然影响因素较多，但鉴于成本低，可进行自动化的临床优势，还是具有一定的替代价值。
2.1.3离子捕获法 即化学发光法，将荧光标记物结合到HbA1c抗原抗体复合物上，再联结带负电荷的多聚阴离子形成复合物，该复合物会吸附于试剂中的带正电荷的纤维表面，经反复清洗后可测定其荧光强度，从而得到HbA1c的濃度。该方法与上述两种方法具有相似的检测优越性，且回收率高，交叉污染率低[3]。
2.1.4荧光免疫法与放射免疫法 荧光法为离子捕获法的衍生方法，原理相同，但可计算HbA1c的浓度。荧光法和放射法的检测优略势几乎相同，可批量、重复检测，且准确度、精密度、特异性都较为良好，干扰因素也极少，但前者仪器及试剂成本高昂，后者制备试剂困难，故两种方法在临床上难以作为常规检测方法[4]。
2.2电荷间差异检测
2.2.1离子交换层析法 原理为血红蛋白糖化后所带电荷改变，在不同pH的磷酸盐缓冲液中，可以将树脂上不同吸附力的GHb组分（包括HbA及HbA1的各组分）分批依次洗脱出来，绘制相应Hb的层析谱，即可求得HbA1c在GHb的百分率。常见的离子交换层析法主要有树脂微柱法、低效液相色谱法（LPLC）及高效液相色谱法（HPLC），其中HPLC 是目前为国际公认的检验HbA1c的金标准，但此法相关仪器、试剂及耗材昂贵，在基层医院难以推广普及;LPLC 测定原理与HPLC一致，但LPLC难以分辨变异血红蛋白，往往将其归为HbA1c，使假阳性率偏高，树脂微柱法适合检测大量标本，但干扰因素极多，且重复性较差。
2.2.2电泳法 常用的有琼脂糖凝胶电泳法、等电聚焦电泳法和毛细管电泳法等，基于GHb各组分泳动速度不同从而将其分离再测量含量，该方法的干扰因素较少，且分辨率高，可提示变异Hb的存在，毛细管电泳法对血红蛋白变异体的抗干扰能力优于HPLC，但自动化程度低，且仪器昂贵[5，6]。
2.3 基于结构差异进行检测
2.3.1亲和层析法 原理为硼酸根离子可逆性地与GHb中葡萄糖分子的顺位二醇基联结，加入血液样本后，非糖化血红蛋白会直接流出层析柱进入洗脱液，再加入高浓度的含顺位二醇基的山梨醇替换GHb，GHb也进入洗脱液，此时通过测定洗脱液吸光度可计算出GHb所占百分比。该方法仅能用于检测总GHb，不能分离组分，检测结果与平均血糖值、HPLC 等法所测HbA1c百分率呈高度相关性，所以使用该方法时可以允许经验算法计算HbA1c。
2. 4 基于化学反应性质差异检测
利用特异性内切酶切断GHb的糖化甘氨酰谷氨酰胺，减少了血浆中其他蛋白对检测结果的干扰，测出Hb浓度;在果糖氨基酸氧化酶和过氧化物酶的催化下，生成的过氧化氢与显色剂发生反应，产生颜色改变，在通过相关的测量后即可求得HbA1c的百分率。该反应系统快速、单一，适用于全自动生化分析仪测试，精密度高。 2.5 免疫传感器
Lee[7]利用金纳米颗粒开发了两种传感器盒检测HbA1c水平，一个是基于光学原理的聚合物基薄膜传感器盒，另外一个是石英晶体微天平传感器盒。王潇[8]等人构建了16通道无标记型特异检测HbA1c的电化学免疫传感器，经HbA1c抗体修饰的优化型16-SPCE电化学免疫传感器具有较好的电化学响应性能、选择性、稳定性，能稳定、有效地检测复杂体系中的HbA1c，提高准确度，对于糖尿病患者来说，易于小型化、即时检测和操作简单的优势极大地方便了他们的生活，减少频繁奔于医院的疲惫[8]。
3 结语
目前市面上检测HbA1c的试剂很多，应用的方法原理也各不相同，精密度和准确度以及抗干扰能力也千差万别。有的適合于辅助诊断，则要求有较高的精密度和准确度比如高效液相色谱法（HPLC），是目前为国际公认的检测HbA1c的金标准，但其缺点是易受异常血红蛋白的影响，且价格较高;有的适合于床边检测（POCT），目前主要方法有两种，第一种是显色亲和层析法，在亲和层析法的基础上将硼酸根阴离子改成水溶性蓝色苯硼酸染料，第二种是荧光免疫法[9]，其是糖代谢控制情况和糖尿病性昏迷等并发症风险评判的最好的方法[10];现有一种HbA1c检测试剂刚上市，它不须要投入任何设备，检测卡上有个云实验室的识别码，在卡上加血样反应后用安装有相应APP的手机同时扫描检测区和识别码，信号传输到云实验室检测，几秒后检测结果便传到手机上，这很适合于基层社区医院推广使用。
参考文献：
[1]Rizza Stefano et al.Alterations in Rev-ERBα/BMAL1 ratio and glycated hemoglobin in rotating shift workers：the EuRhythDia study.[J].Acta diabetologica，2021.
[2]王少婷，刘倩，于洋，王艳，曹永彤.糖化血红蛋白的检测方法及标准化研究进展[J].中日友好医院学报，2019，33（01）：38-40+44.
[3]杨日东.糖化血红蛋白临床检测方法的研究进展[J].医学理论与实践，2017，30（11）：1594-1596.
[4]赵莹.糖化血红蛋白实验室检测技术及方法学进展[J].中国医疗器械信息，2020，26（10）：25-26
[5]李洋.电泳法在糖化血红蛋白检查中的效果[J].中国城乡企业卫生，2020，35（10）：85-86.
[6]肖翔，钟阳青，陈艳清，贾建，张伟龙，潘理想.毛细管电泳法检测糖化血红蛋白的方法学性能评价[J].中国医学创新，2018，15（11）：126-130.
[7]Lee Soo Suk. Novel Detection Technology for Glycated Hemoglobin using Gold Nanoparticles[J].Journal of Sensor Science and Technology，2016，25（6） ： 435-439.
[8]王潇，宓现强.16通道无标记型糖化血红蛋白检测免疫传感器的构建[J].检验医学，2019，34（09）：835-840.
[9]李新华，赵珂，魏芳，丁文宇，张勇，黄亚丽.显色型亲和层析法检测糖化血红蛋白的建立及性能评估[J].中国糖尿病杂志，2016，24（10）：892-896.
[10]Girlescu Nona et al.Thanatochemical Study of Glycated Hemoglobin in Diabetic Status Assessment[J]. Medicina， 2021， 57（4）：342-342.