论文部分内容阅读
摘要 目的：基于網络药理学方法探讨艾叶挥发性成分对膝骨关节病的作用机制。方法：基于中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、DrugBank、TTD数据库分别建立艾叶挥发性成分-靶点网络和疾病靶点网络，基于Cytoscape 3.7.0软件建立艾叶挥发性成分-作用靶点网络并进行网络拓扑属性分析;利用DAVID数据库对核心作用靶点进行基因本体（GO）功能富集分析和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果：构建的有效成分-作用靶点网络有40个有效成分、265个靶点。靶点互做分析得到的核心靶点生物功能注释分析，得到的核心BP过程包括类固醇代谢、胆汁酸和胆盐运输、氧化还原等;CC过程包括突触后膜、原生质膜组成、等离子体膜等;MF过程包括血红素结合、细胞外配体门控离子通道活性、类固醇羟化酶活性等。通路富集得到的核心KEGG通路包括神经配体受体交互作用通路、甾类激素生物合成、胆汁分泌等。网络分析得到重要的活性成分有龙脑、杜松樟脑、异泽兰黄素等。结论：艾叶挥发性成分对膝骨关节病的作用可能是基于调控神经配体受体交互作用通路、神经信号负传导Toll样受体信号等通路调理膝骨关节病。
关键词 艾叶;网络药理学;挥发油;膝骨关节病;作用机制
Abstract Objective：The aim of this study was to investigate the mechanism of volatile components of artemisia argyi on knee arthropathy based on network pharmacology.Methods：The volatile component-target network and the disease target network of artemisia argyi were established respectively based on TCMSP，DrugBank and TTD databases.Core targets were enriched by DAVID database for gene ontology（GO） function and genome encyclopedia（KEGG） pathway.Results：The active component-action target network consisted of 40 active components and 265 targets.The annotation analysis of the biological function of the core target obtained by the analysis of the target interaction，the core BP process obtained included steroid metabolism，bile acid and bile salt transport，REDOX，inflammatory response，steroid hormone-mediated signaling pathway，etc.CC process included postsynaptic membrane，protoplasmic membrane composition，plasma membrane，organelle membrane，chlorine channel，etc.The MF process includes heme binding，extracellular ligand gated ion channel activity，steroid hydroxylase activity，iron ion binding，steroid binding，etc.The core KEGG pathways enriched by pathway include the neural ligand receptor interaction pathway，steroid hormone biosynthesis，bile secretion，cytochrome P450 metabolic response to exogenous drugs，negative neural signaling pathway，toll-like receptor signaling pathway，etc.The important active ingredients Predicted were borneol，juniper camphor，isoselanflavin，isoselanol，eugenol，eucalyptus olefine，spartanol，ter-turpentine，-pinene，-borneol acetate，cream-carytene，limonene，cur-elemene and cypreslidene.Conclusion：The effect of volatile components of artemisia argyi on knee arthropathy may be based on the regulation of the neural ligand receptor interaction pathway and the negative conduction of toll-like receptor signaling pathways.The pharmacodynamics may be closely related to borneol，juniper camphor，isoselanthin，isoselanol，eugenol and eucalyptus oil. Keywords Moxa leaf; Network pharmacology; Volatile oil; Knee arthropathy; Pharmacological mechanism
中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.003
膝骨关节病是因膝关节产生退行性改变导致关节内部功能发生障碍的一种慢性疾病，主要临床表现是膝关节疼痛、活动受限、关节僵硬等，且兼具病程长、病情复杂等特点，严重降低患者生命质量[1-2]。
艾叶是菊科植物艾（Artemisia argyi Levl.et Van）的干燥叶。辛、苦、温，归肝、脾、肾经，具有“温经止血、散寒止痛”的作用[3]。基于艾叶的温通散寒作用，艾灸一直是临床上治疗膝骨性关节炎的常用疗法，临床报道疗效良好，可明显改善膝骨性关節炎患者疼痛、僵硬、功能障碍等临床症状[4-6]。艾叶制剂如复方艾叶油乳膏也可减轻关节软骨的病理损伤，治疗膝关节骨关节炎的疗效显著。近年来，随着艾灸疗法的广泛应用，艾烟带来的环境污染和毒性问题也引起了普遍关注，长期高浓度的吸入艾烟对机体具有一定程度损伤作用[7-8]。由此，艾叶、艾灸的物质基础和作用机制研究成为了研究者们必须首先探究明确的问题之一。
网络药理学是中药学与计算科学、化学、药理学、药代动力学等多学科融合的一门交叉学科，其研究策略集化学成分-靶标-疾病-药理作用网络分析于一体，可以系统筛选中药治疗某一疾病的具体化学成分、可能作用靶点以及相关信号通路网络，从而揭示药物与靶标之间相互作用网络的特点[9-11]。近年来网络药理学在中药作用机制研究中逐渐发挥出越来越大的影响力。由此，本研究拟借助网络药理学方法分析艾叶挥发性成分对膝骨关节病作用机制，为艾叶在膝骨关节病中的临床应用推广和艾叶新型制剂开发奠定基础。
1 资料与方法
1.1 数据库 采用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）;TTD数据库（https：//db.idrblab.org/ttd/）;DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）;ETCM（http：//www.nrc.ac.cn：9090/ETCM/index.php/Home/Index/）;DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）;STRING数据库（https：//string-db.org/，Version 10.5）;UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）;Cytoscape软件（Version 3.4.0）。
1.2 艾叶挥发性成分收集 分别以艾叶挥发油为关键词，查找国家知识基础设施数据库（简称中国知网，China National Knowledge Infrastructure，CNKI）、Web of Science数据库、TCMSP，收集艾叶挥发油化学成分报道[12-19]。
1.3 艾叶挥发性活性化合物筛选 基于艾灸的用法，将艾灸视作经皮制剂处理，参考经皮制剂研究经验报道[20]，以1 1.4 艾叶活性成分靶点集构建 利用TCMSP收集整理活性化合物作用靶点。
1.5 膝骨关节病靶点集构建 通过TCMSP[10]、Drug bank数据库[11]、TTD数据库[21]、ETCM数据库[22]收集与膝关节病相关的作用靶点，将全部靶点信息导入UniProt数据库转换为Official Gene Symbol。
1.6 艾叶活性成分-作用靶点网络构建与分析 利用STRING数据库，查找艾叶挥发油成分-靶点对应的直接蛋白互作及疾病靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络关系，分别导入Cytoscape 3.7.0中，构建艾叶挥发油化学成分-靶点PPI和膝关节病靶点PPI，利用Cytospace的Merge功能对上述2个PPI网络进行合并，抽取交集网络，即得活性成分-作用靶点网络[23]。
1.7 基因功能富集分析与生物过程分析 利用DAVID数据库对艾叶挥发油核心作用靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。
2 结果
2.1 活性化合物筛选 通过检索中国知网数据库中关于艾叶挥发性成分的报道，收集整理共得到71种化合物，经过对ALog P指标筛选，最后有40种成分符合要求。见表1。
2.2 活性成分靶点集构建 经TCMSP收集艾叶挥发性成分对应靶点，去重复后得到共计265个，由上述265个靶点组成靶点集合A。
2.3 膝骨关节病靶点集构建 将TCMSP数据库、Drug bank数据库、TTD数据库、ETCM数据库所收集到的膝骨关节病相关靶点汇集整理，去重复后得到共计265个，组成疾病靶点集合B。
2.4 活性成分-作用靶点网络 经过交集计算，发现活性成分-靶点集合A与疾病靶点集合B的交集C共有10个靶点，分别为：ABCG2、CD86、CYP1A2、ESRRA、IL6、NOS2、PIK3CG、PLA2G1B、PTGS2、TP53。
PPI网络经过Cytoscape 3.7.0可视化后见图1。网络拓扑分析可知活性成分-作用靶点网络共计包含371个节点、137 270条成分-靶点作用关系，每个靶点平均相邻靶点数目为28.943个，网络中心度为0.345，上述数据可知，该网络是个高度复杂、高密度网络。 [3]张元，康利平，郭兰萍，等.艾叶的本草考证和应用研究进展[J].上海针灸杂志，2017，36（3）：245-255.
[4]周志荣.艾灸在膝关节骨性关节炎中的应用[J].中国民间疗法，2018，26（7）：13-14.
[5]韩明娟.蕲春艾绒与南阳艾绒灸治膝骨关节病的临床疗效差异及作用机制研究[D].北京：中国中医科学院，2018.
[6]陈向华，张国有，周美启，等.艾灸的现代药学与药理学研究探析[J].中国针灸，2009，29（5）：428-430.
[7]兰蕾，张国山，石佳，等.艾烟对大鼠的亚慢性毒理试验一般生理性指标分析[J].时珍国医国药，2014，25（5）：1241-1244.
[8]卢静.艾灸作用机制及安全性研究进展[J].中国民间疗法，2019，27（13）：105-107.
[9]毛婷，张京春，刘蓓，等.基于网络药理学探讨甘松-延胡索组方治疗房颤的作用机制[J].中国实验方剂学杂志，2020，26（13）：1-11.
[10]汝锦龙.中药系统药理学数据库和分析平台的构建和应用[D].杨凌：西北农林科技大学，2015.
[11]程飞雄.系统药物设计方法发展及应用研究[D].上海：华东理工大学，2013.
[12]李玲，吕磊，董昕，等.运用GC-MS对三种不同方法提取的艾叶挥发油成分的比较分析[J].药学实践杂志，2012，30（4）：279-282，286.
[13]赵秀玲，党亚丽.艾叶挥发油化学成分和药理作用研究进展[J].天然产物研究与开发，2019，31（12）：2182-2188.
[14]阳一兰.湖南野生新鲜艾叶挥发油成分分析[J].湖南农业科学，2019，49（3）：73-75.
[15]张蒙，于丹，崔磊，等.艾叶挥发油化学成分研究进展[J].现代生物医学进展，2019，19（4）：777-781.
[16]努尔比耶·奥布力喀斯木，热娜·卡斯木，杨璐，等.艾葉挥发油化学成分分析和抗真菌活性的研究[J].新疆医科大学学报，2017，40（9）：1195-1198，1202.
[17]杜家俊，高瑞，王少圣，等.安徽产艾叶挥发油成分GC-MS分析[J].皖南医学院学报，2017，36（1）：11-15.
[18]蒋潇，田静.三个产地艾叶挥发油的化学成分分析[J].中国民族民间医药，2015，24（17）：19-22.
[19]阳一兰，石峰，詹国平，等.艾叶挥发油的提取及其化学成分分析[J].安徽农业科学，2013，41（12）：5267-5271.
[20]曾培，范文涛，王倩.基于网络药理学的皮肤解毒汤治疗湿疹作用机制研究[J].吉林中医药，2019，39（8）：1027-1031.
[21]杨红.基于网络药理学的新型抗癌药物靶点的识别与发现研究[D].重庆：重庆大学，2017.
[22]赵静，田赛赛，杨健，等.清肺排毒汤治疗新型冠状病毒肺炎机制的网络药理学探讨[J].中草药，2020，51（4）：829-835.
[23]唐羽，李敏.基于Cytoscape的蛋白质网络可视化聚类分析插件[J].生物信息学，2014，12（1）：38-45.
（2020-09-24收稿 责任编辑：魏庆双，徐颖）
关键词 艾叶;网络药理学;挥发油;膝骨关节病;作用机制
Abstract Objective：The aim of this study was to investigate the mechanism of volatile components of artemisia argyi on knee arthropathy based on network pharmacology.Methods：The volatile component-target network and the disease target network of artemisia argyi were established respectively based on TCMSP，DrugBank and TTD databases.Core targets were enriched by DAVID database for gene ontology（GO） function and genome encyclopedia（KEGG） pathway.Results：The active component-action target network consisted of 40 active components and 265 targets.The annotation analysis of the biological function of the core target obtained by the analysis of the target interaction，the core BP process obtained included steroid metabolism，bile acid and bile salt transport，REDOX，inflammatory response，steroid hormone-mediated signaling pathway，etc.CC process included postsynaptic membrane，protoplasmic membrane composition，plasma membrane，organelle membrane，chlorine channel，etc.The MF process includes heme binding，extracellular ligand gated ion channel activity，steroid hydroxylase activity，iron ion binding，steroid binding，etc.The core KEGG pathways enriched by pathway include the neural ligand receptor interaction pathway，steroid hormone biosynthesis，bile secretion，cytochrome P450 metabolic response to exogenous drugs，negative neural signaling pathway，toll-like receptor signaling pathway，etc.The important active ingredients Predicted were borneol，juniper camphor，isoselanflavin，isoselanol，eugenol，eucalyptus olefine，spartanol，ter-turpentine，-pinene，-borneol acetate，cream-carytene，limonene，cur-elemene and cypreslidene.Conclusion：The effect of volatile components of artemisia argyi on knee arthropathy may be based on the regulation of the neural ligand receptor interaction pathway and the negative conduction of toll-like receptor signaling pathways.The pharmacodynamics may be closely related to borneol，juniper camphor，isoselanthin，isoselanol，eugenol and eucalyptus oil. Keywords Moxa leaf; Network pharmacology; Volatile oil; Knee arthropathy; Pharmacological mechanism
中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.003
膝骨关节病是因膝关节产生退行性改变导致关节内部功能发生障碍的一种慢性疾病，主要临床表现是膝关节疼痛、活动受限、关节僵硬等，且兼具病程长、病情复杂等特点，严重降低患者生命质量[1-2]。
艾叶是菊科植物艾（Artemisia argyi Levl.et Van）的干燥叶。辛、苦、温，归肝、脾、肾经，具有“温经止血、散寒止痛”的作用[3]。基于艾叶的温通散寒作用，艾灸一直是临床上治疗膝骨性关节炎的常用疗法，临床报道疗效良好，可明显改善膝骨性关節炎患者疼痛、僵硬、功能障碍等临床症状[4-6]。艾叶制剂如复方艾叶油乳膏也可减轻关节软骨的病理损伤，治疗膝关节骨关节炎的疗效显著。近年来，随着艾灸疗法的广泛应用，艾烟带来的环境污染和毒性问题也引起了普遍关注，长期高浓度的吸入艾烟对机体具有一定程度损伤作用[7-8]。由此，艾叶、艾灸的物质基础和作用机制研究成为了研究者们必须首先探究明确的问题之一。
网络药理学是中药学与计算科学、化学、药理学、药代动力学等多学科融合的一门交叉学科，其研究策略集化学成分-靶标-疾病-药理作用网络分析于一体，可以系统筛选中药治疗某一疾病的具体化学成分、可能作用靶点以及相关信号通路网络，从而揭示药物与靶标之间相互作用网络的特点[9-11]。近年来网络药理学在中药作用机制研究中逐渐发挥出越来越大的影响力。由此，本研究拟借助网络药理学方法分析艾叶挥发性成分对膝骨关节病作用机制，为艾叶在膝骨关节病中的临床应用推广和艾叶新型制剂开发奠定基础。
1 资料与方法
1.1 数据库 采用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）;TTD数据库（https：//db.idrblab.org/ttd/）;DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）;ETCM（http：//www.nrc.ac.cn：9090/ETCM/index.php/Home/Index/）;DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）;STRING数据库（https：//string-db.org/，Version 10.5）;UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）;Cytoscape软件（Version 3.4.0）。
1.2 艾叶挥发性成分收集 分别以艾叶挥发油为关键词，查找国家知识基础设施数据库（简称中国知网，China National Knowledge Infrastructure，CNKI）、Web of Science数据库、TCMSP，收集艾叶挥发油化学成分报道[12-19]。
1.3 艾叶挥发性活性化合物筛选 基于艾灸的用法，将艾灸视作经皮制剂处理，参考经皮制剂研究经验报道[20]，以1
1.5 膝骨关节病靶点集构建 通过TCMSP[10]、Drug bank数据库[11]、TTD数据库[21]、ETCM数据库[22]收集与膝关节病相关的作用靶点，将全部靶点信息导入UniProt数据库转换为Official Gene Symbol。
1.6 艾叶活性成分-作用靶点网络构建与分析 利用STRING数据库，查找艾叶挥发油成分-靶点对应的直接蛋白互作及疾病靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络关系，分别导入Cytoscape 3.7.0中，构建艾叶挥发油化学成分-靶点PPI和膝关节病靶点PPI，利用Cytospace的Merge功能对上述2个PPI网络进行合并，抽取交集网络，即得活性成分-作用靶点网络[23]。
1.7 基因功能富集分析与生物过程分析 利用DAVID数据库对艾叶挥发油核心作用靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。
2 结果
2.1 活性化合物筛选 通过检索中国知网数据库中关于艾叶挥发性成分的报道，收集整理共得到71种化合物，经过对ALog P指标筛选，最后有40种成分符合要求。见表1。
2.2 活性成分靶点集构建 经TCMSP收集艾叶挥发性成分对应靶点，去重复后得到共计265个，由上述265个靶点组成靶点集合A。
2.3 膝骨关节病靶点集构建 将TCMSP数据库、Drug bank数据库、TTD数据库、ETCM数据库所收集到的膝骨关节病相关靶点汇集整理，去重复后得到共计265个，组成疾病靶点集合B。
2.4 活性成分-作用靶点网络 经过交集计算，发现活性成分-靶点集合A与疾病靶点集合B的交集C共有10个靶点，分别为：ABCG2、CD86、CYP1A2、ESRRA、IL6、NOS2、PIK3CG、PLA2G1B、PTGS2、TP53。
PPI网络经过Cytoscape 3.7.0可视化后见图1。网络拓扑分析可知活性成分-作用靶点网络共计包含371个节点、137 270条成分-靶点作用关系，每个靶点平均相邻靶点数目为28.943个，网络中心度为0.345，上述数据可知，该网络是个高度复杂、高密度网络。 [3]张元，康利平，郭兰萍，等.艾叶的本草考证和应用研究进展[J].上海针灸杂志，2017，36（3）：245-255.
[4]周志荣.艾灸在膝关节骨性关节炎中的应用[J].中国民间疗法，2018，26（7）：13-14.
[5]韩明娟.蕲春艾绒与南阳艾绒灸治膝骨关节病的临床疗效差异及作用机制研究[D].北京：中国中医科学院，2018.
[6]陈向华，张国有，周美启，等.艾灸的现代药学与药理学研究探析[J].中国针灸，2009，29（5）：428-430.
[7]兰蕾，张国山，石佳，等.艾烟对大鼠的亚慢性毒理试验一般生理性指标分析[J].时珍国医国药，2014，25（5）：1241-1244.
[8]卢静.艾灸作用机制及安全性研究进展[J].中国民间疗法，2019，27（13）：105-107.
[9]毛婷，张京春，刘蓓，等.基于网络药理学探讨甘松-延胡索组方治疗房颤的作用机制[J].中国实验方剂学杂志，2020，26（13）：1-11.
[10]汝锦龙.中药系统药理学数据库和分析平台的构建和应用[D].杨凌：西北农林科技大学，2015.
[11]程飞雄.系统药物设计方法发展及应用研究[D].上海：华东理工大学，2013.
[12]李玲，吕磊，董昕，等.运用GC-MS对三种不同方法提取的艾叶挥发油成分的比较分析[J].药学实践杂志，2012，30（4）：279-282，286.
[13]赵秀玲，党亚丽.艾叶挥发油化学成分和药理作用研究进展[J].天然产物研究与开发，2019，31（12）：2182-2188.
[14]阳一兰.湖南野生新鲜艾叶挥发油成分分析[J].湖南农业科学，2019，49（3）：73-75.
[15]张蒙，于丹，崔磊，等.艾叶挥发油化学成分研究进展[J].现代生物医学进展，2019，19（4）：777-781.
[16]努尔比耶·奥布力喀斯木，热娜·卡斯木，杨璐，等.艾葉挥发油化学成分分析和抗真菌活性的研究[J].新疆医科大学学报，2017，40（9）：1195-1198，1202.
[17]杜家俊，高瑞，王少圣，等.安徽产艾叶挥发油成分GC-MS分析[J].皖南医学院学报，2017，36（1）：11-15.
[18]蒋潇，田静.三个产地艾叶挥发油的化学成分分析[J].中国民族民间医药，2015，24（17）：19-22.
[19]阳一兰，石峰，詹国平，等.艾叶挥发油的提取及其化学成分分析[J].安徽农业科学，2013，41（12）：5267-5271.
[20]曾培，范文涛，王倩.基于网络药理学的皮肤解毒汤治疗湿疹作用机制研究[J].吉林中医药，2019，39（8）：1027-1031.
[21]杨红.基于网络药理学的新型抗癌药物靶点的识别与发现研究[D].重庆：重庆大学，2017.
[22]赵静，田赛赛，杨健，等.清肺排毒汤治疗新型冠状病毒肺炎机制的网络药理学探讨[J].中草药，2020，51（4）：829-835.
[23]唐羽，李敏.基于Cytoscape的蛋白质网络可视化聚类分析插件[J].生物信息学，2014，12（1）：38-45.
（2020-09-24收稿 责任编辑：魏庆双，徐颖）