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目的
构建问号钩端螺旋体(简称钩体)tlyA基因原核表达系统，确定目的重组表达产物rTlyA溶解红细胞及诱导人THP-1和小鼠J774A.1巨噬细胞分泌致炎细胞因子的作用。
方法采用PCR扩增问号钩体黄疸出血群赖型赖株tlyA基因，T-A克隆后测序。采用原核表达载体pET-42a及表达宿主菌E.coli BL21DE3构建tlyA基因原核表达系统。采用SDS-PAGE检测rTlyA表达情况，Ni-NTA亲和层析法提纯rTlyA。采用平板法和分光光度法测定rTlyA对绵羊红细胞的溶血活性。采用RT-PCR和Western blot分别检测问号钩体赖株感染THP-1和J774A.1细胞后tlyA基因mRNA水平变化及TlyA外分泌情况。采用ELISA检测rTlyA诱导THP-1和J774A.1细胞分泌致炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的作用。
结果所克隆的tlyA基因与GenBank中公布的相应基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.2%和99.8%。所构建的tlyA基因原核表达系统能有效表达rTlyA。10 μg/ml rTlyA能显示较强的溶解绵羊红细胞活性。问号钩体赖株感染THP-1和J774A.1细胞1～8 h后，tlyA-mRNA水平显著升高(P<0.05)且出现TlyA外分泌。0.1、1和10 μg/ml rTlyA均能使THP-1和J774A.1细胞分泌致炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平显著升高(P<0.05)。
结论问号钩体tlyA基因产物TlyA是溶血素并能诱导巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α，可在钩体病炎症反应中发挥重要作用。