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摘 要：以冬枣为试材，从发病的冬枣上提取出病原菌，并进行分离纯化和鉴定，明确导致冬枣发病的病原菌主要为酵母菌和根霉菌。使用滤纸片法测定5种植物精油（罗勒精油、松红梅精油、薰衣草精油、红百里香精油、迷迭香精油）对酵母菌和根霉菌的抑菌活性，结果表明：红百里香精油对酵母菌和根霉菌都具有很强的抑制作用，抑菌圈直径为（22.43±0.06） mm和（23.48±0.06） mm。另外，采用试管浓度稀释法对5种植物精油的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）进行了测定，得知红百里香精油对酵母菌的MIC值是0.625 μL/mL，MBC值是1.25 μL/mL；对根霉菌的MIC是0.625 μL/mL，MBC值是2.5 μL/mL。
关键词：植物精油；病原菌；抑菌圈；抑菌浓度；杀菌浓度
文章编号：1005345X（2015）01000104中图分类号：S436.65文献标识码：B
果蔬产品在采后会发生一系列生理病理的变化，冬枣在贮藏后期随着果实的成熟衰老，其抗病性也逐渐降低，腐烂率也大大增加。传统的冬枣保鲜所采用的都是成本低廉、使用方便、效果显著的化学杀菌剂，但是大规模地使用化学杀菌剂不仅会导致病原菌产生抗药性，还会造成果蔬的农药残留和污染环境[1]，这与现如今人们所追求的绿色、环保以及吃健康食品的观念背道而驰。因此研究开发无毒、高效的天然防腐保鲜剂已成为一项极为迫切的任务。
近年来，植物精油以其显著的抑菌活性和广泛的抗菌谱范围，以及与化学抑菌剂相比副作用和残留毒性小的独特优势，在抑菌研究方面得到了广泛的关注，被认为是开发天然防腐保鲜剂的重要原料[2，3]。目前植物精油对冬枣主要采后致病菌的抑制效果研究较少，冬枣精油天然防腐保鲜剂的开发也鲜见报道。本实验以陕西地区冬枣采后贮藏中分离鉴定的病原菌作为供试菌种，对5种天然植物精油（罗勒精油、薰衣草精油、红百里香精油、松红梅精油、迷迭香精油）进行抑菌试验，筛选可有效抑制病原菌的植物精油，为冬枣采后病害的有效防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
冬枣为陕西渭南市售的在半红期采摘的果实，挑选无病虫害和机械伤的鲜果用流动水冲洗，表面自然沥干，置于室温进行贮藏，让其在贮藏的过程中病变。
植物精油罗勒精油、薰衣草精油、红百里香精油、松红梅精油和迷迭香精油均购自上海雅琪实业有限公司，试验前置于低温（4 ℃）避光环境下保存。
1.2 方法
1.2.1 病原菌分离与纯化 采用常规方法，在PDA培养基中分离病原菌，待产孢后对病原菌孢子进行浓度梯度稀释，涂于平皿，并在28 ℃培养2 d后于倒置显微镜下挑取单孢子，移入另一装有PDA的平皿，28 ℃培养，待菌丝长出后，即得纯化菌株。
1.2.2 标准菌悬液的制备 挑取各菌落接种到平皿上，进行培养， 然后用无菌生理盐水洗
山西果树 SHANXI FRUITS 2015（1）
脱，分别制成含菌约为1 mL 106个菌的菌悬液，备用。霉菌、酵母菌使用显微镜直接计数法测菌体个数[4，5]。
1.2.3 滤纸片法测定抑菌圈 选择吸水性强的定性滤纸，用打孔器打成若干直径为6 mm的圆形滤纸片，放入电热干燥箱中经160 ℃干热灭菌2 h后，把灭好菌的滤纸片放入植物精油中浸渍4 h，取出滤纸片放在无菌的条件下沥干备用。将活化并调整好菌液浓度的酵母菌菌悬液0.1 mL加入已经倒好的YPD培养基平皿中，根霉菌倒入察氏培养基平皿上，并涂布均匀。取浸泡过精油的滤纸片贴在含菌平皿上，每皿平行做3片，每种菌平行做3个皿。然后用相应的提取溶剂作阴性对照，用青霉素G作阳性对照。酵母菌、根霉菌置培养箱中28 ℃恒温培养48 h。选取抑菌圈比较明显的平板，用十字交叉法测量菌落生长的直径，结果取3次重复试验的平均值[68]。
1.2.4 最低抑菌浓度（MIC）的测定 在无菌条件下，将植物精油稀释成下列不同浓度梯度：200、100、50、25、12.5、6.25 μL/mL。吸取各浓度稀释液1 mL，分别加到已灭菌的9 mL PDA培养基中制成带药的平皿，编号后吸取待测菌种的悬浮液100 μL于平皿表面，涂布均匀，酵母菌、根霉菌置于恒温箱28 ℃下培养48 h，以完全没有菌生长的最低浓度作为该精油的最低抑菌浓度（MIC）[9，10]。
1.2.5 最低杀菌浓度（MBC）的测定 将在测定最低抑菌浓度（MIC）试验中没有长菌的平皿继续培养48 h后取出观察，以完全无菌生长的为最低杀菌浓度（MBC）[11]。
2 结果与分析
2.1 冬枣病原菌鉴定
从贮藏的冬枣果实上分离出两种病原菌，挑取各菌落少许到载玻片上，用显微镜观察、测量，根据各病原菌的形态特征对其进行鉴定。经过鉴定冬枣上分离出的两种病原菌是酵母菌和根霉菌。
酵母菌菌落呈现乳白色，少数为红色，表面光滑湿润，质地柔软不透明，菌落直径为1～2 mm。孢子为圆形，单生或成串。
根霉菌菌落呈圆形，初形成时为灰白色和黄白色，成熟后变为黑色，匍匐菌丝弧形，无色，向四周蔓延。孢子囊刚出现时为黄白色，成熟后变为黑色。
2.2 5种植物精油对冬枣病原菌抑制效果
2.2.1 抑菌圈的大小 5种植物精油、无菌生理盐水和青霉素G对冬枣病原菌的抑菌作用如表1。参照李春美等[12]抑菌实验判定标准（抑菌圈直径大于15 mm为最敏感，10～15 mm时为中度敏感，7～9 mm为低度敏感，无抑菌圈者不敏感），认为5种植物精油中红百里香精油对两种病原菌表现出了最强的抑菌活性，抑菌圈直径均大于20 mm，属最敏感；罗勒精油对根霉菌的抑制作用仅次于红百里香精油，也属最敏感，而对酵母菌属于中度敏感；薰衣草精油、松红梅精油对酵母菌的抑菌圈直径介于7～9 mm，属低度敏感，而这两种精油对根霉菌属中度敏感；迷迭香精油对酵母菌属低度敏感，而对根霉菌属中度敏感。综合比较来看，5种精油对根霉菌的抑制作用要强于对酵母菌的抑制作用。 2.2.2 5种植物精油MIC的测定 表2列出了供试菌种在不同精油浓度下生长状况和MIC值，精油的MIC值越小，说明精油抑制作用越强。从表3中可以看出，酵母菌和根霉菌在不同浓度的精油作用下，生长状况差异明显，试验所得到的MIC值与滤纸片法所得到的结
宋姝婧等：几种植物精油对冬季病原菌的抑菌试验
果是基本一致的。红百里香精油对酵母菌和根霉菌都表现出了强烈的抑制作用，最低抑菌浓度均为0.625 μL/mL；而罗勒精油对根霉菌表现出的抑制作用远远大于对酵母菌所表现的抑制作用，对酵母菌的MIC是10 μL/mL，对根霉菌的MIC是1.25 μL/mL ；松红梅精油和迷迭香精油对根霉菌抑菌作用较弱，而对于酵母菌的抑制作用极小，超出了实验所设的浓度梯次范围；迷迭香精油对根霉菌的MIC为20 μL/mL；薰衣草精油对酵母菌和根霉菌也都表现出了一定的抑制作用，对酵母菌的MIC为20 μL/mL，对根霉菌的MIC为10 μL/mL。
2.2.3 5种植物精油MBC的测定 表3列出
了供试菌种在不同精油浓度下生长状况和MBC值。从表3中可以看出，红百里香精油对酵母菌和根霉菌都表现出了强烈的杀菌能力，红百里香精油对酵母菌和根霉菌的MBC值分别是1.25 μL/mL和2.5 μL/mL，为5种植物精油中最低的杀菌浓度；相对酵母菌，罗勒精油对根霉菌表现出了更强的杀菌能力，MBC值分别为20 μL/mL和5 μL/mL；其余几种精油对供试菌的杀菌能力都比较弱。
3 结论
对贮藏的病变冬枣上的病原菌进行分离、提纯、鉴定，结果表明导致冬枣病变的主要病原菌为酵母菌和根霉菌。5种植物精油均对酵母菌、根霉菌有一定的抑制能力，其中红百里香精油对酵母菌和根霉菌有着最强的抑制作用，抑菌圈直径分别为（22.43±0.06） mm、（23.48±0.06） mm。红百里香精油对酵母菌的MIC值是0.625 μL/mL，MBC值是1.25 μL/mL，对根霉菌的MIC是0.625 μL/mL，MBC值是2.5 μL/mL。另外，5种植物精油均表现出对根霉菌的抑制效果强于酵母菌的特点，其作用机理尚需进一步研究。综上，红百里香精油对冬枣采后病原菌有很强的抑制能力，可作为开发冬枣天然防腐保鲜剂的重要原料，关于其对冬枣的保鲜防腐效果尚需具体研究，使其更具实际应用性。
参考文献
[1]Pramila Tripathi， NK Dubey. Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables[J]. India Postharvest Biology and Technology， 2003， 32（3）：235245.
[2]胡林峰， 许明录， 朱红霞. 植物精油抑菌活性研究进展[J]. 天然产物研究与开发， 2011， 23（2）：384391.
[3]陈建烟， 李永裕， 吴少华. 植物精油生物活性作用机理研究进展[J]. 天然产物研究与开发， 2012， 24（9）：1 3121 318.
[4]李春美， 杜 靖， 谢笔钧. 柚皮提取物的抑菌作用[J]. 食品与发酵工业， 2004， 30（1）： 3841.
[5]Soylu E Mine，Soylu Sksoner，Kurt Sener. Antimicrobial activities of the essential oils of various plants against tomato late blight disease agent Phytophthora infestans[J]. Mycopathologia， 2006， 161（2）：119128.
山西果树 SHANXI FRUITS 2015（1）
[6]谢宗波， 姜国芳， 黄德娟. 大蒜油的提取及抗菌活性研究[J]. 食品科技， 2007（8）： 130132.
[7]SOKOVIC M D， BRKIC D D， DAMIC A M， et al. Chemical composition and antifungal activity of Salvia desoleana Atzei & Picci essential oil and its major components[J]. Flavour Fragr J， 2009， 24： 8387.
[8]顾仁勇， 张石峰， 刘莹莹， 等. 五种香辛料精油抑菌及抗氧化性能研究[J]. 食品科学， 2008， 29（3）： 106109.
[9]关文强， 李淑芬. 丁香精油对果蔬采后病原菌抑制效应研究[J]. 食品科学， 2005， 26（12）： 227230.
[10]陈林林，米 强，辛嘉英. 柑橘皮精油成分分析及抑菌活性研究[J]. 食品科学， 2010， 31（17）： 2528.
[11]付振喜. 丁香等天然物质的抑菌成分在果蔬保鲜中的应用研究[D]. 天津：天津科技大学， 2010.
[12]李春美， 杜 靖， 谢笔钧. 柚皮提取物的抑菌作用[J]. 食品与发酵工业， 2004（1）： 3841.
关键词：植物精油；病原菌；抑菌圈；抑菌浓度；杀菌浓度
文章编号：1005345X（2015）01000104中图分类号：S436.65文献标识码：B
果蔬产品在采后会发生一系列生理病理的变化，冬枣在贮藏后期随着果实的成熟衰老，其抗病性也逐渐降低，腐烂率也大大增加。传统的冬枣保鲜所采用的都是成本低廉、使用方便、效果显著的化学杀菌剂，但是大规模地使用化学杀菌剂不仅会导致病原菌产生抗药性，还会造成果蔬的农药残留和污染环境[1]，这与现如今人们所追求的绿色、环保以及吃健康食品的观念背道而驰。因此研究开发无毒、高效的天然防腐保鲜剂已成为一项极为迫切的任务。
近年来，植物精油以其显著的抑菌活性和广泛的抗菌谱范围，以及与化学抑菌剂相比副作用和残留毒性小的独特优势，在抑菌研究方面得到了广泛的关注，被认为是开发天然防腐保鲜剂的重要原料[2，3]。目前植物精油对冬枣主要采后致病菌的抑制效果研究较少，冬枣精油天然防腐保鲜剂的开发也鲜见报道。本实验以陕西地区冬枣采后贮藏中分离鉴定的病原菌作为供试菌种，对5种天然植物精油（罗勒精油、薰衣草精油、红百里香精油、松红梅精油、迷迭香精油）进行抑菌试验，筛选可有效抑制病原菌的植物精油，为冬枣采后病害的有效防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
冬枣为陕西渭南市售的在半红期采摘的果实，挑选无病虫害和机械伤的鲜果用流动水冲洗，表面自然沥干，置于室温进行贮藏，让其在贮藏的过程中病变。
植物精油罗勒精油、薰衣草精油、红百里香精油、松红梅精油和迷迭香精油均购自上海雅琪实业有限公司，试验前置于低温（4 ℃）避光环境下保存。
1.2 方法
1.2.1 病原菌分离与纯化 采用常规方法，在PDA培养基中分离病原菌，待产孢后对病原菌孢子进行浓度梯度稀释，涂于平皿，并在28 ℃培养2 d后于倒置显微镜下挑取单孢子，移入另一装有PDA的平皿，28 ℃培养，待菌丝长出后，即得纯化菌株。
1.2.2 标准菌悬液的制备 挑取各菌落接种到平皿上，进行培养， 然后用无菌生理盐水洗
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1.2.3 滤纸片法测定抑菌圈 选择吸水性强的定性滤纸，用打孔器打成若干直径为6 mm的圆形滤纸片，放入电热干燥箱中经160 ℃干热灭菌2 h后，把灭好菌的滤纸片放入植物精油中浸渍4 h，取出滤纸片放在无菌的条件下沥干备用。将活化并调整好菌液浓度的酵母菌菌悬液0.1 mL加入已经倒好的YPD培养基平皿中，根霉菌倒入察氏培养基平皿上，并涂布均匀。取浸泡过精油的滤纸片贴在含菌平皿上，每皿平行做3片，每种菌平行做3个皿。然后用相应的提取溶剂作阴性对照，用青霉素G作阳性对照。酵母菌、根霉菌置培养箱中28 ℃恒温培养48 h。选取抑菌圈比较明显的平板，用十字交叉法测量菌落生长的直径，结果取3次重复试验的平均值[68]。
1.2.4 最低抑菌浓度（MIC）的测定 在无菌条件下，将植物精油稀释成下列不同浓度梯度：200、100、50、25、12.5、6.25 μL/mL。吸取各浓度稀释液1 mL，分别加到已灭菌的9 mL PDA培养基中制成带药的平皿，编号后吸取待测菌种的悬浮液100 μL于平皿表面，涂布均匀，酵母菌、根霉菌置于恒温箱28 ℃下培养48 h，以完全没有菌生长的最低浓度作为该精油的最低抑菌浓度（MIC）[9，10]。
1.2.5 最低杀菌浓度（MBC）的测定 将在测定最低抑菌浓度（MIC）试验中没有长菌的平皿继续培养48 h后取出观察，以完全无菌生长的为最低杀菌浓度（MBC）[11]。
2 结果与分析
2.1 冬枣病原菌鉴定
从贮藏的冬枣果实上分离出两种病原菌，挑取各菌落少许到载玻片上，用显微镜观察、测量，根据各病原菌的形态特征对其进行鉴定。经过鉴定冬枣上分离出的两种病原菌是酵母菌和根霉菌。
酵母菌菌落呈现乳白色，少数为红色，表面光滑湿润，质地柔软不透明，菌落直径为1～2 mm。孢子为圆形，单生或成串。
根霉菌菌落呈圆形，初形成时为灰白色和黄白色，成熟后变为黑色，匍匐菌丝弧形，无色，向四周蔓延。孢子囊刚出现时为黄白色，成熟后变为黑色。
2.2 5种植物精油对冬枣病原菌抑制效果
2.2.1 抑菌圈的大小 5种植物精油、无菌生理盐水和青霉素G对冬枣病原菌的抑菌作用如表1。参照李春美等[12]抑菌实验判定标准（抑菌圈直径大于15 mm为最敏感，10～15 mm时为中度敏感，7～9 mm为低度敏感，无抑菌圈者不敏感），认为5种植物精油中红百里香精油对两种病原菌表现出了最强的抑菌活性，抑菌圈直径均大于20 mm，属最敏感；罗勒精油对根霉菌的抑制作用仅次于红百里香精油，也属最敏感，而对酵母菌属于中度敏感；薰衣草精油、松红梅精油对酵母菌的抑菌圈直径介于7～9 mm，属低度敏感，而这两种精油对根霉菌属中度敏感；迷迭香精油对酵母菌属低度敏感，而对根霉菌属中度敏感。综合比较来看，5种精油对根霉菌的抑制作用要强于对酵母菌的抑制作用。 2.2.2 5种植物精油MIC的测定 表2列出了供试菌种在不同精油浓度下生长状况和MIC值，精油的MIC值越小，说明精油抑制作用越强。从表3中可以看出，酵母菌和根霉菌在不同浓度的精油作用下，生长状况差异明显，试验所得到的MIC值与滤纸片法所得到的结
宋姝婧等：几种植物精油对冬季病原菌的抑菌试验
果是基本一致的。红百里香精油对酵母菌和根霉菌都表现出了强烈的抑制作用，最低抑菌浓度均为0.625 μL/mL；而罗勒精油对根霉菌表现出的抑制作用远远大于对酵母菌所表现的抑制作用，对酵母菌的MIC是10 μL/mL，对根霉菌的MIC是1.25 μL/mL ；松红梅精油和迷迭香精油对根霉菌抑菌作用较弱，而对于酵母菌的抑制作用极小，超出了实验所设的浓度梯次范围；迷迭香精油对根霉菌的MIC为20 μL/mL；薰衣草精油对酵母菌和根霉菌也都表现出了一定的抑制作用，对酵母菌的MIC为20 μL/mL，对根霉菌的MIC为10 μL/mL。
2.2.3 5种植物精油MBC的测定 表3列出
了供试菌种在不同精油浓度下生长状况和MBC值。从表3中可以看出，红百里香精油对酵母菌和根霉菌都表现出了强烈的杀菌能力，红百里香精油对酵母菌和根霉菌的MBC值分别是1.25 μL/mL和2.5 μL/mL，为5种植物精油中最低的杀菌浓度；相对酵母菌，罗勒精油对根霉菌表现出了更强的杀菌能力，MBC值分别为20 μL/mL和5 μL/mL；其余几种精油对供试菌的杀菌能力都比较弱。
3 结论
对贮藏的病变冬枣上的病原菌进行分离、提纯、鉴定，结果表明导致冬枣病变的主要病原菌为酵母菌和根霉菌。5种植物精油均对酵母菌、根霉菌有一定的抑制能力，其中红百里香精油对酵母菌和根霉菌有着最强的抑制作用，抑菌圈直径分别为（22.43±0.06） mm、（23.48±0.06） mm。红百里香精油对酵母菌的MIC值是0.625 μL/mL，MBC值是1.25 μL/mL，对根霉菌的MIC是0.625 μL/mL，MBC值是2.5 μL/mL。另外，5种植物精油均表现出对根霉菌的抑制效果强于酵母菌的特点，其作用机理尚需进一步研究。综上，红百里香精油对冬枣采后病原菌有很强的抑制能力，可作为开发冬枣天然防腐保鲜剂的重要原料，关于其对冬枣的保鲜防腐效果尚需具体研究，使其更具实际应用性。
参考文献
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