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摘 要： 声动力疗法（SDT）是通过超声和声敏剂的协同作用，并利用多种机制共同作用达到杀死癌细胞的目的.超声的机械波穿透力强，SDT利用超声激活声敏剂产生局部毒性，与传统治疗方法相比，对正常细胞和组织伤害较小，是一种新型的治疗癌症的方法.声敏剂是影响SDT的重要因素，单一有机声敏剂有一定的生物应用缺陷，现在主要的研究方向是将声敏剂和纳米技术相结合，使用纳米载体负载有机声敏剂和新型无机声敏剂.目前为止，SDT仍处于临床前和临床研究阶段，大量体外和体内实验表明：SDT对于多种癌细胞有杀伤作用，具有广阔的应用前景.简述了SDT作用机制、声敏剂的种类和当前应用研究的进展.
关键词： 声动力疗法（SDT）; 声敏剂; 纳米技术
中图分类号： O 613.7 文献标志码： A 文章编号： 1000-5137（2020）04-0405-11
Abstract： Sonodynamic therapy （SDT） works by the synergistic effect of ultrasound and sonosensitizers to kill cancer cells through multiple mechanisms.As a mechanical wave，ultrasound can penetrate deep tissues.Compared with traditional treatment methods，SDT uses ultrasound to activate the sonosensitizers to produce local toxicity and causes less damage to normal cells and tissues.Sonosensitizers play an important role in the process of SDT.Due to the biological defects of the traditional organic sonosensitizers，the major research direction is to combine sonosensitizers with nanotechnology by using nanocarriersor developing new inorganic sonosensitizers.So far，SDT is still in the preclinical and clinical research stage.Recent in vitro and in vivo studies have showed that SDT can kill a variety of cancer cells and have broad application prospects.We briefly described the mechanism of SDT，the type of sonosensitizers and the current applications of SDT.
Key words： sonodynamic therapy（SDT）; sonosensitizers; nanotechnology
0 引 言
声动力疗法（SDT）是一种利用超声和声敏剂协同作用的非侵入性肿瘤治疗方法.其主要原理是利用低强度超声（0.5～4.0 W·cm-2）照射于富集声敏剂的肿瘤部位，激活声敏剂，产生活性氧（ROS），从而杀死肿瘤细胞[1].
SDT无创且受肿瘤位置影响较小，可通过自组装纳米粒子增强的渗透和保留效应（EPR效应）准确靶向癌细胞以提高肿瘤积累量，经超声激发产生局部毒性，与传统放射化疗相比，副作用较小.SDT是在光动力疗法（PDT）基础上发展起来的，其原理相似.第一代的声敏剂是广泛使用的光敏剂.与PDT相比，SDT的主要优点是超声作为机械波具有高组织穿透性，这克服了PDT的穿透深度限制，为SDT在深部惡性肿瘤治疗中的应用提供了可能.研究者已将各种纳米载体和有机声敏剂结合，以改善声敏剂的生物相容性，并开发了新型无机声敏剂[2].近期的体外和体内研究表明：SDT对于实体瘤、白血病、动脉粥样硬化等有潜在治疗效果.另外，SDT还可以和其他诊疗手段进行联合，比如超声靶向微泡破坏技术（UTMD）、化疗、磁共振成像（MRI）、近红外荧光成像（NIR-FLI）等.
1 SDT作用机制
对SDT潜在机制的研究众多，但确切的机制有待阐明.大多数研究人员支持多种机制协同作用导致细胞死亡：超声产生空化现象和声机械/声化学过程，空化产生的能量促使水热解，以及通过声致发光（SL）转移能量，以激活声敏剂，从而提高机体内ROS浓度，引起一系列生物效应，最终导致细胞凋亡.
1.1 超声空化效应
超声波在液态介质中引起压力变化，导致组织液中产生气泡，从而产生了空化现象[3].根据超声条件和组织或细胞状态，空化效应分为稳定空化（非惯性空化）和惯性空化.前者产生温和的气泡，气泡由于超声作用处于连续的振动和振荡状态，形状和尺寸发生变化.而惯性空化与ROS的产生密切相关，惯性空化气泡吸收大量声能，气泡振动导致剧烈坍塌，在坍塌期间，会产生高温和高压，从而释放出大量的能量，因此惯性空化能够诱导水热解离，生成羟基自由基[4].塌陷产生的极端物理条件会对细胞骨架、细胞膜结构和生物酶的活性构成破坏性的影响，甚至可以杀死周围的细胞.
此外，空化会导致SL现象和声致穿孔现象.SL现象通过能量转移激发声敏剂的电子轨道，当激发电子返回基态时产生ROS.生成的ROS积聚在细胞质和细胞器内，破坏脂质、蛋白质和DNA，使细胞组织恶化，与其他因素共同作用，最终导致细胞凋亡.声致穿孔效应是指气泡在超声作用下振动，使细胞膜产生短暂性微孔，使得细胞膜和血管透化，促进药物有效地进入到病变组织. 1.2 氧化应激
ROS是一类化学性质活泼的含氧原子或原子团，包括单线态氧、超氧阴离子、羟基自由基等.在超声空化作用下，声敏剂将从基态激活到激发态，可以直接与周围的氧分子或其他底物分子反应，形成自由基.或者在返回基态时释放能量，释放的能量与周围的氧分子共同作用，导致单线态氧的产生.单线态氧被认为是声动力学活动的主要介质，具有氧化周围基质的能力，导致靶病理细胞不可逆转的破坏，直接介导细胞毒性.另外过氧化氢和超氧阴离子也可通过脂质过氧化的链反应机制诱导细胞损伤或凋亡.过量的ROS不仅会导致氧化应激，使机体损伤，还会引起细胞骨架收缩、染色质浓缩和DNA片段化，最终导致细胞凋亡[2，5].与正常细胞相比，肿瘤细胞处于乏氧环境，因此可调高ROS浓度，使其高于肿瘤细胞能承受的阈值，导致其死亡，而对正常细胞的影响较小.
理论上可以通过两种方法破坏体内氧化还原平衡，导致细胞死亡：1） 提高ROS浓度，促进ROS生成或抑制ROS清除;2） 降低ROS浓度，加入ROS清除剂，如黄酮及其衍生物.在实际应用中，前者使用较多.
1.3 超声诱导细胞凋亡
细胞凋亡是细胞死亡的一种形式，细胞凋亡过程中的细胞通常以细胞骨架收缩、染色质浓缩、DNA断裂和半胱天冬酶（Caspase）活化为特征.已知恶性细胞具有较高的代谢水平，SDT能损伤这些细胞的线粒体，使半胱天冬酶活化，导致线粒体膜电位（MMP）降低，并诱导细胞凋亡[6].
SDT中诱导细胞凋亡的机制主要有2种：1） SDT通过下调Bcl-2家族蛋白的表达水平和产生过量的ROS引起细胞凋亡.LI等[7]评估了卟啉钠介导的SDT（DVDMS-SDT）对体外和体内肝细胞癌的抗肿瘤作用.结果表明DVDMS-SDT增加了G2/M期细胞比例，降低了CDK1和Cyclin B1蛋白水平.生成的ROS上调了p53和Bax的表达，下调了Bcl-2的表达，导致caspase-3的激活，最终引发细胞凋亡.2） SDT通过线粒体膜中的钙离子（Ca2+）过载诱导细胞凋亡.过载的Ca2+改变线粒体膜的穿透率.DAI等[8]研究了血卟啉单甲醚（HMME）介导的SDT诱导C6胶质瘤细胞凋亡的机制，数据显示ROS产生水平增加、MMP降低和细胞色素c释放增加，证明SDT诱导细胞凋亡，并且与早期凋亡过程中的过载Ca2+相关.
1.4 其他机制
SDT可以破坏细胞骨架，短时间暴露于低强度脉冲超声会使得细胞骨架发生流化和再固化.流化的不稳定性为恶性细胞选择性摄取声敏剂提供了可能.
SDT还可以增强抗肿瘤免疫力.M1巨噬细胞分泌促炎细胞因子，对促炎起主要作用.M2巨噬细胞能减少炎症反应，在组织修复中发挥重要作用.M1巨噬细胞具有抗肿瘤能力，而M2巨噬细胞不具备.SDT将促进肿瘤内的M2巨噬细胞向M1巨噬细胞转换，还可以通过抑制新血管的生成，有效切断肿瘤血供，同时产生热疗效果来破坏肿瘤组织[9].
2 声敏剂
声敏剂的选择是SDT治疗的重要环节.声敏剂本身没有抑制活性且毒性较低，仅暴露在超声后才具有生物活性.可用聚焦超声使声敏剂在待治疗的肿瘤部位激活，与化疗和放射疗法相比，全身毒性较低.理想的声敏剂应对正常细胞没有显著毒性，能准确靶向肿瘤细胞，并且对超声波具有高敏感性和稳定性.
初代的声敏剂是光敏剂，比如卟啉或氧杂蒽酮类化合物.但是其水溶性较差、血液循环时间短，在生物微环境中较不稳定，无法在肿瘤部位大量聚集，另外这些分子在某些情况下毒性显著，限制了其临床应用.为了克服这些缺陷，人们将各类纳米粒子与SDT结合使用：1）使用纳米材料负载有机小分子声敏剂;2）开发具有声敏剂特征的无机纳米材料.这些纳米声敏剂显示出巨大的应用潜力.
2.1 有机声敏剂
有机声敏剂主要分为：卟啉及其衍生物、氧杂蒽酮类化合物、抗肿瘤药物、非甾体类抗炎药和其他声敏剂[3，10].
2.1.1 卟啉及其衍生物
實际研究中最常用的声敏剂是卟啉及其衍生物的这类初代声敏剂，通过修饰降低其光学毒性，生成了一系列卟啉衍生物，如原卟啉IX（PpIX）、HMME、卟啉衍生物镓配合物（ATX-70，ATX-S10）和卟啉新衍生物（DCPH-P-Na（I））[11-13]，如图1所示.PpIX是血卟啉衍生物，通过在亚铁螯合酶催化下与亚铁螯合，转化为最终产物血红素.除了PpIX本身的外源性供应外，PpIX在组织或细胞中的积累可以通过加入其前体来产生，例如5-氨基乙酰丙酸（ALA）及其衍生物[9，14-15].使用ALA的主要优点是ALA本身不是超声敏化剂，代谢迅速，可以降低皮肤光毒性的风险.
酞菁（Pc）是苯并氮杂卟啉，作为SDT的声敏剂，对其的研究相对较少.羧基官能化的锌（II）酞菁具有良好的水溶性和高的单线态氧产率[16].XU等[17]制备了4-α-（3-羧基苯氧基）锌（II）酞菁（ZnPcC4）与牛血清白蛋白（BSA）结合物（ZnPcC4-BSA），测定了体外声动力学活性，ZnPcC4和ZnPcC4-BSA都显示出对HepG2肝癌细胞有杀伤作用，ZnPcC4-BSA具有更高的声动力学活性，半抑制浓度（IC50）值为7.5 μmol·L-1.
2.1.2 氧杂蒽酮类化合物
氧杂蒽酮类化合物是一系列染色剂，包括赤藓红B、玫瑰红（RB）、曙红和罗丹明.RB是荧光素的四氯四碘化衍生物，单独使用没有细胞毒性，RB与聚焦超声的联合使用可以选择性地抑制肿瘤生长，且不会损害正常的组织.为了改善RB的高水溶性和较差的生物利用度，CHEN等[18]设计合成和表征了一系列两亲性RB衍生物（RBD），结果表明引入适当的甲氧基聚乙二醇可以增强细胞摄取，并改善细胞内ROS的产生，合成的衍生物具有与卟啉钠相似的相对效力，如图2所示. 2.1.3 抗肿瘤药物和非甾体类抗炎药
超声可增加一些抗癌和化疗药物对病变细胞的杀伤能力，如顺铂、阿霉素等[3，19-20].阿霉素是一种蒽环类抗生素，常用于治疗多种癌症，可导致DNA损伤、细胞凋亡、氧自由基和羟基自由基的产生以及空化效应的增强.但是，阿霉素较大的副作用和全身毒性限制了最大耐受剂量，可利用脂质体负载增加药物聚集量，同时减少毒性脱靶效应.喹诺酮类非甾体抗炎药和超声作用也具有协同抗癌的作用，包括左氧氟沙星（LVFX）、环丙沙星（CPFX）、加替沙星（GFLX）、洛美沙星（LFLX）和司帕沙星（SPFX）[21].
2.1.4 其他声敏剂
姜黄素是姜黄根茎的提取物，可以保护动脉壁中的炎症细胞免于过多的脂质积累，姜黄素和羟基酰化姜黄素可用作动脉粥样硬化临床治疗的新型超声敏感剂.近期姜黄素被证明是一种有效的抗敏感剂，可以抵抗各种细菌，已证明姜黄素的声动力作用对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）[22]和食源性细菌[23]具有灭活作用.
竹红菌素B（HB）是从中草药中分离的活性成分，被广泛用作治疗类风湿性关节炎、胃病和皮肤病的药物.JIA等[24]研究了人乳腺癌MDA-MB-231细胞对HB介导的SDT的生物反应，结果表明，HB介导的SDT显著诱导细胞凋亡，产生大量ROS并破坏线粒体活性.另外EL-SIKHRY等[25]证明HB的衍生物SL-017可作为声敏剂，用于靶向线粒体，触发MMP的丧失，诱导ROS的产生，最终导致线粒体断裂，如图3所示.
2.2 负载有机声敏剂的纳米材料
将SDT与纳米技术相结合主要有以下优势：1） 使用自组装的纳米粒子可以通过EPR效应优先在肿瘤部位积累药物，并且在药物传递过程中为声敏剂提供保护屏障;2） 通过在纳米粒子表面修饰官能团，以改善材料的生物相容性;3） 纳米粒子可以根据生理环境的变化（例如pH、氧化还原电位和酶）产生特异性响应，从而控制声敏剂的释放.纳米材料的尺寸与治疗效果密切相关，目前研究的纳米粒子粒径多为1～200 nm，过大的粒径会使纳米粒子更倾向于被吞噬细胞识别和清除.
根据载体携带声敏剂的方式可分为两类[2]：一类是包封，将声敏剂物理包封在纳米粒子内部;另一类是将声敏剂与纳米底物进行共价偶联.声敏剂可以直接结合在纳米粒子的表面，也可以先连接到聚合物主链上，获得的聚合物-声敏剂缀合物，再进一步自组装成纳米粒子.包封所得的复合材料更容易产生特异性响应，而利用共价偶联的方式携带的声敏剂载体具有更高的载药量、持续的药物释放和更好的稳定性.
一般来说，纳米粒子的设计包括3个组成部分[26]：1） 成像剂和治疗剂;2） 为所载药物提供物理保护的载体，分为有机载体和无机载体;3） 在载体表面附着表面活化剂，改善材料的生物相容性，或为缺失型纳米材料提供额外的性质，例如长循环时间、屏障穿透能力和靶特异性结合能力.纳米粒子示意图如图4所示.
2.2.1 有机载体
有机纳米载体可以通过较小的有机分子或聚合物自组装获得.通过调节载体表面性质、化学结构和微形态，纳米粒子可以产生特异性响应，有效地控制包封的超声敏化剂的释放.
脂质或两亲聚合物可以组装成脂质体或胶束结构，内部为中空结构，通过调节内表面的亲水性程度，可加载亲水性或疏水性治疗剂[27].WAN等[28]将血卟啉和阿霉素共同加载到Pluronic F68纳米胶束（聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的三嵌段共聚物）中，得到复合材料HPDF纳米胶束，研究了HPDF纳米胶束对人耐药乳腺癌MCF-7/ADR的声动力效果.HPDF纳米胶束与低强度超声结合可有效抑制细胞增殖，与游离阿霉素相比，HPDF纳米胶束显著逆转MCF-7/ADR细胞的耐药性.ZHOU等[29]将二氢卟酚e6（Ce6）掺入脂质体的脂质双层中，并用天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸（NGR）修饰，同时在复合材料中封装了阿霉素，该复合材料能够在肿瘤部位聚集，显示出良好的靶向性和高的选择性.
聚合物-药物偶联物主要有3个组分：作为载体的水溶性聚合物骨架，疏水性药物分子和用于响应性的靶向部分[30].由于强的两亲性质，聚合物-药物缀合物倾向于在水溶液中自组装成核壳纳米结构.GAO等[31]制备了壳聚糖（CS）/孟加拉玫瑰红ω-羧基庚基酯（RBD）复合纳米粒子（RBDCNs）.复合纳米粒子粒径为150～200 nm，CS的加入使RBD的荧光强度显着降低，证明RBD成功载入.根据体外实验，复合材料在HT29和HepG2细胞中实现有效的细胞摄取.
2.2.2 无机载体
介孔二氧化硅（MSNs）是纳米粒子的典型代表，在制备中使用硅烷混合物可便捷地掺入所选择的官能团和加载治疗剂或显像剂，改变合成条件可调整硅球尺寸并且有较高的载药量.WANG等[32]合成了用Ce6、羧基聚（乙二醇）硅烷和前列腺干细胞抗原（PSCA）单克隆抗体修饰的掺钬的二氧化硅空心球（HHSN-C/P-mA）.研究结果表明，所合成的复合材料能够在酸性微环境下降解，经超声照射后，HHSN-C/P-mA产生ROS杀死癌细胞并激活材料所负载的替拉扎明药物，产生治疗效果，具有很好的协同治疗作用.
金纳米粒子（AuNPs）由于其固有的生物惰性和无毒性被广泛用作药物传递的纳米载体，其表面可用活性靶向单元（蛋白质、肽、单克隆抗体和小分子等）功能化，以避免非特异性摄取，从而实现肿瘤特异性靶向[33-34].AuNPs与PpIX结合经超声作用对BALB/c小鼠的结肠癌表现出显著的抑制作用[35].另外AuNPs本身可以被超声激活发挥治疗效果，AuNPs作为超声空化的成核位点，降低空化閾值，提高空化率从而增强SDT作用.
2.3 无机声敏剂
二氧化钛（TiO2）纳米粒子（TiO2NPs）具有化学惰性，TiO2NPs中的高活性电子和空穴可与氧或水分子反应生成各种类型的ROS[4，36-37].然而，纯TiO2NPs只能产生有限的ROS，这可能是因为空化产生的能量不足以激发TiO2.可以通过在TiO2纳米晶体表面上形成缺氧的TiO2-x层来增强声动力效果，制得结晶无序的核-壳结构（TiO2@TiO2-x）[38].TiO2-x层具有丰富的氧缺陷，在超声作用时有助于电子和空穴与能带结构的分离.还可以用银纳米粒子与TiO2结合增加催化活性[39]，或构建具有高ROS产生能力的亲水性Au-TiO2（HAu-TiO2）纳米平台作为改进SDT的有效声敏剂.另外TiO2NPs在水和血液中的有限分散性可能会导致聚集和沉淀，会增加对健康细胞的副作用，因此常用高分子聚合物材料对TiO2NPs进行化学改性[40]. 另一类常见的无机声敏剂是磁性纳米粒子，比如Fe3O4纳米粒子（Fe3O4NPs）[41].基于芬顿反应，过氧化氢和铁离子催化反应在超声辅助下，可以生成羟基自由基对细胞产生毒性，另外磁性纳米材料可同时作为造影剂为MRI提供可能[42-43].除此之外晶体硅纳米材料也能产生ROS，OSMINKINA等[44]发现超声能激活硅纳米材料产生ROS，研究结果表明：表面覆盖葡聚糖的多孔硅纳米粒子可以作为声敏剂抑制癌细胞的增殖.
3 应用
3.1 SDT应用
国内外许多体外和体内研究证明了SDT对各种癌细胞具有杀伤力，是一种潜在的治疗手段.SDT除了能治疗实体瘤，还具有治疗动脉粥样硬化和白血病的潜力.
动脉粥样硬化是心血管疾病，脂质和复合糖类在血管内聚集，最终形成血栓.在大多数情况下，低频超声对抗血小板、抗血栓，以及与纤维蛋白溶解药物具有累加效应，因此超声波成为血栓形成后血管再通的有效方式.PpIX和5-氨基乙酰丙酸已被证实在体外和体内对动脉粥样硬化均有有效的治疗效果.GONCALVE等[45]通过光还原合成用聚乙二醇（PEG）修饰的氨基乙酰丙酸甲酯（MALA）金纳米粒子（MALA∶AuNPs），通过细胞毒性研究和SDT，超声暴露2 min后，AuNPs达到高峰，同时巨噬细胞存活率降低.证明了SDT具有治疗动脉粥样硬化的潜力.
超声对于未附着的恶性细胞非常有效，所以被用来治疗白血病.超声诱导白血病细胞凋亡具有以下特征：线粒体功能紊乱、磷脂酰丝氨酸不对称性丧失、形态学改变和最终DNA断裂.还可以观察到细胞内谷胱甘肽（GSH）水平显著降低，表明氧化应激在超声诱导的细胞凋亡中起作用.WANG等[46]研究小鼠白血病L1210细胞对PpIX介导的SDT的自噬和凋亡反应，结果表明：自噬损伤通过诱导细胞凋亡和坏死来增强SDT的抗肿瘤作用，而半胱天冬酶抑制不影响自噬泡的形成.
3.2 联合疗法
SDT常与UTMD结合用来治疗恶性胶质瘤.UTMD是将超声波和微泡结合的技术，微泡由外壳和内充气体两部分组成，内充气体以氟、碳气体为主.也有研究人员合成了载氧微泡用于治疗胰腺癌[47].由于空化效应，UTMD可有效增强局部药物传递和治疗效果.SUN等[48]使用UTMD和iRGD肽（一种序列为CRGDKGPDC的环状多肽）修饰的卟啉钠脂质体用于治疗胶质瘤.在用UTMD打开血脑屏障后，iRGD修饰的脂质体显示出增强的肿瘤靶向能力和良好的体内生物相容性.图5是SDT和UTMD联合治疗神经胶质瘤的示意图[49].
LOGAN等[50]将将SDT与化疗相结合作为乳腺癌的潜在治疗方法，测定了加载化疗药物紫杉醇和声敏剂RB的载氧微泡在人乳腺癌的三维球状模型和携带皮下MCF-7肿瘤的鼠模型中的功效.结果表明：用載药微泡和超声处理后球体的细胞活力和肿瘤体积均显著降低，协同治疗组的动物体重没有显著变化.
利用磁性纳米粒子作为载体或者在材料中掺入磁性元素，使复合材料具有MRI对比性能.GORGIZADEH等[51]合成了镍铁氧体/碳纳米复合材料（NiFe2O4/C），向声动力协同治疗组小鼠瘤内注射100 μg·mL-1的材料，结果表明：黑素瘤癌细胞受到损伤.该体系在1.5 T时，相应的横向弛豫率（r2）为78.9 mmol-1·L·s-1，证明合成的纳米复合材料可同时用于SDT和MRI. HUANG等[52]将卟啉锰负载到介孔有机硅纳米粒子中，制得的复合材料具有高的MRI性能，纵向弛豫率（r1）为9.43 mmol-1·L·s-1，能用于SDT监测.
SDT还可以与NIR-FLI相结合，NIR-FLI可以通过光谱分辨和对比增强技术实时监测体内超声敏感剂的分布，检测肿瘤.ZHENG等[53]用1，2-二氨基丙烷修饰HB以形成HB衍生物（APHB），再与聚乙丙交酯聚乙二醇（PEG-PLGA）自组装制得HB衍生物纳米粒子.制备的APHB纳米粒子（APHBNPs）在近红外区域表现出优异的水溶性，并且在超声刺激下产生ROS.
4 总结和展望
SDT能在无创条件下穿透较深的组织细胞，通过超声空化效应、氧化应激以及一系列生物效应，最终导致细胞凋亡.大量的研究结果表明：通过超声和声敏剂的协同效应，SDT成为一种可行的深度治疗实体瘤的方式，而且对动脉粥样硬化、白血病等疾病也具有治疗效果.SDT能够与UTMD、化疗、MRI、NIR-FLI等诊疗手段相结合，以期得到更好的治疗效果.
SDT在实际临床应用之前还有很多问题有待解决.研究最广泛的声敏剂是光敏剂，会引起严重的光毒性和不良副作用;另一些声敏剂是临床药物，如阿霉素和LVFX，若使用剂量较大，对正常细胞也有毒副作用.因此需要进行广泛的研究，以确认这些方法是否可以推进到临床测试，进一步确认治疗药物最合适的剂量、暴露时间、给药途径和频率.SDT的治疗效果还取决于超声装置，人骨和鼠骨的硬度差异，需要更强的超声波来穿透骨头和激活声敏剂，还需要稳定和非衰减的超声波保证治疗期间的能量稳态.
因此，现在对于SDT的一个重要研究方向是寻找毒性更小、清除率更高的声敏剂.用纳米材料负载传统声敏剂，通过特异性响应使其在肿瘤部位释放，以减少全身毒性，或者是开发新型的无机声敏剂.随着基础研究和临床实验的进一步展开，SDT会不断成熟，实际应用也将越来越广泛.
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（責任编辑：郁慧，包震宇）
关键词： 声动力疗法（SDT）; 声敏剂; 纳米技术
中图分类号： O 613.7 文献标志码： A 文章编号： 1000-5137（2020）04-0405-11
Abstract： Sonodynamic therapy （SDT） works by the synergistic effect of ultrasound and sonosensitizers to kill cancer cells through multiple mechanisms.As a mechanical wave，ultrasound can penetrate deep tissues.Compared with traditional treatment methods，SDT uses ultrasound to activate the sonosensitizers to produce local toxicity and causes less damage to normal cells and tissues.Sonosensitizers play an important role in the process of SDT.Due to the biological defects of the traditional organic sonosensitizers，the major research direction is to combine sonosensitizers with nanotechnology by using nanocarriersor developing new inorganic sonosensitizers.So far，SDT is still in the preclinical and clinical research stage.Recent in vitro and in vivo studies have showed that SDT can kill a variety of cancer cells and have broad application prospects.We briefly described the mechanism of SDT，the type of sonosensitizers and the current applications of SDT.
Key words： sonodynamic therapy（SDT）; sonosensitizers; nanotechnology
0 引 言
声动力疗法（SDT）是一种利用超声和声敏剂协同作用的非侵入性肿瘤治疗方法.其主要原理是利用低强度超声（0.5～4.0 W·cm-2）照射于富集声敏剂的肿瘤部位，激活声敏剂，产生活性氧（ROS），从而杀死肿瘤细胞[1].
SDT无创且受肿瘤位置影响较小，可通过自组装纳米粒子增强的渗透和保留效应（EPR效应）准确靶向癌细胞以提高肿瘤积累量，经超声激发产生局部毒性，与传统放射化疗相比，副作用较小.SDT是在光动力疗法（PDT）基础上发展起来的，其原理相似.第一代的声敏剂是广泛使用的光敏剂.与PDT相比，SDT的主要优点是超声作为机械波具有高组织穿透性，这克服了PDT的穿透深度限制，为SDT在深部惡性肿瘤治疗中的应用提供了可能.研究者已将各种纳米载体和有机声敏剂结合，以改善声敏剂的生物相容性，并开发了新型无机声敏剂[2].近期的体外和体内研究表明：SDT对于实体瘤、白血病、动脉粥样硬化等有潜在治疗效果.另外，SDT还可以和其他诊疗手段进行联合，比如超声靶向微泡破坏技术（UTMD）、化疗、磁共振成像（MRI）、近红外荧光成像（NIR-FLI）等.
1 SDT作用机制
对SDT潜在机制的研究众多，但确切的机制有待阐明.大多数研究人员支持多种机制协同作用导致细胞死亡：超声产生空化现象和声机械/声化学过程，空化产生的能量促使水热解，以及通过声致发光（SL）转移能量，以激活声敏剂，从而提高机体内ROS浓度，引起一系列生物效应，最终导致细胞凋亡.
1.1 超声空化效应
超声波在液态介质中引起压力变化，导致组织液中产生气泡，从而产生了空化现象[3].根据超声条件和组织或细胞状态，空化效应分为稳定空化（非惯性空化）和惯性空化.前者产生温和的气泡，气泡由于超声作用处于连续的振动和振荡状态，形状和尺寸发生变化.而惯性空化与ROS的产生密切相关，惯性空化气泡吸收大量声能，气泡振动导致剧烈坍塌，在坍塌期间，会产生高温和高压，从而释放出大量的能量，因此惯性空化能够诱导水热解离，生成羟基自由基[4].塌陷产生的极端物理条件会对细胞骨架、细胞膜结构和生物酶的活性构成破坏性的影响，甚至可以杀死周围的细胞.
此外，空化会导致SL现象和声致穿孔现象.SL现象通过能量转移激发声敏剂的电子轨道，当激发电子返回基态时产生ROS.生成的ROS积聚在细胞质和细胞器内，破坏脂质、蛋白质和DNA，使细胞组织恶化，与其他因素共同作用，最终导致细胞凋亡.声致穿孔效应是指气泡在超声作用下振动，使细胞膜产生短暂性微孔，使得细胞膜和血管透化，促进药物有效地进入到病变组织. 1.2 氧化应激
ROS是一类化学性质活泼的含氧原子或原子团，包括单线态氧、超氧阴离子、羟基自由基等.在超声空化作用下，声敏剂将从基态激活到激发态，可以直接与周围的氧分子或其他底物分子反应，形成自由基.或者在返回基态时释放能量，释放的能量与周围的氧分子共同作用，导致单线态氧的产生.单线态氧被认为是声动力学活动的主要介质，具有氧化周围基质的能力，导致靶病理细胞不可逆转的破坏，直接介导细胞毒性.另外过氧化氢和超氧阴离子也可通过脂质过氧化的链反应机制诱导细胞损伤或凋亡.过量的ROS不仅会导致氧化应激，使机体损伤，还会引起细胞骨架收缩、染色质浓缩和DNA片段化，最终导致细胞凋亡[2，5].与正常细胞相比，肿瘤细胞处于乏氧环境，因此可调高ROS浓度，使其高于肿瘤细胞能承受的阈值，导致其死亡，而对正常细胞的影响较小.
理论上可以通过两种方法破坏体内氧化还原平衡，导致细胞死亡：1） 提高ROS浓度，促进ROS生成或抑制ROS清除;2） 降低ROS浓度，加入ROS清除剂，如黄酮及其衍生物.在实际应用中，前者使用较多.
1.3 超声诱导细胞凋亡
细胞凋亡是细胞死亡的一种形式，细胞凋亡过程中的细胞通常以细胞骨架收缩、染色质浓缩、DNA断裂和半胱天冬酶（Caspase）活化为特征.已知恶性细胞具有较高的代谢水平，SDT能损伤这些细胞的线粒体，使半胱天冬酶活化，导致线粒体膜电位（MMP）降低，并诱导细胞凋亡[6].
SDT中诱导细胞凋亡的机制主要有2种：1） SDT通过下调Bcl-2家族蛋白的表达水平和产生过量的ROS引起细胞凋亡.LI等[7]评估了卟啉钠介导的SDT（DVDMS-SDT）对体外和体内肝细胞癌的抗肿瘤作用.结果表明DVDMS-SDT增加了G2/M期细胞比例，降低了CDK1和Cyclin B1蛋白水平.生成的ROS上调了p53和Bax的表达，下调了Bcl-2的表达，导致caspase-3的激活，最终引发细胞凋亡.2） SDT通过线粒体膜中的钙离子（Ca2+）过载诱导细胞凋亡.过载的Ca2+改变线粒体膜的穿透率.DAI等[8]研究了血卟啉单甲醚（HMME）介导的SDT诱导C6胶质瘤细胞凋亡的机制，数据显示ROS产生水平增加、MMP降低和细胞色素c释放增加，证明SDT诱导细胞凋亡，并且与早期凋亡过程中的过载Ca2+相关.
1.4 其他机制
SDT可以破坏细胞骨架，短时间暴露于低强度脉冲超声会使得细胞骨架发生流化和再固化.流化的不稳定性为恶性细胞选择性摄取声敏剂提供了可能.
SDT还可以增强抗肿瘤免疫力.M1巨噬细胞分泌促炎细胞因子，对促炎起主要作用.M2巨噬细胞能减少炎症反应，在组织修复中发挥重要作用.M1巨噬细胞具有抗肿瘤能力，而M2巨噬细胞不具备.SDT将促进肿瘤内的M2巨噬细胞向M1巨噬细胞转换，还可以通过抑制新血管的生成，有效切断肿瘤血供，同时产生热疗效果来破坏肿瘤组织[9].
2 声敏剂
声敏剂的选择是SDT治疗的重要环节.声敏剂本身没有抑制活性且毒性较低，仅暴露在超声后才具有生物活性.可用聚焦超声使声敏剂在待治疗的肿瘤部位激活，与化疗和放射疗法相比，全身毒性较低.理想的声敏剂应对正常细胞没有显著毒性，能准确靶向肿瘤细胞，并且对超声波具有高敏感性和稳定性.
初代的声敏剂是光敏剂，比如卟啉或氧杂蒽酮类化合物.但是其水溶性较差、血液循环时间短，在生物微环境中较不稳定，无法在肿瘤部位大量聚集，另外这些分子在某些情况下毒性显著，限制了其临床应用.为了克服这些缺陷，人们将各类纳米粒子与SDT结合使用：1）使用纳米材料负载有机小分子声敏剂;2）开发具有声敏剂特征的无机纳米材料.这些纳米声敏剂显示出巨大的应用潜力.
2.1 有机声敏剂
有机声敏剂主要分为：卟啉及其衍生物、氧杂蒽酮类化合物、抗肿瘤药物、非甾体类抗炎药和其他声敏剂[3，10].
2.1.1 卟啉及其衍生物
實际研究中最常用的声敏剂是卟啉及其衍生物的这类初代声敏剂，通过修饰降低其光学毒性，生成了一系列卟啉衍生物，如原卟啉IX（PpIX）、HMME、卟啉衍生物镓配合物（ATX-70，ATX-S10）和卟啉新衍生物（DCPH-P-Na（I））[11-13]，如图1所示.PpIX是血卟啉衍生物，通过在亚铁螯合酶催化下与亚铁螯合，转化为最终产物血红素.除了PpIX本身的外源性供应外，PpIX在组织或细胞中的积累可以通过加入其前体来产生，例如5-氨基乙酰丙酸（ALA）及其衍生物[9，14-15].使用ALA的主要优点是ALA本身不是超声敏化剂，代谢迅速，可以降低皮肤光毒性的风险.
酞菁（Pc）是苯并氮杂卟啉，作为SDT的声敏剂，对其的研究相对较少.羧基官能化的锌（II）酞菁具有良好的水溶性和高的单线态氧产率[16].XU等[17]制备了4-α-（3-羧基苯氧基）锌（II）酞菁（ZnPcC4）与牛血清白蛋白（BSA）结合物（ZnPcC4-BSA），测定了体外声动力学活性，ZnPcC4和ZnPcC4-BSA都显示出对HepG2肝癌细胞有杀伤作用，ZnPcC4-BSA具有更高的声动力学活性，半抑制浓度（IC50）值为7.5 μmol·L-1.
2.1.2 氧杂蒽酮类化合物
氧杂蒽酮类化合物是一系列染色剂，包括赤藓红B、玫瑰红（RB）、曙红和罗丹明.RB是荧光素的四氯四碘化衍生物，单独使用没有细胞毒性，RB与聚焦超声的联合使用可以选择性地抑制肿瘤生长，且不会损害正常的组织.为了改善RB的高水溶性和较差的生物利用度，CHEN等[18]设计合成和表征了一系列两亲性RB衍生物（RBD），结果表明引入适当的甲氧基聚乙二醇可以增强细胞摄取，并改善细胞内ROS的产生，合成的衍生物具有与卟啉钠相似的相对效力，如图2所示. 2.1.3 抗肿瘤药物和非甾体类抗炎药
超声可增加一些抗癌和化疗药物对病变细胞的杀伤能力，如顺铂、阿霉素等[3，19-20].阿霉素是一种蒽环类抗生素，常用于治疗多种癌症，可导致DNA损伤、细胞凋亡、氧自由基和羟基自由基的产生以及空化效应的增强.但是，阿霉素较大的副作用和全身毒性限制了最大耐受剂量，可利用脂质体负载增加药物聚集量，同时减少毒性脱靶效应.喹诺酮类非甾体抗炎药和超声作用也具有协同抗癌的作用，包括左氧氟沙星（LVFX）、环丙沙星（CPFX）、加替沙星（GFLX）、洛美沙星（LFLX）和司帕沙星（SPFX）[21].
2.1.4 其他声敏剂
姜黄素是姜黄根茎的提取物，可以保护动脉壁中的炎症细胞免于过多的脂质积累，姜黄素和羟基酰化姜黄素可用作动脉粥样硬化临床治疗的新型超声敏感剂.近期姜黄素被证明是一种有效的抗敏感剂，可以抵抗各种细菌，已证明姜黄素的声动力作用对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）[22]和食源性细菌[23]具有灭活作用.
竹红菌素B（HB）是从中草药中分离的活性成分，被广泛用作治疗类风湿性关节炎、胃病和皮肤病的药物.JIA等[24]研究了人乳腺癌MDA-MB-231细胞对HB介导的SDT的生物反应，结果表明，HB介导的SDT显著诱导细胞凋亡，产生大量ROS并破坏线粒体活性.另外EL-SIKHRY等[25]证明HB的衍生物SL-017可作为声敏剂，用于靶向线粒体，触发MMP的丧失，诱导ROS的产生，最终导致线粒体断裂，如图3所示.
2.2 负载有机声敏剂的纳米材料
将SDT与纳米技术相结合主要有以下优势：1） 使用自组装的纳米粒子可以通过EPR效应优先在肿瘤部位积累药物，并且在药物传递过程中为声敏剂提供保护屏障;2） 通过在纳米粒子表面修饰官能团，以改善材料的生物相容性;3） 纳米粒子可以根据生理环境的变化（例如pH、氧化还原电位和酶）产生特异性响应，从而控制声敏剂的释放.纳米材料的尺寸与治疗效果密切相关，目前研究的纳米粒子粒径多为1～200 nm，过大的粒径会使纳米粒子更倾向于被吞噬细胞识别和清除.
根据载体携带声敏剂的方式可分为两类[2]：一类是包封，将声敏剂物理包封在纳米粒子内部;另一类是将声敏剂与纳米底物进行共价偶联.声敏剂可以直接结合在纳米粒子的表面，也可以先连接到聚合物主链上，获得的聚合物-声敏剂缀合物，再进一步自组装成纳米粒子.包封所得的复合材料更容易产生特异性响应，而利用共价偶联的方式携带的声敏剂载体具有更高的载药量、持续的药物释放和更好的稳定性.
一般来说，纳米粒子的设计包括3个组成部分[26]：1） 成像剂和治疗剂;2） 为所载药物提供物理保护的载体，分为有机载体和无机载体;3） 在载体表面附着表面活化剂，改善材料的生物相容性，或为缺失型纳米材料提供额外的性质，例如长循环时间、屏障穿透能力和靶特异性结合能力.纳米粒子示意图如图4所示.
2.2.1 有机载体
有机纳米载体可以通过较小的有机分子或聚合物自组装获得.通过调节载体表面性质、化学结构和微形态，纳米粒子可以产生特异性响应，有效地控制包封的超声敏化剂的释放.
脂质或两亲聚合物可以组装成脂质体或胶束结构，内部为中空结构，通过调节内表面的亲水性程度，可加载亲水性或疏水性治疗剂[27].WAN等[28]将血卟啉和阿霉素共同加载到Pluronic F68纳米胶束（聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的三嵌段共聚物）中，得到复合材料HPDF纳米胶束，研究了HPDF纳米胶束对人耐药乳腺癌MCF-7/ADR的声动力效果.HPDF纳米胶束与低强度超声结合可有效抑制细胞增殖，与游离阿霉素相比，HPDF纳米胶束显著逆转MCF-7/ADR细胞的耐药性.ZHOU等[29]将二氢卟酚e6（Ce6）掺入脂质体的脂质双层中，并用天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸（NGR）修饰，同时在复合材料中封装了阿霉素，该复合材料能够在肿瘤部位聚集，显示出良好的靶向性和高的选择性.
聚合物-药物偶联物主要有3个组分：作为载体的水溶性聚合物骨架，疏水性药物分子和用于响应性的靶向部分[30].由于强的两亲性质，聚合物-药物缀合物倾向于在水溶液中自组装成核壳纳米结构.GAO等[31]制备了壳聚糖（CS）/孟加拉玫瑰红ω-羧基庚基酯（RBD）复合纳米粒子（RBDCNs）.复合纳米粒子粒径为150～200 nm，CS的加入使RBD的荧光强度显着降低，证明RBD成功载入.根据体外实验，复合材料在HT29和HepG2细胞中实现有效的细胞摄取.
2.2.2 无机载体
介孔二氧化硅（MSNs）是纳米粒子的典型代表，在制备中使用硅烷混合物可便捷地掺入所选择的官能团和加载治疗剂或显像剂，改变合成条件可调整硅球尺寸并且有较高的载药量.WANG等[32]合成了用Ce6、羧基聚（乙二醇）硅烷和前列腺干细胞抗原（PSCA）单克隆抗体修饰的掺钬的二氧化硅空心球（HHSN-C/P-mA）.研究结果表明，所合成的复合材料能够在酸性微环境下降解，经超声照射后，HHSN-C/P-mA产生ROS杀死癌细胞并激活材料所负载的替拉扎明药物，产生治疗效果，具有很好的协同治疗作用.
金纳米粒子（AuNPs）由于其固有的生物惰性和无毒性被广泛用作药物传递的纳米载体，其表面可用活性靶向单元（蛋白质、肽、单克隆抗体和小分子等）功能化，以避免非特异性摄取，从而实现肿瘤特异性靶向[33-34].AuNPs与PpIX结合经超声作用对BALB/c小鼠的结肠癌表现出显著的抑制作用[35].另外AuNPs本身可以被超声激活发挥治疗效果，AuNPs作为超声空化的成核位点，降低空化閾值，提高空化率从而增强SDT作用.
2.3 无机声敏剂
二氧化钛（TiO2）纳米粒子（TiO2NPs）具有化学惰性，TiO2NPs中的高活性电子和空穴可与氧或水分子反应生成各种类型的ROS[4，36-37].然而，纯TiO2NPs只能产生有限的ROS，这可能是因为空化产生的能量不足以激发TiO2.可以通过在TiO2纳米晶体表面上形成缺氧的TiO2-x层来增强声动力效果，制得结晶无序的核-壳结构（TiO2@TiO2-x）[38].TiO2-x层具有丰富的氧缺陷，在超声作用时有助于电子和空穴与能带结构的分离.还可以用银纳米粒子与TiO2结合增加催化活性[39]，或构建具有高ROS产生能力的亲水性Au-TiO2（HAu-TiO2）纳米平台作为改进SDT的有效声敏剂.另外TiO2NPs在水和血液中的有限分散性可能会导致聚集和沉淀，会增加对健康细胞的副作用，因此常用高分子聚合物材料对TiO2NPs进行化学改性[40]. 另一类常见的无机声敏剂是磁性纳米粒子，比如Fe3O4纳米粒子（Fe3O4NPs）[41].基于芬顿反应，过氧化氢和铁离子催化反应在超声辅助下，可以生成羟基自由基对细胞产生毒性，另外磁性纳米材料可同时作为造影剂为MRI提供可能[42-43].除此之外晶体硅纳米材料也能产生ROS，OSMINKINA等[44]发现超声能激活硅纳米材料产生ROS，研究结果表明：表面覆盖葡聚糖的多孔硅纳米粒子可以作为声敏剂抑制癌细胞的增殖.
3 应用
3.1 SDT应用
国内外许多体外和体内研究证明了SDT对各种癌细胞具有杀伤力，是一种潜在的治疗手段.SDT除了能治疗实体瘤，还具有治疗动脉粥样硬化和白血病的潜力.
动脉粥样硬化是心血管疾病，脂质和复合糖类在血管内聚集，最终形成血栓.在大多数情况下，低频超声对抗血小板、抗血栓，以及与纤维蛋白溶解药物具有累加效应，因此超声波成为血栓形成后血管再通的有效方式.PpIX和5-氨基乙酰丙酸已被证实在体外和体内对动脉粥样硬化均有有效的治疗效果.GONCALVE等[45]通过光还原合成用聚乙二醇（PEG）修饰的氨基乙酰丙酸甲酯（MALA）金纳米粒子（MALA∶AuNPs），通过细胞毒性研究和SDT，超声暴露2 min后，AuNPs达到高峰，同时巨噬细胞存活率降低.证明了SDT具有治疗动脉粥样硬化的潜力.
超声对于未附着的恶性细胞非常有效，所以被用来治疗白血病.超声诱导白血病细胞凋亡具有以下特征：线粒体功能紊乱、磷脂酰丝氨酸不对称性丧失、形态学改变和最终DNA断裂.还可以观察到细胞内谷胱甘肽（GSH）水平显著降低，表明氧化应激在超声诱导的细胞凋亡中起作用.WANG等[46]研究小鼠白血病L1210细胞对PpIX介导的SDT的自噬和凋亡反应，结果表明：自噬损伤通过诱导细胞凋亡和坏死来增强SDT的抗肿瘤作用，而半胱天冬酶抑制不影响自噬泡的形成.
3.2 联合疗法
SDT常与UTMD结合用来治疗恶性胶质瘤.UTMD是将超声波和微泡结合的技术，微泡由外壳和内充气体两部分组成，内充气体以氟、碳气体为主.也有研究人员合成了载氧微泡用于治疗胰腺癌[47].由于空化效应，UTMD可有效增强局部药物传递和治疗效果.SUN等[48]使用UTMD和iRGD肽（一种序列为CRGDKGPDC的环状多肽）修饰的卟啉钠脂质体用于治疗胶质瘤.在用UTMD打开血脑屏障后，iRGD修饰的脂质体显示出增强的肿瘤靶向能力和良好的体内生物相容性.图5是SDT和UTMD联合治疗神经胶质瘤的示意图[49].
LOGAN等[50]将将SDT与化疗相结合作为乳腺癌的潜在治疗方法，测定了加载化疗药物紫杉醇和声敏剂RB的载氧微泡在人乳腺癌的三维球状模型和携带皮下MCF-7肿瘤的鼠模型中的功效.结果表明：用載药微泡和超声处理后球体的细胞活力和肿瘤体积均显著降低，协同治疗组的动物体重没有显著变化.
利用磁性纳米粒子作为载体或者在材料中掺入磁性元素，使复合材料具有MRI对比性能.GORGIZADEH等[51]合成了镍铁氧体/碳纳米复合材料（NiFe2O4/C），向声动力协同治疗组小鼠瘤内注射100 μg·mL-1的材料，结果表明：黑素瘤癌细胞受到损伤.该体系在1.5 T时，相应的横向弛豫率（r2）为78.9 mmol-1·L·s-1，证明合成的纳米复合材料可同时用于SDT和MRI. HUANG等[52]将卟啉锰负载到介孔有机硅纳米粒子中，制得的复合材料具有高的MRI性能，纵向弛豫率（r1）为9.43 mmol-1·L·s-1，能用于SDT监测.
SDT还可以与NIR-FLI相结合，NIR-FLI可以通过光谱分辨和对比增强技术实时监测体内超声敏感剂的分布，检测肿瘤.ZHENG等[53]用1，2-二氨基丙烷修饰HB以形成HB衍生物（APHB），再与聚乙丙交酯聚乙二醇（PEG-PLGA）自组装制得HB衍生物纳米粒子.制备的APHB纳米粒子（APHBNPs）在近红外区域表现出优异的水溶性，并且在超声刺激下产生ROS.
4 总结和展望
SDT能在无创条件下穿透较深的组织细胞，通过超声空化效应、氧化应激以及一系列生物效应，最终导致细胞凋亡.大量的研究结果表明：通过超声和声敏剂的协同效应，SDT成为一种可行的深度治疗实体瘤的方式，而且对动脉粥样硬化、白血病等疾病也具有治疗效果.SDT能够与UTMD、化疗、MRI、NIR-FLI等诊疗手段相结合，以期得到更好的治疗效果.
SDT在实际临床应用之前还有很多问题有待解决.研究最广泛的声敏剂是光敏剂，会引起严重的光毒性和不良副作用;另一些声敏剂是临床药物，如阿霉素和LVFX，若使用剂量较大，对正常细胞也有毒副作用.因此需要进行广泛的研究，以确认这些方法是否可以推进到临床测试，进一步确认治疗药物最合适的剂量、暴露时间、给药途径和频率.SDT的治疗效果还取决于超声装置，人骨和鼠骨的硬度差异，需要更强的超声波来穿透骨头和激活声敏剂，还需要稳定和非衰减的超声波保证治疗期间的能量稳态.
因此，现在对于SDT的一个重要研究方向是寻找毒性更小、清除率更高的声敏剂.用纳米材料负载传统声敏剂，通过特异性响应使其在肿瘤部位释放，以减少全身毒性，或者是开发新型的无机声敏剂.随着基础研究和临床实验的进一步展开，SDT会不断成熟，实际应用也将越来越广泛.
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（責任编辑：郁慧，包震宇）