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[摘要]目的：观察中波紫外线照射后HacaT细胞活力的变化并探讨水溶性四氮唑(wsT一1)法检测的适用性。方法：将HacaT细胞分为对照组(假照射组)、300J／m2、600J／m2、900J／m2紫外线照射后24h组(每组6个样本)。600J／m2紫外线照射后4h组、8h组、12h组、24h组、48h组、72h组(每组6个样本)。血球计数板计算HacaT细胞数量。四甲基偶氮唑盐(MTT)法和水溶性四氮唑(wsT-1)法活性测定HacaT细胞活性。结果：MTT法显示300J／m2、600J／m2、900J／m2紫外线照射HacaT细胞24h后光密度(OD)值明显较OJ／m2组低；wsT-1法各组OD值明显比0J／m2组低。MTT法显示600J／m。紫外线照射HacaT细胞8h、12h、24h、48h、72h后0D值明显比0J／m2组低。wsT-1法显示600J／m2紫外线照射HacaT细胞4h后OD值较OJ／m。组低；600J／m2紫外线照射HacaT细胞8h、12h、24h、48h、72h后OD值明显比0J／m2组低。wsT－1法的OD值与细胞计数、MTT法0D值呈正相关。结论：随着紫外线剂量的加大和照射后时间延长，HacaT细胞数量减少，细胞的活力下降，wsT－1代谢活性亦降低，呈时间和剂量依赖性。HacaT细胞可对wST一1进行代谢，适用于该细胞增殖研究。
[关键词]MTT法；水溶性四氮唑(wsT－1)法；中波紫外线；HacaT细胞
[中图分类号]Q813．1+1 [文献标识码]A [文章编号]1008—6455(2007)02－0162－04
传统检测细胞活力方法如MTT法，过程较复杂，而新的方法如水溶性四氮唑(WST-1)法较直接，但WST-1是否能对HaCaT细胞代谢，目前国内未见报道，为了证实WST一1法可适用于检测HaCaT细胞活力，本研究用MTT法和WST-1法检测中波紫外线照射HaCaT细胞后的活力，并进行比较，结果较满意，现报道如下。
1材料和方法
1．1主要试剂：四甲基氮唑盐(MTT)一Sigma：水溶性四氮唑(WST一1)试剂盒(Boehringer Mannheim公司)。
1．2细胞株：HaCaT细胞株(武汉细胞库)。
1．3主要仪器：紫外线灯(上海长兴机械厂，功率16W，波长为280～320hm，波峰值302nm)；紫外线强度检测仪(上海宝山顾村电光仪器厂)；BCM-100型超净工作台(苏州市苏净集团)。
1．4细胞计数方法
1．4．1将HaCaT细胞接种于24孔培养板中，接种细胞数为2×104个／孔，待细胞长至50％～60％铺满瓶底时，以PBS液置换培养基，给予不同剂量紫外线照射，照射完成后换为培养基，继续培养24h。另6组给予600J／m。紫外线照射，照射完成后换为培养基继续培养不同时间。
1．4．2加0．2ml胰酶消化，同时加0．1ml全血清灭活后用细胞计数器计算。加D-Hanks液0．8ml和0．3％台盼蓝0．1ml后，用滴管取混合均匀的细胞悬液适量滴入血球计数板，于低倍镜下计算四角四个大中格内活细胞数(即透明未着色者)，按公式(四大中格细胞数／4)×10。=细胞数／m1计算(每一中格体积为O．1inm3)。
1．5 MTT法活性测定HaCaT细胞活性
1．5．1将HaCaT细胞接种于96孔培养板，每孔5×103个细胞，倒置显微镜下观察，待细胞长至50％～60％铺满瓶底时，以PBS液置换培养基，给予不同剂量紫外线照射，照射完成后换为培养基，继续培养24h。另6组给予600J／m2紫外线照射，照射完成后换为培养基继续培养不同时间。
1．5．2去除细胞培养基，用PBS冲洗3次后，加入100ul含有lmg／mlMTT，继续培养4h，弃上清液，加二甲基亚砜溶解，振荡15min(300rpm／rain)，酶标仪490nm波长检测光密度(OD)值，即MTT检测值。
1、6 WST一1法活性测定HaCaT细胞活性：细胞培养同1．5．1。每孔加入即用型WST-1溶液10ul／孔，继续置37℃ 5％C02细胞培养箱孵育90min，取出培养板置振荡器上充分振荡(300rpm)lmin后在酶标仪450／630nm双波长检测光密度(0D)值，即WST—l检测值。每次实验均设一个空白对照组，对照孔吸光值应<0．01。
1．7数据统计分析：以SPSSll．5统计软件对实验数据进行统计分析，实验结果计量资料以(x±s)表示；组间显著性检验用One-way Annova分析，方差齐性时用LSD(1east significant difference，LSD)检验，方差不齐时用Tamhane’s检验；当P≤0．05时，差异有统计学意义。
2结果
2．1不同剂量紫外线照射对HaCaT细胞生长增殖和活性的影响：不同剂量紫外线照射HaCaT细胞24h后细胞计数，经One-way Annova分析，F=26．462，P 不同剂量的紫外线照射HaCaT细胞后不同时间MTT法0D值经One-way Annova分析，F=39．589，P 不同剂量的紫外线照射HaCaT细胞后不同时间WST-1法0D值经One-way Annova分析,F=5a 865，P
细胞计数、MTT法和WST-1法OD值的关系：细胞计数和MTT法OD值呈正相关(r=-O．776,P<0．001)。细胞计数和WST-J法OD值呈正相关(r=0．846，p＜001)。MTT法和WST-1法0D值呈正相关(r=0．825，P 2．2 600J／m2。紫外线照射HaCaT细胞后不同时间生长增殖和活性的变化
600J／m2紫外线照射HaCaT细胞不同时问细胞数经One—way Annova分析，F=24．598，P 600J／m。紫外线照射HaCaT细胞后不同时间MTT法OD值经One-way Annova分析，F=43．514，P<0．001，差异有统计学意义(见表2)。
600J／m2。紫外线照射HaCaT细胞后不同时间WST-1法0D值经0ne-way Annova分析，F=37．707，P<0．001，差异有统计学意义(见表2)。
细胞计数、MTT法和WST-1法OD值的关系：细胞计数和MTT法0D值呈正相关(r=0．851，P
3讨论
反映细胞增殖状况的指标有活细胞数量、DNA合成、细胞代谢活性和细胞周期等，其中最直接的指标是活细胞数量的变化。但细胞直接计数法操作繁琐费时，所需细胞量较多。四哇盐一MTT，XTT(2，3-bis(2-mathoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)一5一(phenylaminocarbonyl)-2H-tetrazol iumhydroxide)及WST-1等因其可在活细胞中裂解成有色的甲月替产物(formazan)而被用于细胞代谢活性的检测。与传统的MTT(其裂解产物为难溶结晶体)法相比，XTT和WST-1能直接产生水溶性的有色产物，具有更加敏感、方便、省时(仅需0．5-4h)的优点；而WST-1又比XTT稳定，可作即用型试剂。国外学者采用WST-1方法定量测定培养细胞的活性与增殖能力，证实了其方法的可靠性和简易性。WST-1的局限在于不能被所有细胞所代谢。本文研究结果表明，随着紫外线照射剂量增高和照射后时间延长，HaCaT细胞活细胞数量减少，其WST-1代谢活性亦降低，与MTT法呈正相关，说明HaCaT细胞可对WST-1进行代谢，因此适用于该细胞增殖研究。
(注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。)
[关键词]MTT法；水溶性四氮唑(wsT－1)法；中波紫外线；HacaT细胞
[中图分类号]Q813．1+1 [文献标识码]A [文章编号]1008—6455(2007)02－0162－04
传统检测细胞活力方法如MTT法，过程较复杂，而新的方法如水溶性四氮唑(WST-1)法较直接，但WST-1是否能对HaCaT细胞代谢，目前国内未见报道，为了证实WST一1法可适用于检测HaCaT细胞活力，本研究用MTT法和WST-1法检测中波紫外线照射HaCaT细胞后的活力，并进行比较，结果较满意，现报道如下。
1材料和方法
1．1主要试剂：四甲基氮唑盐(MTT)一Sigma：水溶性四氮唑(WST一1)试剂盒(Boehringer Mannheim公司)。
1．2细胞株：HaCaT细胞株(武汉细胞库)。
1．3主要仪器：紫外线灯(上海长兴机械厂，功率16W，波长为280～320hm，波峰值302nm)；紫外线强度检测仪(上海宝山顾村电光仪器厂)；BCM-100型超净工作台(苏州市苏净集团)。
1．4细胞计数方法
1．4．1将HaCaT细胞接种于24孔培养板中，接种细胞数为2×104个／孔，待细胞长至50％～60％铺满瓶底时，以PBS液置换培养基，给予不同剂量紫外线照射，照射完成后换为培养基，继续培养24h。另6组给予600J／m。紫外线照射，照射完成后换为培养基继续培养不同时间。
1．4．2加0．2ml胰酶消化，同时加0．1ml全血清灭活后用细胞计数器计算。加D-Hanks液0．8ml和0．3％台盼蓝0．1ml后，用滴管取混合均匀的细胞悬液适量滴入血球计数板，于低倍镜下计算四角四个大中格内活细胞数(即透明未着色者)，按公式(四大中格细胞数／4)×10。=细胞数／m1计算(每一中格体积为O．1inm3)。
1．5 MTT法活性测定HaCaT细胞活性
1．5．1将HaCaT细胞接种于96孔培养板，每孔5×103个细胞，倒置显微镜下观察，待细胞长至50％～60％铺满瓶底时，以PBS液置换培养基，给予不同剂量紫外线照射，照射完成后换为培养基，继续培养24h。另6组给予600J／m2紫外线照射，照射完成后换为培养基继续培养不同时间。
1．5．2去除细胞培养基，用PBS冲洗3次后，加入100ul含有lmg／mlMTT，继续培养4h，弃上清液，加二甲基亚砜溶解，振荡15min(300rpm／rain)，酶标仪490nm波长检测光密度(OD)值，即MTT检测值。
1、6 WST一1法活性测定HaCaT细胞活性：细胞培养同1．5．1。每孔加入即用型WST-1溶液10ul／孔，继续置37℃ 5％C02细胞培养箱孵育90min，取出培养板置振荡器上充分振荡(300rpm)lmin后在酶标仪450／630nm双波长检测光密度(0D)值，即WST—l检测值。每次实验均设一个空白对照组，对照孔吸光值应<0．01。
1．7数据统计分析：以SPSSll．5统计软件对实验数据进行统计分析，实验结果计量资料以(x±s)表示；组间显著性检验用One-way Annova分析，方差齐性时用LSD(1east significant difference，LSD)检验，方差不齐时用Tamhane’s检验；当P≤0．05时，差异有统计学意义。
2结果
2．1不同剂量紫外线照射对HaCaT细胞生长增殖和活性的影响：不同剂量紫外线照射HaCaT细胞24h后细胞计数，经One-way Annova分析，F=26．462，P
细胞计数、MTT法和WST-1法OD值的关系：细胞计数和MTT法OD值呈正相关(r=-O．776,P<0．001)。细胞计数和WST-J法OD值呈正相关(r=0．846，p＜001)。MTT法和WST-1法0D值呈正相关(r=0．825，P
600J／m2紫外线照射HaCaT细胞不同时问细胞数经One—way Annova分析，F=24．598，P
600J／m2。紫外线照射HaCaT细胞后不同时间WST-1法0D值经0ne-way Annova分析，F=37．707，P<0．001，差异有统计学意义(见表2)。
细胞计数、MTT法和WST-1法OD值的关系：细胞计数和MTT法0D值呈正相关(r=0．851，P
3讨论
反映细胞增殖状况的指标有活细胞数量、DNA合成、细胞代谢活性和细胞周期等，其中最直接的指标是活细胞数量的变化。但细胞直接计数法操作繁琐费时，所需细胞量较多。四哇盐一MTT，XTT(2，3-bis(2-mathoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)一5一(phenylaminocarbonyl)-2H-tetrazol iumhydroxide)及WST-1等因其可在活细胞中裂解成有色的甲月替产物(formazan)而被用于细胞代谢活性的检测。与传统的MTT(其裂解产物为难溶结晶体)法相比，XTT和WST-1能直接产生水溶性的有色产物，具有更加敏感、方便、省时(仅需0．5-4h)的优点；而WST-1又比XTT稳定，可作即用型试剂。国外学者采用WST-1方法定量测定培养细胞的活性与增殖能力，证实了其方法的可靠性和简易性。WST-1的局限在于不能被所有细胞所代谢。本文研究结果表明，随着紫外线照射剂量增高和照射后时间延长，HaCaT细胞活细胞数量减少，其WST-1代谢活性亦降低，与MTT法呈正相关，说明HaCaT细胞可对WST-1进行代谢，因此适用于该细胞增殖研究。
(注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。)