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[摘 要]单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria.monocytogenes）是一种重要的食源性致病菌，对人类的安全具有危险性。在近几年市场抽检中，单增李斯特菌检出率逐年增加，且检出品种范围也在不断扩大。本文通过对牛板筋中单增李斯特菌检测的微生物法、全自动微生物鉴定仪法和荧光PCR法等三种方法进行研究，得出结论：三种方法结果具有较高一致性，其中荧光PCR法快速、高效，在食品安全抽检和监测工作中值得应用和推广。
[关键词]单增李斯特菌；牛板筋；检测方法；检出率
中图分类号：T62 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2018）46-0077-01
1材料和方法（实验部分）
1.1实验材料：
近几年委托、监督、国抽送检的牛板筋肉制品。
1.2试剂与仪器
1.2.1标准菌：单核细胞增生李斯特氏菌ATCC19115；英诺克李斯特氏菌ATCC33090；伊氏李斯特氏菌ATCC19119；斯氏李斯特氏菌ATCC35967；金黄色葡萄球菌ATCC25923；马红球菌ATCC6939；阪崎肠杆菌ATCC25944；肠炎沙门氏菌ATCC14082；大肠埃希氏菌ATCC25922； 志贺氏菌ATCC51572；铜绿假单胞菌ATCC27853均由本中心微生物实验室保存。
1.2.2培养基和试剂；LB（LB1、LB2青岛海博）、PALCAM（青岛海博）、李斯特显色培养基（青岛海博）、科马嘉李斯特显色培养基（上海申工）、TSA-YE（青岛海博）、血平板（青岛海博）、多种微量生化鉴定管、GP（革兰式阳性）鉴定卡（法国生物梅里埃公司）、DNA提取试剂盒、PCR试剂均购自大连宝生物工程有限公司
1.3试验方法
1.3.1传统微生物法：
1.3.1.1增菌分离；抽样和送样按照GB4789.1-2010GB29921-2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》二级采样，n=5，c=0，m=0，检测方法按照GB4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》进行。
1.3.1.2初筛：挑取现色板上典型或可疑菌落接种木糖、鼠李糖，并同时划线TSA-YE平板，36℃，18 h-24 h培养，然后选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物进行鉴定。
1.3.1.3生化鉴定：染色镜检、动力试验、生化鉴定、溶血试验、协同溶血试验均按照GB4789.30-2016执行并结果判定。
1.3.2全自动微生物鉴定仪法：制备0.6左右麦氏浓度菌悬液（TSA-YE平板上菌落），GP鉴定卡，上机测试。结果查对VITEK2鉴定细菌目录。
1.3.3.实时荧光PCR法：
1.3.3.1模板DNA的制备（两种）
1.3.3.1.1利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）TIANGEN生化科技（北京）有限公司，吸取1.5 ml LB1增菌液至2 ml EP管中，离心，弃上清液，若沉淀量少，再次吸取1.5 ml LB1增菌液，离心，弃上清液，以下步骤按照产品说明书进行提取，核酸蛋白分析仪测定DNA含量，OD260/280值在1.8-2.0间，且核酸浓度得量在30-50 ng/μL最为适宜PCR扩增。浓度若高，需稀释。
1.3.3.1.2水煮裂解法（菌落PCR）
取TSA-YE上菌落，制成2.0麦氏浓度菌悬液，取1.5 ml至2.0 mlEP管中，12000r/min离心5 min，弃上清，加50 μl灭菌ddH2O或TE溶液，旋涡震荡混匀，置小型恒温槽70℃加热10 min， -20℃保存备用（以上操作均在P2实验室进行）。
1.3.3.2引物、探针的设计和合成
根据SN/T 1870-2007《食品中致病菌检测方法 实时PCR法》中公布的单核细胞增生李斯特氏菌检测所用引物和探针序列，委托大连宝生物工程有限公司合成。
2结果与讨论
2.1结果
我中心自2012年开展生肉制品单增李斯特菌检测，近几年加大检测范围，餐饮食品凉拌菜、熟肉制品也增加了此项目检测，检出率逐年增加，尤其牛板筋中检出率最高。
2015年牛板筋检测数量占单增李斯特菌总检测样品数量的27.8%，而检出率占总阳性率11.1%中一半，即5.55%为牛板筋，如此，2016年的10.7%的三分之二，即7.13%为牛板筋，2017年的12.5%的五分之三，即7.5%，即相对阳性率也是增加的。
本实验室为国家级实验室，一般情况下试验方法选择为国家标准方法，即GB4789.30-2016微生物法。三年来，对三种检测方法得出数据进行了比对分析，一是检测过程中将典型菌落全部进行生化鉴定的同时，也进行全自动微生物鉴定仪鉴定和荧光PCR测定；二是选取部分不典型菌落（共5个批次）进行生化鉴定、全自动微生物鉴定仪鉴定和荧光PCR测定。可以看出：三种鉴定方法结果一致，均准确可信；荧光PCR与传统微生物方法相比，其操作簡便、准确快速、高通量、高敏感，将会对食品市场抽检监测提供更加准确、快速、高效的技术检测服务。
荧光PCR法耗时最少，在时间上占绝对优势。其他方法所需的设备、设施、人力等资源条件都可以通过资金投入和人员引进培训来满足，达到完成试验任务的目的。而时间是有限的，不可再生，在高速发展的今天，满足服务食品产业发展和食品安全监管的需求，荧光PCR法耗时少的优势是无可替代的。
2.2讨论：
2.2.1牛板筋检出单增李斯特菌的阳性率相当高，且呈逐年上升趋势，检出阳性菌均及时上报有关部门。
2.2.2生化鉴定中GB4789.30 5.4.5规定协同溶血试验为可选检测项目，依据笔者多年试验经验，溶血试验有时结果不明显。为保证检测数据的准确性和可靠性，以及对客户负责的态度，溶血试验和协同溶血试验应同时进行，并进行结果参照。
2.2.3因宁夏属西北欠发达地区，食品生产加工企业数量少、规模小，有的质量安全意识不强，质量保证条件较差。三年来检测的牛板筋共20个批次，100份样品，从批次上看，检测样品虽不具有普遍性，但仍发现同一生产厂家不同批次的产品受到单增李斯特菌污染，说明有的生产企业在加工、储存、运输等环节质量控制不严格，从而导致微生物污染，带来食品安全隐患。因此，加强对此类食品及其原料的市场抽检监测，预防食品安全事故发生，显得尤为重要。
3结论
三年来共检测牛板筋中单增李斯特菌20个批次的样品，即100份样品（使用传统微生物法），其中阳性样品6个批次，30份样品（同时全自动微生物鉴定仪法、荧光PCR法），阴性样品5个批次，25份样品（同时全自动微生物鉴定仪法、荧光PCR法）。通过对单增李斯特氏菌微生物法、全自动微生物鉴定仪法、荧光PCR法三种检测方法的比对分析，得出结论：三种方法结果一致，荧光PCR法是比较快速、高效的方法，将会对食品市场抽检监测提供更加有力的技术支撑。
参考文献
[1]陈广全 张惠媛 曾静等.食品安全检测培训教材 微生物检测.北京：中国标准出版社，2010：366.
[2]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布.食品安全国家标准 食品中致病菌限量：GB 29921-2013[S]北京：中国标准出版社，2013：1-5
作者简介：贾冰凝（1968-），女，宁夏吴忠人，高级工程师，研究方向：食品微生物检测及动物源性成分分析。
[关键词]单增李斯特菌；牛板筋；检测方法；检出率
中图分类号：T62 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2018）46-0077-01
1材料和方法（实验部分）
1.1实验材料：
近几年委托、监督、国抽送检的牛板筋肉制品。
1.2试剂与仪器
1.2.1标准菌：单核细胞增生李斯特氏菌ATCC19115；英诺克李斯特氏菌ATCC33090；伊氏李斯特氏菌ATCC19119；斯氏李斯特氏菌ATCC35967；金黄色葡萄球菌ATCC25923；马红球菌ATCC6939；阪崎肠杆菌ATCC25944；肠炎沙门氏菌ATCC14082；大肠埃希氏菌ATCC25922； 志贺氏菌ATCC51572；铜绿假单胞菌ATCC27853均由本中心微生物实验室保存。
1.2.2培养基和试剂；LB（LB1、LB2青岛海博）、PALCAM（青岛海博）、李斯特显色培养基（青岛海博）、科马嘉李斯特显色培养基（上海申工）、TSA-YE（青岛海博）、血平板（青岛海博）、多种微量生化鉴定管、GP（革兰式阳性）鉴定卡（法国生物梅里埃公司）、DNA提取试剂盒、PCR试剂均购自大连宝生物工程有限公司
1.3试验方法
1.3.1传统微生物法：
1.3.1.1增菌分离；抽样和送样按照GB4789.1-2010GB29921-2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》二级采样，n=5，c=0，m=0，检测方法按照GB4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》进行。
1.3.1.2初筛：挑取现色板上典型或可疑菌落接种木糖、鼠李糖，并同时划线TSA-YE平板，36℃，18 h-24 h培养，然后选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物进行鉴定。
1.3.1.3生化鉴定：染色镜检、动力试验、生化鉴定、溶血试验、协同溶血试验均按照GB4789.30-2016执行并结果判定。
1.3.2全自动微生物鉴定仪法：制备0.6左右麦氏浓度菌悬液（TSA-YE平板上菌落），GP鉴定卡，上机测试。结果查对VITEK2鉴定细菌目录。
1.3.3.实时荧光PCR法：
1.3.3.1模板DNA的制备（两种）
1.3.3.1.1利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）TIANGEN生化科技（北京）有限公司，吸取1.5 ml LB1增菌液至2 ml EP管中，离心，弃上清液，若沉淀量少，再次吸取1.5 ml LB1增菌液，离心，弃上清液，以下步骤按照产品说明书进行提取，核酸蛋白分析仪测定DNA含量，OD260/280值在1.8-2.0间，且核酸浓度得量在30-50 ng/μL最为适宜PCR扩增。浓度若高，需稀释。
1.3.3.1.2水煮裂解法（菌落PCR）
取TSA-YE上菌落，制成2.0麦氏浓度菌悬液，取1.5 ml至2.0 mlEP管中，12000r/min离心5 min，弃上清，加50 μl灭菌ddH2O或TE溶液，旋涡震荡混匀，置小型恒温槽70℃加热10 min， -20℃保存备用（以上操作均在P2实验室进行）。
1.3.3.2引物、探针的设计和合成
根据SN/T 1870-2007《食品中致病菌检测方法 实时PCR法》中公布的单核细胞增生李斯特氏菌检测所用引物和探针序列，委托大连宝生物工程有限公司合成。
2结果与讨论
2.1结果
我中心自2012年开展生肉制品单增李斯特菌检测，近几年加大检测范围，餐饮食品凉拌菜、熟肉制品也增加了此项目检测，检出率逐年增加，尤其牛板筋中检出率最高。
2015年牛板筋检测数量占单增李斯特菌总检测样品数量的27.8%，而检出率占总阳性率11.1%中一半，即5.55%为牛板筋，如此，2016年的10.7%的三分之二，即7.13%为牛板筋，2017年的12.5%的五分之三，即7.5%，即相对阳性率也是增加的。
本实验室为国家级实验室，一般情况下试验方法选择为国家标准方法，即GB4789.30-2016微生物法。三年来，对三种检测方法得出数据进行了比对分析，一是检测过程中将典型菌落全部进行生化鉴定的同时，也进行全自动微生物鉴定仪鉴定和荧光PCR测定；二是选取部分不典型菌落（共5个批次）进行生化鉴定、全自动微生物鉴定仪鉴定和荧光PCR测定。可以看出：三种鉴定方法结果一致，均准确可信；荧光PCR与传统微生物方法相比，其操作簡便、准确快速、高通量、高敏感，将会对食品市场抽检监测提供更加准确、快速、高效的技术检测服务。
荧光PCR法耗时最少，在时间上占绝对优势。其他方法所需的设备、设施、人力等资源条件都可以通过资金投入和人员引进培训来满足，达到完成试验任务的目的。而时间是有限的，不可再生，在高速发展的今天，满足服务食品产业发展和食品安全监管的需求，荧光PCR法耗时少的优势是无可替代的。
2.2讨论：
2.2.1牛板筋检出单增李斯特菌的阳性率相当高，且呈逐年上升趋势，检出阳性菌均及时上报有关部门。
2.2.2生化鉴定中GB4789.30 5.4.5规定协同溶血试验为可选检测项目，依据笔者多年试验经验，溶血试验有时结果不明显。为保证检测数据的准确性和可靠性，以及对客户负责的态度，溶血试验和协同溶血试验应同时进行，并进行结果参照。
2.2.3因宁夏属西北欠发达地区，食品生产加工企业数量少、规模小，有的质量安全意识不强，质量保证条件较差。三年来检测的牛板筋共20个批次，100份样品，从批次上看，检测样品虽不具有普遍性，但仍发现同一生产厂家不同批次的产品受到单增李斯特菌污染，说明有的生产企业在加工、储存、运输等环节质量控制不严格，从而导致微生物污染，带来食品安全隐患。因此，加强对此类食品及其原料的市场抽检监测，预防食品安全事故发生，显得尤为重要。
3结论
三年来共检测牛板筋中单增李斯特菌20个批次的样品，即100份样品（使用传统微生物法），其中阳性样品6个批次，30份样品（同时全自动微生物鉴定仪法、荧光PCR法），阴性样品5个批次，25份样品（同时全自动微生物鉴定仪法、荧光PCR法）。通过对单增李斯特氏菌微生物法、全自动微生物鉴定仪法、荧光PCR法三种检测方法的比对分析，得出结论：三种方法结果一致，荧光PCR法是比较快速、高效的方法，将会对食品市场抽检监测提供更加有力的技术支撑。
参考文献
[1]陈广全 张惠媛 曾静等.食品安全检测培训教材 微生物检测.北京：中国标准出版社，2010：366.
[2]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布.食品安全国家标准 食品中致病菌限量：GB 29921-2013[S]北京：中国标准出版社，2013：1-5
作者简介：贾冰凝（1968-），女，宁夏吴忠人，高级工程师，研究方向：食品微生物检测及动物源性成分分析。