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摘要：目的 观察雄黄对雄性成年大鼠精子质量的影响。方法 利用部分雄黄灌胃给药生殖毒性Ⅰ段试验雄性大鼠进行精子质量分析。将SD雄性大鼠50只随机分为阴性对照组、阳性对照雷公藤多苷组（10 mg/kg）及雄黄低、中、高剂量组（50、125、250 mg/kg）。各给药组连续灌胃给予相应药物6周，每日1次。给药结束后，取大鼠一侧附睾用计算机辅助精子分析系统（CASA）做精子的数量、活力、运动能力检查，并取睾丸、附睾做HE染色，观察组织病理学变化。结果 阳性对照雷公藤多苷组精子活率、精子活力、有效精子数、精子密度及各项运动参数（除鞭打频率外）均明显低于阴性对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。雄黄各剂量组精子活率、活力、有效精子数、精子密度及各项运动参数与阴性对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），且各剂量组间差异亦无统计学意义（P>0.05）。组织病理学观察显示，阳性对照雷公藤多苷组的睾丸局部生精小管萎缩，生精细胞减少，附睾管腔内可见大量降解的生精细胞及细胞碎片，精子细胞减少，静纤毛缩短。雄黄高剂量组附睾、睾丸未见明显组织学病理改变。结论 雄黄对雄性大鼠的精子没有明显的毒性作用。
关键词：雄黄；生殖毒性；计算机辅助精子分析；精子质量；运动参数；精子活力；雄性大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）07-0037-03
精子的活力和运动特性是反映精子质量的重要参数，是雄性生殖毒性研究的观察指标之一。对精子的运动、密度、活力等进行客观、定量、准确的测定在雄性生殖毒理研究中具有十分重要的意义。在人用药物注册技术要求国际协调会准则（ICH）和我国的《药物生殖毒性研究技术指导原则》[1-2]中均将精子数和精子活力检查列为生育力与早期胚胎发育毒性试验（即生殖毒性Ⅰ段）的检测指标。计算机辅助精子分析仪（computer assisted sperm analysis，CASA）是一种建立在显微摄像基础上的计算机精子运动图像处理自动分析系统，可自动得到精子密度、活力、活率，并能对精子的运动轨迹特征进行分析和分类统计，主要应用在医学上男性精子质量分析中[3]。雄黄是卫生部颁布的28种毒性药材之一，其主要成分为四硫化四砷[4]。我国含雄黄的复方制剂较多，这些复方在治疗某些病症方面具有独特的效果，然而，作为含砷矿物类中药，雄黄及其复方的安全性问题近年来倍受关注[5]。因此，为了安全、合理使用雄黄及其复方制剂，尽可能减少毒性反应的发生，本研究利用雄黄灌胃给药生殖毒性Ⅰ段试验，采用CASA系统定量分析精子质量，并结合组织病理学检查来观察雄黄对雄性大鼠生育力的影响。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级SD雄性大鼠，体质量（189±8.0）g，为进行生殖毒性Ⅰ段试验的雄性大鼠，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2008-0016。
1.2 药物
雄黄饮片，产地湖南石门雄黄矿业，上海封浜中药饮片厂加工炮制成饮片，批号H2007052401，上海市食品药品检定所提供，经测定二硫化二砷含量为95.5%。灌胃前雄黄用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）稀释助溶助悬。雷公藤多苷片，批号Z32021007，江苏美通制药有限公司生产，研成粉末溶于生理盐水中，配制成1.0 mg/mL的混悬液。
1.3 主要仪器与试剂
CASA，型号：WLJY-9000，北京伟力新世纪科技发展有限公司生产。大鼠专用精子计数池，恒温水浴锅，精子获能培养液。
2 实验方法
2.1 动物饲养
动物饲养在上海中医药大学实验中心屏障环境，使用许可证号：SYXK（沪） 2009-0069。动物自由摄食、饮水，1～2 d换水1次，每周换2次垫料。饲养期间实际温度控制在20～25 ℃，湿度控制在40%～70%，明暗周期12 h/12 h。
2.2 分组与给药
2.3 制备精子悬液
采用Klinefelter扩散法[6]收集精子，分离一侧附睾尾，用眼科剪在附睾尾部近输精管端剪十字切口，放入37 ℃预温的盛有4 mL获能培养液的5 mL离心管中15 min，让精子自由游出，检测前用尖头镊子移出残余组织及未充分扩散的精子块。
2.4 精子质量分析
吸取10 ?L精子悬液至大鼠专用精子计数池，将计数板置于37 ℃预温好的显微镜载物台上，采用WLJY-9000型CASA测定精子质量。于10×物镜下通过摄像机和录像机记录精子运动图像，分析精子的运动轨迹。每个样品分析5个视野，每个视野10～15 s。测定参数包括精子活率、精子活力、有效精子数、精子密度、直线运动速度（VSL）、曲线运动速度（VCL）、平均路径速度（VAP）、精子头侧摆幅度（ALH）、平均移动角度（MAD）、鞭打频率（BCF）、直线性（LIN）、摆动性（WOB）和前向性（STR）等13项指标。
2.5 组织病理学检查
分离大鼠一侧睾丸、附睾，10%甲醛溶液固定，做HE染色。
2.6 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析，所有计量数据均以—x±s表示，采用方差分析进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。
3.2 大鼠睾丸和附睾组织病理学观察
4 讨论
药物的生殖毒性包括其对生殖细胞、交配、受孕等亲代生殖机能及子代胚胎-胎仔发育等不良影响，其中精子质量直接影响雄性的生育力，可以反映药物对雄性生育力的影响，因此精子质量检测是判断雄性生育力的一个比较重要指标。以往精子质量分析采用人工计数和肉眼观察精子形态和活力的方法，检测结果差异较大、重复性差。随着计算机技术的发展，CASA因其客观真实、检测速度快、检测指标多等优点，逐渐替代了人工方法。CASA不仅能够测定精子的活率、活力、密度和有效精子数，还可以测定9个运动参数，分析精子的运动轨迹，从而更加详细地了解精子的动力学状态。从生殖生理学角度来看，贮存在附睾尾的精子通过射精进入阴道、子宫，最后到达输卵管并完成和卵子的结合，这期间都需要精子具有运动能力，特别是快速直线向前运动的能力[8]。其中VCL、VSL、VAP和BCF反映了精子的运动速度，与精子的活力相关[9]，LIN、WOB、MAD、ALH和STR等参数与精子的运动方式相关，反映了精子运动的直线性和前向性[10]。通过分析精子动（静）态图像，为临床提供有关精子质量各项指标的准确数据[11]。 本实验应用CASA对雄黄灌胃给药生殖毒性Ⅰ段试验的雄性大鼠进行精子质量分析，结合大鼠睾丸、附睾的组织病理学及生殖毒性Ⅰ段试验的结果等方面来探讨雄黄对雄性大鼠精子质量的影响。雷公藤多苷具有抗炎及抑制细胞和体液免疫等作用，临床上用于风湿热瘀、毒邪阻滞所致的类风湿性关节炎、肾病综合征等，但其具有抗雄性生育活性[12]的不良反应，在本试验中用作阳性对照。我们发现，雷公藤多苷10 mg/（kg·d）灌胃6周后，用CASA分析的大鼠精子各项指标（除BCF外）均显著降低，与阴性对照组比较差异有统计学意义。为了进一步验证雄黄对雄性大鼠精子生长、成熟的影响，我们对各组大鼠做了睾丸和附睾的组织病理学检查，发现雄黄高剂量组大鼠睾丸、附睾未见明显的病理改变，提示雄黄对大鼠精子的生长、成熟没有影响。而雷公藤多苷组的大鼠睾丸、附睾有不同程度的病理改变，睾丸局部的生精小管萎缩，生精细胞减少，附睾管腔内脱落细胞及细胞碎片增多，精子细胞减少，说明雷公藤多苷明显影响大鼠精子的生长、成熟及运动，这与CASA分析的精子活力、运动参数等检测数据是基本吻合的，表明CASA可以准确、客观地了解精子质量的真实情况，作为药物对雄性生殖毒性影响评价的客观依据。
参考文献：
[1] Detection of toxicity to reproduction for medicinal products & toxicity to male fertility S5（R2）[S]. ICH harmonized tripartite guideline，2005：11.
[2] 国家食品药品监督管理局.药物生殖毒性研究技术指导原则[S].2006：11.
[3] 韦凌娅，吕中明，王民生.计算机辅助精子分析系统在大鼠精子运动能力测定中的应用[J].环境与职业医学，2007，24（6）：596-598.
[4] 张志杰，周群，尉京志，等.我国药用雄黄的晶体结构鉴定[J].光谱学与光谱分析，2011，31（2）：291-296.
[5] 周超凡，林育华.传统中药雄黄应用概况及其安全性[J].药物不良反应杂志，2008，10（2）：104-109.
[6] Zhou YC， Zheng M， Shi QX， et al. An epididymis-specific secretory protein hongrES1 critically regulates sperm capacitation and male fertility[J]. PLoS ONE，2008，3（12）：1-12.
[7] Klinefelter GR， Gray LE Jr， Suarez JD. The method of sperm collection significantly influences sperm motion parameters following ethane dimethane sulphonate administration in the rat[J]. Reprod Toxicol，1991，5：39-44.
[8] Donnelly ET， Lewis SE， Mc Nally JA， et al. In vitro fertilization and pregnancy rates：the influence of sperm motility and morphology on IV Foutcome[J]. Fertil，1998，70（2）：305.
[9] 吴齐飞，邢俊平，薛炜，等.计算机辅助精液分析男性不育患者精子运动参数与精子活力的相关性[J].现代泌尿外科杂志，2007，12（3）：182-184.
[10] 王红旗，郭远瑜，雷和月，等.杭州市萧山区不育患者精液质量及动态参数分析[J].中国男科学杂志，2010，24（5）：33-36.
[11] Takashi Kawaguchi， Mamoru kawachi， Makoto Morikawa， et al. Key parameters of sperm motion in relation to male fertility in rats given α-chlorohydrin or nitrobenzene[J]. The Journal of Toxicological Sciences，2004，29（3）：217-231.
[10] 王诗鸿.雷公藤抗雄性生育作用研究进展[J].时珍国医国药，2005， 16（11）：1165-1167.
[12] 王诗鸿.雷公藤抗雄性生育作用研究进展[J].时珍国医国药，2005， 16（11）：1165-1167.
（收稿日期：2011-12-30，编辑：华强）
关键词：雄黄；生殖毒性；计算机辅助精子分析；精子质量；运动参数；精子活力；雄性大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）07-0037-03
精子的活力和运动特性是反映精子质量的重要参数，是雄性生殖毒性研究的观察指标之一。对精子的运动、密度、活力等进行客观、定量、准确的测定在雄性生殖毒理研究中具有十分重要的意义。在人用药物注册技术要求国际协调会准则（ICH）和我国的《药物生殖毒性研究技术指导原则》[1-2]中均将精子数和精子活力检查列为生育力与早期胚胎发育毒性试验（即生殖毒性Ⅰ段）的检测指标。计算机辅助精子分析仪（computer assisted sperm analysis，CASA）是一种建立在显微摄像基础上的计算机精子运动图像处理自动分析系统，可自动得到精子密度、活力、活率，并能对精子的运动轨迹特征进行分析和分类统计，主要应用在医学上男性精子质量分析中[3]。雄黄是卫生部颁布的28种毒性药材之一，其主要成分为四硫化四砷[4]。我国含雄黄的复方制剂较多，这些复方在治疗某些病症方面具有独特的效果，然而，作为含砷矿物类中药，雄黄及其复方的安全性问题近年来倍受关注[5]。因此，为了安全、合理使用雄黄及其复方制剂，尽可能减少毒性反应的发生，本研究利用雄黄灌胃给药生殖毒性Ⅰ段试验，采用CASA系统定量分析精子质量，并结合组织病理学检查来观察雄黄对雄性大鼠生育力的影响。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级SD雄性大鼠，体质量（189±8.0）g，为进行生殖毒性Ⅰ段试验的雄性大鼠，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2008-0016。
1.2 药物
雄黄饮片，产地湖南石门雄黄矿业，上海封浜中药饮片厂加工炮制成饮片，批号H2007052401，上海市食品药品检定所提供，经测定二硫化二砷含量为95.5%。灌胃前雄黄用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）稀释助溶助悬。雷公藤多苷片，批号Z32021007，江苏美通制药有限公司生产，研成粉末溶于生理盐水中，配制成1.0 mg/mL的混悬液。
1.3 主要仪器与试剂
CASA，型号：WLJY-9000，北京伟力新世纪科技发展有限公司生产。大鼠专用精子计数池，恒温水浴锅，精子获能培养液。
2 实验方法
2.1 动物饲养
动物饲养在上海中医药大学实验中心屏障环境，使用许可证号：SYXK（沪） 2009-0069。动物自由摄食、饮水，1～2 d换水1次，每周换2次垫料。饲养期间实际温度控制在20～25 ℃，湿度控制在40%～70%，明暗周期12 h/12 h。
2.2 分组与给药
2.3 制备精子悬液
采用Klinefelter扩散法[6]收集精子，分离一侧附睾尾，用眼科剪在附睾尾部近输精管端剪十字切口，放入37 ℃预温的盛有4 mL获能培养液的5 mL离心管中15 min，让精子自由游出，检测前用尖头镊子移出残余组织及未充分扩散的精子块。
2.4 精子质量分析
吸取10 ?L精子悬液至大鼠专用精子计数池，将计数板置于37 ℃预温好的显微镜载物台上，采用WLJY-9000型CASA测定精子质量。于10×物镜下通过摄像机和录像机记录精子运动图像，分析精子的运动轨迹。每个样品分析5个视野，每个视野10～15 s。测定参数包括精子活率、精子活力、有效精子数、精子密度、直线运动速度（VSL）、曲线运动速度（VCL）、平均路径速度（VAP）、精子头侧摆幅度（ALH）、平均移动角度（MAD）、鞭打频率（BCF）、直线性（LIN）、摆动性（WOB）和前向性（STR）等13项指标。
2.5 组织病理学检查
分离大鼠一侧睾丸、附睾，10%甲醛溶液固定，做HE染色。
2.6 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析，所有计量数据均以—x±s表示，采用方差分析进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。
3.2 大鼠睾丸和附睾组织病理学观察
4 讨论
药物的生殖毒性包括其对生殖细胞、交配、受孕等亲代生殖机能及子代胚胎-胎仔发育等不良影响，其中精子质量直接影响雄性的生育力，可以反映药物对雄性生育力的影响，因此精子质量检测是判断雄性生育力的一个比较重要指标。以往精子质量分析采用人工计数和肉眼观察精子形态和活力的方法，检测结果差异较大、重复性差。随着计算机技术的发展，CASA因其客观真实、检测速度快、检测指标多等优点，逐渐替代了人工方法。CASA不仅能够测定精子的活率、活力、密度和有效精子数，还可以测定9个运动参数，分析精子的运动轨迹，从而更加详细地了解精子的动力学状态。从生殖生理学角度来看，贮存在附睾尾的精子通过射精进入阴道、子宫，最后到达输卵管并完成和卵子的结合，这期间都需要精子具有运动能力，特别是快速直线向前运动的能力[8]。其中VCL、VSL、VAP和BCF反映了精子的运动速度，与精子的活力相关[9]，LIN、WOB、MAD、ALH和STR等参数与精子的运动方式相关，反映了精子运动的直线性和前向性[10]。通过分析精子动（静）态图像，为临床提供有关精子质量各项指标的准确数据[11]。 本实验应用CASA对雄黄灌胃给药生殖毒性Ⅰ段试验的雄性大鼠进行精子质量分析，结合大鼠睾丸、附睾的组织病理学及生殖毒性Ⅰ段试验的结果等方面来探讨雄黄对雄性大鼠精子质量的影响。雷公藤多苷具有抗炎及抑制细胞和体液免疫等作用，临床上用于风湿热瘀、毒邪阻滞所致的类风湿性关节炎、肾病综合征等，但其具有抗雄性生育活性[12]的不良反应，在本试验中用作阳性对照。我们发现，雷公藤多苷10 mg/（kg·d）灌胃6周后，用CASA分析的大鼠精子各项指标（除BCF外）均显著降低，与阴性对照组比较差异有统计学意义。为了进一步验证雄黄对雄性大鼠精子生长、成熟的影响，我们对各组大鼠做了睾丸和附睾的组织病理学检查，发现雄黄高剂量组大鼠睾丸、附睾未见明显的病理改变，提示雄黄对大鼠精子的生长、成熟没有影响。而雷公藤多苷组的大鼠睾丸、附睾有不同程度的病理改变，睾丸局部的生精小管萎缩，生精细胞减少，附睾管腔内脱落细胞及细胞碎片增多，精子细胞减少，说明雷公藤多苷明显影响大鼠精子的生长、成熟及运动，这与CASA分析的精子活力、运动参数等检测数据是基本吻合的，表明CASA可以准确、客观地了解精子质量的真实情况，作为药物对雄性生殖毒性影响评价的客观依据。
参考文献：
[1] Detection of toxicity to reproduction for medicinal products & toxicity to male fertility S5（R2）[S]. ICH harmonized tripartite guideline，2005：11.
[2] 国家食品药品监督管理局.药物生殖毒性研究技术指导原则[S].2006：11.
[3] 韦凌娅，吕中明，王民生.计算机辅助精子分析系统在大鼠精子运动能力测定中的应用[J].环境与职业医学，2007，24（6）：596-598.
[4] 张志杰，周群，尉京志，等.我国药用雄黄的晶体结构鉴定[J].光谱学与光谱分析，2011，31（2）：291-296.
[5] 周超凡，林育华.传统中药雄黄应用概况及其安全性[J].药物不良反应杂志，2008，10（2）：104-109.
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[8] Donnelly ET， Lewis SE， Mc Nally JA， et al. In vitro fertilization and pregnancy rates：the influence of sperm motility and morphology on IV Foutcome[J]. Fertil，1998，70（2）：305.
[9] 吴齐飞，邢俊平，薛炜，等.计算机辅助精液分析男性不育患者精子运动参数与精子活力的相关性[J].现代泌尿外科杂志，2007，12（3）：182-184.
[10] 王红旗，郭远瑜，雷和月，等.杭州市萧山区不育患者精液质量及动态参数分析[J].中国男科学杂志，2010，24（5）：33-36.
[11] Takashi Kawaguchi， Mamoru kawachi， Makoto Morikawa， et al. Key parameters of sperm motion in relation to male fertility in rats given α-chlorohydrin or nitrobenzene[J]. The Journal of Toxicological Sciences，2004，29（3）：217-231.
[10] 王诗鸿.雷公藤抗雄性生育作用研究进展[J].时珍国医国药，2005， 16（11）：1165-1167.
[12] 王诗鸿.雷公藤抗雄性生育作用研究进展[J].时珍国医国药，2005， 16（11）：1165-1167.
（收稿日期：2011-12-30，编辑：华强）