论文部分内容阅读
摘要目的：建立护肝颗粒中槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法测定护肝颗粒中槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量，色谱柱Hedera ODS2柱（46 mm×200 mm，5 μm），流动相为甲醇04%磷酸，梯度洗脱，流速1 mL/min，检测波长360 nm，柱温为35 ℃。结果：槲皮素、山柰素、异鼠李素分别在00768～192 μg，002004～0501 μg，0021～0525 μg范围内进样量与峰面积积分值线性关系良好，r分别为09999、09998、09999，加样回收率分别为974%、981%、979%，RSD分别为14%、18%、13%。结论：该方法准确、稳定，可以用来同时测定护肝颗粒中槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量。
关键词护肝颗粒；HPLC；槲皮素；山柰素；异鼠李素
AbstractObjective：To develop method for detetmining uercetin，Kaempferide and Isorhamnetin in Hugan granules by HPLC.Methods：HPLC was used for the determination of uercetin，Kaempferide and Isorhamnetin.The column was set as Hedera ODS2 （46 mm×200 mm，5 μm）.The mobile phase was methanol04% phosphoric acid，and the gradient elution was used.The detection wavelength was set at 360 nm and the flow rate was 10 mL·minResults：uercetin，Kaempferide and Isorhamnetin showed a good linear relationship in the range of 00768～192 μg（r=09999），002004～0501 μg（r=09998） and 0021～0525 μg （r=09999）.The average recovery of uercetin was 981% with RSD of 14%，the average recovery of Kaempferide was 981 % with RSD of 18%，and the average recovery of Isorhamnetin was 979 % with RSD of 13%.Conclusion：The method is accurate and stable，which can be used for the determination of uercetin，Kaempferide and Isorhamnetin in Hugan granules.
Key WordsHugan granules； HPLC； Uercetin； Kaempferide； Isorhamnetin
中图分类号：R2841文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.049
护肝颗粒由垂盆草、虎杖、茵陈、黄柏、金钱草等七味中药组成，是根据我院名中医长期的临床经验方制备而成的复方中药制剂。具有清热利湿、益肝化瘀、疏肝止痛的功效，临床常用于治疗急慢性肝炎，疗效确切。处方中君药垂盆草具有清热解毒、清热利湿的功效，是本制剂发挥其保肝降酶临床疗效的重要组成部分，化学成分研究表明，垂盆草中主要有效成分是以槲皮素、山柰素、异鼠李素等为代表的各种黄酮类成分及蛋白质、氨基酸、糖类、皂苷类、生物碱类和氰苷类等成分[12]。护肝颗粒在我院生产及临床应用中，质量控制方面只做了粒度及装量差异等方面的要求，未对其有效成分进行含量测定及限度要求，为确保临床使用中安全有效，提高制剂质量，本文参考有关文献，建立使用高效液相色谱仪同时测定护肝颗粒中的槲皮素、山柰素、异鼠李素3种主要的黄酮类成分的含量测定的方法，为全面控制药品质量，也为我院该医院制剂的质量控制及质量标准的制定和提高提供一定的参考依据。
1仪器与试药
11仪器Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2998紫外检测器，Empower色谱工作站（美国Waters公司）、AG135型电子天平（瑞士梅特勒公司）。
12试剂甲醇为色谱纯（德国默克）；水为娃哈哈纯净水；盐酸为分析纯。
13分析样品槲皮素对照品（批号13122506），山柰素对照品（批号14010701），异鼠李素对照品（批号13053007），均购于成都曼斯特科技开发有限公司；护肝颗粒由本院制剂室自制（批号：150323、150408、150612）。
2方法与结果
21色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为Hedera ODS2（46 mm×200 mm，5 μm）；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选用不同比例的04%磷酸溶液（A）∶甲醇（B）为流动相，梯度洗脱[3]。条件见表1。
22对照品溶液的制备精密称取槲皮素、山柰素、异鼠李素1920 mg、501 mg、525 mg，分别置于不同的10 mL容量瓶中，加适量甲醇溶解，并用甲醇定容至刻度，摇匀备用。分别取1 mL上述对照品溶液置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，制成每1 mL分別含槲皮素、山柰素、异鼠李素分别为0076 8 mg、0020 04 mg、0021 mg的混合对照品溶液。
23供试品溶液的制备取本品颗粒适量，研细，精密称取约30 g，置于具塞锥形瓶中，精密量取甲醇25%盐酸溶液（4∶1）混合溶液25 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，用上述混合溶液补足重量，摇匀，过045 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。 24专属性试验分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述“22”项下色谱条件分别进行测定，结果发现槲皮素、山柰素、异鼠李素三者分离度良好，符合分析要求；在供试品溶液中槲皮素、山柰素、异鼠李素与对照品有相同的保留时间，与供试品中其他成分的分离度较好，阴性对照对槲皮素、山柰素、异鼠李素均无干扰。色谱图见图1。
25线性关系考察精密吸取混合对照品溶液各1、2、4、6、10、12 μL进样，测定峰面积，以槲皮素、山柰素、异鼠李素的进样量（μg）为横坐标X，以三者峰面积为纵坐标Y，各自进行线性回归，槲皮素线性回归方程为：Y=30730298X133943，r=09999；山柰素的线性回归方程为Y=30636305X61967，r=09998；异鼠李素的线性回归方程为：Y=25946329X92858，r=09999。结果表明槲皮素、山柰素、异鼠李素分别在00768～192 μg，002004～0501 μg，0021～0525 μg线性范围内，线性关系良好。
26中间精密度试验精密吸取每1 mL分别含槲皮素、山柰素、异鼠李素分别为0076 8 mg、0020 04 mg、0021 mg的混合对照品溶液按照上述“22”项下色谱条件，重复进样6次进行分析测定，进样量均为10 μL。分别测定槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积，结果计算得出槲皮素、山柰素、异鼠李素的峰面积的RSD分别为06%、09%、11%，该试验结果表明精仪器的精密度良好，可用于进一步试验分析。
27供试品溶液稳定性试验取同一批样品，按“21”项下供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，于室温下放置，分别于0、2、4、6、8、10、12 h后吸取10 μL进样分析测定，在“22”项下色谱条件进行测定供试品中槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积，结果槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积的RSD分别为08%、12%、13%，试验结果表明，按此方法制备的供试品溶液稳定性良好。
28重复性试验取同一批样品，平行制备6份供试品溶液，按“21”项下供试品溶液的制備方法，精密吸取供试品溶液10 μL进样，在“22”项下色谱条件进行分析测定，结果槲皮素、山柰素、异鼠李素的平均含量分别为115 mg/g、031 mg/g、047 mg/g，各成分含量的RSD分别为13%、10%、12%，均符合要求，试验结果表明该方法重复性良好。
29回收率试验取已知含量样品（批号为140408，槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量分别为115 mg/g、031 mg/g、047 mg/g）6份，分别精密加入一定量的槲皮素对照品溶液（192 mg/mL）、山柰素对照品溶液（0501 mg/mL）、异鼠李素对照品溶液（0525 mg/mL），上述溶液按“21”项下供试品溶液的制备方法分别制备6份供试品溶液，按“22”项下色谱条件进样，分析测定，测定方法的回收率。测定结果见表2、表3、表4。
3讨论
通过比较不同的提取方式发现，相同的提取时间，回流提取的提取率高于超声提取法，且回流提取的方法重复性高，所以本文采取回流法提取样品。通过比较不同的回流提取时间，结果发现，回流1 h后3种成分的总含量较高，继续增加回流时间3种成分的总量不再增加，反而有所减少，可能是因为持续加热对黄酮类成分的稳定性有影响，因此最终选择回流1 h提取[46]。
本实验最初考察了不同流动相进行液相试验，先参考了《中华人民共和国药典》一部中垂盆草药材项下的含量测定方法，采用流动相条件为甲醇04%磷酸溶液（45∶55）进行试验研究，结果发现，该液相条件下，异鼠李素色谱峰的保留时间太长，因此，笔者考察了其他流动相系统。在流动相的选择中，笔者分别考察了甲醇磷酸溶液系统、乙腈磷酸溶液系统及各种系统不同比例的流动相，结果发现使用甲醇04%磷酸为流动相时，槲皮素、山柰素、异鼠李素能与溶液中其他组分色谱峰较好地分开，但山柰素和异鼠李素两者的峰相聚太近，因此12 min后增加磷酸的比例[7]，增加洗脱极性，调整后结果显示山柰素和异鼠李素色谱峰能够较好地分开，且峰形较好。
经化学研究表明，垂盆草中主要有效成分是以槲皮素、山柰素、异鼠李素为代表的各种黄酮类成分及蛋白质、氨基酸、糖类、皂苷类、生物碱类和氰苷类等成分[8]。黄酮类成分是垂盆草发挥临床疗效的主要活性成分[911]，其中黄酮类成分主要包括槲皮素、山奈素和异鼠李素等。因此，试验研究中选择垂盆草中的槲皮素等3种主要的黄酮类成分作为质量控制的指标成分[12]。
本实验通过比较不同的提取方法、时间及提取溶剂，最终选择最佳的回流提取方法，参考相关文献采用甲醇磷酸按不同比例梯度洗脱的方法建立高效液相色谱同时测定护肝颗粒中3种主要的黄酮类成分槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量的方法。槲皮素、山柰素、异鼠李素分别在0076 8～192 μg，0020 04～0501 μg，0021～0525 μg范围内进样量与峰面积积分值线性关系良好，r分别为09999、09998、09999，加样回收率分别为974%、981%、979%，RSD分别为14%、18%、13%。表明该方法线性关系良好。仪器的精密度、方法重复性、样品稳定性、加样回收率等均符合相关要求，该方法可为该制剂的质量控制提供一定的依据。
参考文献
[1]袁杰，程志清.HPLC法测定垂盆草颗粒中槲皮素的含量[J].中国药事，2009，23（5）：467468，471.
[2]宋玉华，李春雨，郑燕，等.垂盆草的研究进展进展[J].中药材，2010，33（12）：19731975.
[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2015年版）一部[M].北京：中国医药科技出社，2015.
[4]潘志文，莫结丽.垂盆草配方颗粒的质量标准研究[J].现代中药研究与实践，2013，27（4）：5658.
[5]叶立红，李鹂，彭小燕.HPLC法测定垂盆草配方颗粒中黄酮类成分的含量[J].中国药师，2013，16（8）：11611163.
[6]谭雄斯.HPLCUVELSD法测定益肝乐颗粒中槲皮素、山柰素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d[J].中成药，2014，36（3）：531535.
[7]刘知远，沈廷明，吴仲玉.RPHPLC法同时测定福建产金线莲中槲皮素、山柰素、异鼠李素的量[J].中草药，2015，46（3）：432434.
[8]蒋俊春，孟建升，杨文文.HPLC法测定八味接骨胶囊中山柰素的含量[J].中国药事，2012，26（12）：13741376.
[9]梁大连，杨民生，李宁，等.HPLC测定过山厥提取物中山柰素含量[J].食品与药品，2013，15（1）：4547.
[10]秦洁，马果玉，马剑平.垂盆草颗粒质量标准研究[J].中成药，2010，32（1）：168170.
[11]杨嫆嫆，陆红，吴莲凤，等.垂盆草提取物对TGFβ1诱导的肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化和基质累积的影响[J].温州医科大学学报，2015，45（4）：243247.
[12]曾军英，李胜华，伍贤进，等.垂盆草醇提物抑制HepG2细胞STAT3信号通路诱导细胞凋亡的研究[J].中国中药杂志，2014，39（17）：33493352.
（2015-12-14收稿责任编辑：王明）
关键词护肝颗粒；HPLC；槲皮素；山柰素；异鼠李素
AbstractObjective：To develop method for detetmining uercetin，Kaempferide and Isorhamnetin in Hugan granules by HPLC.Methods：HPLC was used for the determination of uercetin，Kaempferide and Isorhamnetin.The column was set as Hedera ODS2 （46 mm×200 mm，5 μm）.The mobile phase was methanol04% phosphoric acid，and the gradient elution was used.The detection wavelength was set at 360 nm and the flow rate was 10 mL·minResults：uercetin，Kaempferide and Isorhamnetin showed a good linear relationship in the range of 00768～192 μg（r=09999），002004～0501 μg（r=09998） and 0021～0525 μg （r=09999）.The average recovery of uercetin was 981% with RSD of 14%，the average recovery of Kaempferide was 981 % with RSD of 18%，and the average recovery of Isorhamnetin was 979 % with RSD of 13%.Conclusion：The method is accurate and stable，which can be used for the determination of uercetin，Kaempferide and Isorhamnetin in Hugan granules.
Key WordsHugan granules； HPLC； Uercetin； Kaempferide； Isorhamnetin
中图分类号：R2841文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.049
护肝颗粒由垂盆草、虎杖、茵陈、黄柏、金钱草等七味中药组成，是根据我院名中医长期的临床经验方制备而成的复方中药制剂。具有清热利湿、益肝化瘀、疏肝止痛的功效，临床常用于治疗急慢性肝炎，疗效确切。处方中君药垂盆草具有清热解毒、清热利湿的功效，是本制剂发挥其保肝降酶临床疗效的重要组成部分，化学成分研究表明，垂盆草中主要有效成分是以槲皮素、山柰素、异鼠李素等为代表的各种黄酮类成分及蛋白质、氨基酸、糖类、皂苷类、生物碱类和氰苷类等成分[12]。护肝颗粒在我院生产及临床应用中，质量控制方面只做了粒度及装量差异等方面的要求，未对其有效成分进行含量测定及限度要求，为确保临床使用中安全有效，提高制剂质量，本文参考有关文献，建立使用高效液相色谱仪同时测定护肝颗粒中的槲皮素、山柰素、异鼠李素3种主要的黄酮类成分的含量测定的方法，为全面控制药品质量，也为我院该医院制剂的质量控制及质量标准的制定和提高提供一定的参考依据。
1仪器与试药
11仪器Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2998紫外检测器，Empower色谱工作站（美国Waters公司）、AG135型电子天平（瑞士梅特勒公司）。
12试剂甲醇为色谱纯（德国默克）；水为娃哈哈纯净水；盐酸为分析纯。
13分析样品槲皮素对照品（批号13122506），山柰素对照品（批号14010701），异鼠李素对照品（批号13053007），均购于成都曼斯特科技开发有限公司；护肝颗粒由本院制剂室自制（批号：150323、150408、150612）。
2方法与结果
21色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为Hedera ODS2（46 mm×200 mm，5 μm）；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选用不同比例的04%磷酸溶液（A）∶甲醇（B）为流动相，梯度洗脱[3]。条件见表1。
22对照品溶液的制备精密称取槲皮素、山柰素、异鼠李素1920 mg、501 mg、525 mg，分别置于不同的10 mL容量瓶中，加适量甲醇溶解，并用甲醇定容至刻度，摇匀备用。分别取1 mL上述对照品溶液置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，制成每1 mL分別含槲皮素、山柰素、异鼠李素分别为0076 8 mg、0020 04 mg、0021 mg的混合对照品溶液。
23供试品溶液的制备取本品颗粒适量，研细，精密称取约30 g，置于具塞锥形瓶中，精密量取甲醇25%盐酸溶液（4∶1）混合溶液25 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，用上述混合溶液补足重量，摇匀，过045 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。 24专属性试验分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述“22”项下色谱条件分别进行测定，结果发现槲皮素、山柰素、异鼠李素三者分离度良好，符合分析要求；在供试品溶液中槲皮素、山柰素、异鼠李素与对照品有相同的保留时间，与供试品中其他成分的分离度较好，阴性对照对槲皮素、山柰素、异鼠李素均无干扰。色谱图见图1。
25线性关系考察精密吸取混合对照品溶液各1、2、4、6、10、12 μL进样，测定峰面积，以槲皮素、山柰素、异鼠李素的进样量（μg）为横坐标X，以三者峰面积为纵坐标Y，各自进行线性回归，槲皮素线性回归方程为：Y=30730298X133943，r=09999；山柰素的线性回归方程为Y=30636305X61967，r=09998；异鼠李素的线性回归方程为：Y=25946329X92858，r=09999。结果表明槲皮素、山柰素、异鼠李素分别在00768～192 μg，002004～0501 μg，0021～0525 μg线性范围内，线性关系良好。
26中间精密度试验精密吸取每1 mL分别含槲皮素、山柰素、异鼠李素分别为0076 8 mg、0020 04 mg、0021 mg的混合对照品溶液按照上述“22”项下色谱条件，重复进样6次进行分析测定，进样量均为10 μL。分别测定槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积，结果计算得出槲皮素、山柰素、异鼠李素的峰面积的RSD分别为06%、09%、11%，该试验结果表明精仪器的精密度良好，可用于进一步试验分析。
27供试品溶液稳定性试验取同一批样品，按“21”项下供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，于室温下放置，分别于0、2、4、6、8、10、12 h后吸取10 μL进样分析测定，在“22”项下色谱条件进行测定供试品中槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积，结果槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积的RSD分别为08%、12%、13%，试验结果表明，按此方法制备的供试品溶液稳定性良好。
28重复性试验取同一批样品，平行制备6份供试品溶液，按“21”项下供试品溶液的制備方法，精密吸取供试品溶液10 μL进样，在“22”项下色谱条件进行分析测定，结果槲皮素、山柰素、异鼠李素的平均含量分别为115 mg/g、031 mg/g、047 mg/g，各成分含量的RSD分别为13%、10%、12%，均符合要求，试验结果表明该方法重复性良好。
29回收率试验取已知含量样品（批号为140408，槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量分别为115 mg/g、031 mg/g、047 mg/g）6份，分别精密加入一定量的槲皮素对照品溶液（192 mg/mL）、山柰素对照品溶液（0501 mg/mL）、异鼠李素对照品溶液（0525 mg/mL），上述溶液按“21”项下供试品溶液的制备方法分别制备6份供试品溶液，按“22”项下色谱条件进样，分析测定，测定方法的回收率。测定结果见表2、表3、表4。
3讨论
通过比较不同的提取方式发现，相同的提取时间，回流提取的提取率高于超声提取法，且回流提取的方法重复性高，所以本文采取回流法提取样品。通过比较不同的回流提取时间，结果发现，回流1 h后3种成分的总含量较高，继续增加回流时间3种成分的总量不再增加，反而有所减少，可能是因为持续加热对黄酮类成分的稳定性有影响，因此最终选择回流1 h提取[46]。
本实验最初考察了不同流动相进行液相试验，先参考了《中华人民共和国药典》一部中垂盆草药材项下的含量测定方法，采用流动相条件为甲醇04%磷酸溶液（45∶55）进行试验研究，结果发现，该液相条件下，异鼠李素色谱峰的保留时间太长，因此，笔者考察了其他流动相系统。在流动相的选择中，笔者分别考察了甲醇磷酸溶液系统、乙腈磷酸溶液系统及各种系统不同比例的流动相，结果发现使用甲醇04%磷酸为流动相时，槲皮素、山柰素、异鼠李素能与溶液中其他组分色谱峰较好地分开，但山柰素和异鼠李素两者的峰相聚太近，因此12 min后增加磷酸的比例[7]，增加洗脱极性，调整后结果显示山柰素和异鼠李素色谱峰能够较好地分开，且峰形较好。
经化学研究表明，垂盆草中主要有效成分是以槲皮素、山柰素、异鼠李素为代表的各种黄酮类成分及蛋白质、氨基酸、糖类、皂苷类、生物碱类和氰苷类等成分[8]。黄酮类成分是垂盆草发挥临床疗效的主要活性成分[911]，其中黄酮类成分主要包括槲皮素、山奈素和异鼠李素等。因此，试验研究中选择垂盆草中的槲皮素等3种主要的黄酮类成分作为质量控制的指标成分[12]。
本实验通过比较不同的提取方法、时间及提取溶剂，最终选择最佳的回流提取方法，参考相关文献采用甲醇磷酸按不同比例梯度洗脱的方法建立高效液相色谱同时测定护肝颗粒中3种主要的黄酮类成分槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量的方法。槲皮素、山柰素、异鼠李素分别在0076 8～192 μg，0020 04～0501 μg，0021～0525 μg范围内进样量与峰面积积分值线性关系良好，r分别为09999、09998、09999，加样回收率分别为974%、981%、979%，RSD分别为14%、18%、13%。表明该方法线性关系良好。仪器的精密度、方法重复性、样品稳定性、加样回收率等均符合相关要求，该方法可为该制剂的质量控制提供一定的依据。
参考文献
[1]袁杰，程志清.HPLC法测定垂盆草颗粒中槲皮素的含量[J].中国药事，2009，23（5）：467468，471.
[2]宋玉华，李春雨，郑燕，等.垂盆草的研究进展进展[J].中药材，2010，33（12）：19731975.
[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2015年版）一部[M].北京：中国医药科技出社，2015.
[4]潘志文，莫结丽.垂盆草配方颗粒的质量标准研究[J].现代中药研究与实践，2013，27（4）：5658.
[5]叶立红，李鹂，彭小燕.HPLC法测定垂盆草配方颗粒中黄酮类成分的含量[J].中国药师，2013，16（8）：11611163.
[6]谭雄斯.HPLCUVELSD法测定益肝乐颗粒中槲皮素、山柰素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d[J].中成药，2014，36（3）：531535.
[7]刘知远，沈廷明，吴仲玉.RPHPLC法同时测定福建产金线莲中槲皮素、山柰素、异鼠李素的量[J].中草药，2015，46（3）：432434.
[8]蒋俊春，孟建升，杨文文.HPLC法测定八味接骨胶囊中山柰素的含量[J].中国药事，2012，26（12）：13741376.
[9]梁大连，杨民生，李宁，等.HPLC测定过山厥提取物中山柰素含量[J].食品与药品，2013，15（1）：4547.
[10]秦洁，马果玉，马剑平.垂盆草颗粒质量标准研究[J].中成药，2010，32（1）：168170.
[11]杨嫆嫆，陆红，吴莲凤，等.垂盆草提取物对TGFβ1诱导的肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化和基质累积的影响[J].温州医科大学学报，2015，45（4）：243247.
[12]曾军英，李胜华，伍贤进，等.垂盆草醇提物抑制HepG2细胞STAT3信号通路诱导细胞凋亡的研究[J].中国中药杂志，2014，39（17）：33493352.
（2015-12-14收稿责任编辑：王明）