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摘要：温敏型水凝胶在药物或抗原富集、缓释、控释等方面具有重要的应用价值。为获得一种可用于注射的、在生理温度附近具有良好相变可控性的温敏型水凝胶，试验分析了F127、F68、HPMC等不同组分对成胶行为的影响，通过测定并比较不同配方的凝胶温度、凝胶时间等，筛选到6个符合最优成胶条件的温敏型水凝胶配方，其在室温下为无色透明液体，通针性良好，在温度为37℃时可快速转变为半固体凝胶态，成胶时间约3min。本试验筛选出的温敏型水凝胶配方为后续在疫苗佐剂方面的应用提供了基本试验资料。
关键词：温敏型水凝胶;凝胶温度;凝胶时间;泊洛沙姆
中图分类号：S852.5文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2021）04-0120-05
作者简介：黄永娜（1994—），女，山东日照人，硕士，主要从事畜禽疫病防控方向的研究。E-mail：1271794375@qq.com。
通信作者：张金秋，副研究员，主要从事畜禽疫病防控研究。E-mail：jqzh03@126.com。
温敏型水凝胶（temperaturesensitivehydrogel）是目前研究较为广泛的原位水凝胶之一，能够对外界环境温度的变化作出及时响应，实现溶液—凝胶的相转变，在生物医药、组织工程、细胞工程等方面具有重要应用价值[1]。特别是在药物控释方面，温敏型水凝胶的三维网状结构可以将药物包裹在内，形成药物储库，有助于提高药物的载量。随着凝胶在体内的降解或溶蚀，药物缓慢释放，可避免药物的首过效应，延长药物在体内的滞留时间，从而达到持续给药的目的[2]。另外，一些蛋白类药物进入机体后，很容易被酶类物质降解，使药效得不到充分发挥，而利用温敏型水凝胶作为蛋白类药物的载体，可以显著减缓蛋白类药物的降解速度，借助缓释作用提高药物的生物利用度[3]。
温敏型水凝胶的这一特征提示其可以作为优良的抗原载体，即可以用作疫苗佐剂，一方面有利于富集抗原，形成抗原储库，另一方面可以通过缓控释功能，延长抗原在体内的存留时间，增加抗原与机体免疫系统的接触，模拟疫苗多次免疫的效果，持续刺激机体产生高滴度的抗体。因此，本研究选择生物相容性良好的高分子聚合物等作为凝胶基质，筛选不同物质的浓度及配伍比例，旨在制备一种适用于注射的温敏型水凝胶，为后续的疫苗研发提供技术支持。
1材料与方法
1.1主要试剂
泊洛沙姆407（Poloxamer407，F127，SigmaAldrich公司）;泊洛沙姆188（Poloxamer188，F68，SigmaAldrich公司）;羟丙基甲基纤维素（HPMC，SigmaAldrich公司）;其他化学试剂均为分析纯。
1.2主要仪器设备
数显磁力搅拌器，江苏省金坛荣华仪器制造有限公司生产;HPX-9082MBE数显电热培养箱;超声仪，上海声浦超声波设备厂生产;恒温培养箱，德国Binder公司生产;DSC8500差示扫描量热仪，美国PerkinElmer公司生产;流变仪MCR301，奥地利AntonPaar公司生产。
1.3配方的筛选
采用冷法制备温敏型水凝胶[4]。准确称量泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、羟丙基甲基纤维素等高分子材料，溶于适量超纯水中，于冰水浴条件下充分混合均匀，4℃冰箱过夜使其充分溶胀。
1.3.1F127对成胶行为的影响选取的F127的浓度为30%，HPMC的浓度为2.5%，调整F127∶HPMC的体积比分别为7∶1、6∶1、5∶2、4∶3、5∶1、4∶1、3∶1，观察其成胶温度的变化，考察F127的含量对凝胶行为的影响。
1.3.2F68对成胶行为的影响选取的F127的浓度为30%，HPMC的浓度为2.5%，F68的浓度为10%，调整F127∶F68∶HPMC的体积比分别为7∶1∶1、6∶1∶1、5∶1∶1、4∶1∶1，考察F68的含量对凝胶行为的影响。
1.3.3HPMC对成胶行为的影响选取的F127的浓度为30%，F68的浓度为10%，HPMC的浓度为2.5%，调整F127∶F68∶HPMC的体积比分别为7∶1∶0.5、7∶1∶1、6∶1∶0.5、6∶1∶1、5∶1∶0.5、5∶1∶1、4∶1∶0.5、4∶1∶1，考察HPMC的含量对凝胶行为的影响。
1.4凝胶时间的测定
采用倒置法，将配制好的温敏性凝胶水溶液放置在培养箱中，自29℃开始升温，控制升温速度在1℃/2min，每隔2min倒置倾斜观察，与水平面夹角成60°，以30s内液体不流动作为成胶判定依据，记录胶凝温度和胶凝时间。试验重复3次，计算平均值。
1.5流变仪测定温敏型水凝胶的玻璃化转变温度及黏弹性
按“1.3”节的方法制备样品后，经流变仪MCR301测定样品玻璃化转变温度（Tg）。设定应变值为10%，角频率Ω为2rad/s，升温范围为10～50℃，升温速度为2℃/min，10℃保温2min，样品测量厚度为0.5mm。观察温敏型水凝胶的储模量G′和失模量G″随温度的模量变化情况，计算损耗因子tanδ的值。
2结果与分析
2.1温敏型水凝胶的形态变化
从图1可以看出，在室温下该温敏型水凝胶为具有良好流动性的无色透明液体，且流动性与温度呈反向相关关系，即温度越低，流动性越好，温度为37℃时为不流动的半固体凝胶态。室温下经1mL注射器注射试验，该温敏型水凝胶通针性良好。
[FK（W9][TPHYN1.tif][FK）]
2.2F127对成胶行为的影响
从表1可以看出，温度升至39℃时，体积比为5∶2、4∶3、3∶1的体系仍不能成胶，对应F127的实际浓度为21.43%、17.14%、22.5%。由此筛选出可形成凝胶的试验组别7∶1、6∶1、5∶1和4∶1，用于后续试验。由F127：HPMC組成的体系中，F127的最低成胶浓度为24%，且F127的浓度越大，成胶温度越低。 2.3F68对成胶行为的影响
在F127与HPMC体积比不变的情况下，仅改变F68的体积占比，考察成胶时间与成胶温度的关系。从表2可以看出，提高F68的含量，体系的胶凝时间明显增加。当F68的含量进一步增加，即F127∶F68∶HPMC的体积比为7∶3∶1.5、7∶4∶1.5时，体系在39℃以下均不能成胶。
2.4HPMC对成胶行为的影响
从表3可以看出，当固定F127与F68的比例时，增加HPMC的体积比能够提高该温敏型水凝胶的成胶温度。同时，F127的含量越低，体系的成胶温度越高，当F127∶F68∶HPMC的体积比为4∶1∶1时，即使温度升至39℃，体系依然不能成胶。
2.5不同配方的凝胶时间比较
根据上述各因素对胶凝温度和胶凝时间的影响，设计各种高分子物质的比例，比较不同凝胶配方在不同温度的成胶时间。从表4可以看出，上述各组配方在36～38℃的成胶时间均在3min左右，且随着配方中[KG*8]F127[KG*8]和[KG*8]HPMC[KG*8]含量的升高，相同温度下体系的胶凝时间逐渐缩短。
2.6温敏型水凝胶的玻璃化转变温度及黏弹性测定
以F127∶F68∶HPMC（体积比）=7∶1∶1.5的配方为例，通过流变仪测定该配方的玻璃化转变温度及黏弹性。从图2-a可以看出，在10～25℃，样品的储能模量和损耗模量均无明显变化。温度继续升高到25℃以上，储能模量和损耗模量均开始明显增加，但储能模量
关键词：温敏型水凝胶;凝胶温度;凝胶时间;泊洛沙姆
中图分类号：S852.5文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2021）04-0120-05
作者简介：黄永娜（1994—），女，山东日照人，硕士，主要从事畜禽疫病防控方向的研究。E-mail：1271794375@qq.com。
通信作者：张金秋，副研究员，主要从事畜禽疫病防控研究。E-mail：jqzh03@126.com。
温敏型水凝胶（temperaturesensitivehydrogel）是目前研究较为广泛的原位水凝胶之一，能够对外界环境温度的变化作出及时响应，实现溶液—凝胶的相转变，在生物医药、组织工程、细胞工程等方面具有重要应用价值[1]。特别是在药物控释方面，温敏型水凝胶的三维网状结构可以将药物包裹在内，形成药物储库，有助于提高药物的载量。随着凝胶在体内的降解或溶蚀，药物缓慢释放，可避免药物的首过效应，延长药物在体内的滞留时间，从而达到持续给药的目的[2]。另外，一些蛋白类药物进入机体后，很容易被酶类物质降解，使药效得不到充分发挥，而利用温敏型水凝胶作为蛋白类药物的载体，可以显著减缓蛋白类药物的降解速度，借助缓释作用提高药物的生物利用度[3]。
温敏型水凝胶的这一特征提示其可以作为优良的抗原载体，即可以用作疫苗佐剂，一方面有利于富集抗原，形成抗原储库，另一方面可以通过缓控释功能，延长抗原在体内的存留时间，增加抗原与机体免疫系统的接触，模拟疫苗多次免疫的效果，持续刺激机体产生高滴度的抗体。因此，本研究选择生物相容性良好的高分子聚合物等作为凝胶基质，筛选不同物质的浓度及配伍比例，旨在制备一种适用于注射的温敏型水凝胶，为后续的疫苗研发提供技术支持。
1材料与方法
1.1主要试剂
泊洛沙姆407（Poloxamer407，F127，SigmaAldrich公司）;泊洛沙姆188（Poloxamer188，F68，SigmaAldrich公司）;羟丙基甲基纤维素（HPMC，SigmaAldrich公司）;其他化学试剂均为分析纯。
1.2主要仪器设备
数显磁力搅拌器，江苏省金坛荣华仪器制造有限公司生产;HPX-9082MBE数显电热培养箱;超声仪，上海声浦超声波设备厂生产;恒温培养箱，德国Binder公司生产;DSC8500差示扫描量热仪，美国PerkinElmer公司生产;流变仪MCR301，奥地利AntonPaar公司生产。
1.3配方的筛选
采用冷法制备温敏型水凝胶[4]。准确称量泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、羟丙基甲基纤维素等高分子材料，溶于适量超纯水中，于冰水浴条件下充分混合均匀，4℃冰箱过夜使其充分溶胀。
1.3.1F127对成胶行为的影响选取的F127的浓度为30%，HPMC的浓度为2.5%，调整F127∶HPMC的体积比分别为7∶1、6∶1、5∶2、4∶3、5∶1、4∶1、3∶1，观察其成胶温度的变化，考察F127的含量对凝胶行为的影响。
1.3.2F68对成胶行为的影响选取的F127的浓度为30%，HPMC的浓度为2.5%，F68的浓度为10%，调整F127∶F68∶HPMC的体积比分别为7∶1∶1、6∶1∶1、5∶1∶1、4∶1∶1，考察F68的含量对凝胶行为的影响。
1.3.3HPMC对成胶行为的影响选取的F127的浓度为30%，F68的浓度为10%，HPMC的浓度为2.5%，调整F127∶F68∶HPMC的体积比分别为7∶1∶0.5、7∶1∶1、6∶1∶0.5、6∶1∶1、5∶1∶0.5、5∶1∶1、4∶1∶0.5、4∶1∶1，考察HPMC的含量对凝胶行为的影响。
1.4凝胶时间的测定
采用倒置法，将配制好的温敏性凝胶水溶液放置在培养箱中，自29℃开始升温，控制升温速度在1℃/2min，每隔2min倒置倾斜观察，与水平面夹角成60°，以30s内液体不流动作为成胶判定依据，记录胶凝温度和胶凝时间。试验重复3次，计算平均值。
1.5流变仪测定温敏型水凝胶的玻璃化转变温度及黏弹性
按“1.3”节的方法制备样品后，经流变仪MCR301测定样品玻璃化转变温度（Tg）。设定应变值为10%，角频率Ω为2rad/s，升温范围为10～50℃，升温速度为2℃/min，10℃保温2min，样品测量厚度为0.5mm。观察温敏型水凝胶的储模量G′和失模量G″随温度的模量变化情况，计算损耗因子tanδ的值。
2结果与分析
2.1温敏型水凝胶的形态变化
从图1可以看出，在室温下该温敏型水凝胶为具有良好流动性的无色透明液体，且流动性与温度呈反向相关关系，即温度越低，流动性越好，温度为37℃时为不流动的半固体凝胶态。室温下经1mL注射器注射试验，该温敏型水凝胶通针性良好。
[FK（W9][TPHYN1.tif][FK）]
2.2F127对成胶行为的影响
从表1可以看出，温度升至39℃时，体积比为5∶2、4∶3、3∶1的体系仍不能成胶，对应F127的实际浓度为21.43%、17.14%、22.5%。由此筛选出可形成凝胶的试验组别7∶1、6∶1、5∶1和4∶1，用于后续试验。由F127：HPMC組成的体系中，F127的最低成胶浓度为24%，且F127的浓度越大，成胶温度越低。 2.3F68对成胶行为的影响
在F127与HPMC体积比不变的情况下，仅改变F68的体积占比，考察成胶时间与成胶温度的关系。从表2可以看出，提高F68的含量，体系的胶凝时间明显增加。当F68的含量进一步增加，即F127∶F68∶HPMC的体积比为7∶3∶1.5、7∶4∶1.5时，体系在39℃以下均不能成胶。
2.4HPMC对成胶行为的影响
从表3可以看出，当固定F127与F68的比例时，增加HPMC的体积比能够提高该温敏型水凝胶的成胶温度。同时，F127的含量越低，体系的成胶温度越高，当F127∶F68∶HPMC的体积比为4∶1∶1时，即使温度升至39℃，体系依然不能成胶。
2.5不同配方的凝胶时间比较
根据上述各因素对胶凝温度和胶凝时间的影响，设计各种高分子物质的比例，比较不同凝胶配方在不同温度的成胶时间。从表4可以看出，上述各组配方在36～38℃的成胶时间均在3min左右，且随着配方中[KG*8]F127[KG*8]和[KG*8]HPMC[KG*8]含量的升高，相同温度下体系的胶凝时间逐渐缩短。
2.6温敏型水凝胶的玻璃化转变温度及黏弹性测定
以F127∶F68∶HPMC（体积比）=7∶1∶1.5的配方为例，通过流变仪测定该配方的玻璃化转变温度及黏弹性。从图2-a可以看出，在10～25℃，样品的储能模量和损耗模量均无明显变化。温度继续升高到25℃以上，储能模量和损耗模量均开始明显增加，但储能模量