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【摘 要】 目的：比较8个厂家74批次丹参片中脂溶性成分丹参酮ⅡA的含量差异。方法：采用RP-HPLC法，色谱柱：Aglient C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱;流动相：甲醇-水（75∶25）; 柱温30℃;流速为1mL·min.-1;检测波长270nm，选取本次国家评价性抽验的8个厂家74批次丹参片样品对其进行含量测定，并采用频数分布图和箱形图对其含量测定结果进行比較分析。结果：丹参酮ⅡA进样量在0.00885～0.221 μg范围内与色谱峰峰面积呈良好线性关系;平均回收率（n=6）为99.6%，RSD为0.02%; 8个厂家74批次丹参片中脂溶性成分丹参酮ⅡA的含量差异较大。结论：所建立的方法经方法学验证简便快捷、准确、重复性好 ，为丹参片的质量控制提供参考依据;不同厂家生产的和同一厂家生产的不同批次之间含量差异均较大，有待于进一步提高丹参原药材质量和规范丹参片生产工艺;采用的频数分布图和箱形图对测定结果的分析直观、准确可靠。
【关键词】 丹参片;脂溶性成分;丹参酮ⅡA;高效液相色谱法;频数分布图;箱形图
【中图分类号】R286 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2019）15-0031-04
丹参片是《中国药典）一部收载的品种，具有活血化瘀的作用， 用于瘀血闭阻所致的胸痹，症见胸部疼痛、痛处固定、舌质紫暗;冠心病心绞痛见上述证候者[1-5]。军事训练伤急性损伤后期或软组织慢性损伤，有瘀斑或瘀血并伴肿痛，口服丹参片有活血化瘀及缓解肿痛的作用。研究表明，丹参中的活性成分主要有脂溶性的丹参酮类和水溶性的酚酸类成分[6-14]。丹参片在中国药典2015年版一部中的含量测定项为HPLC法测定丹参中丹酚酸B的含量，而丹参片的另一类主要成分即脂溶性成分未作相应的含量测定控制[1]。而且临床应用中发现，不同厂家生产的丹参片质量和疗效存在很大差异，为此，本实验运用HPLC法对本次国家评价性抽验的8个不同厂家74批次丹参片样品，在检测波长为270nm下对脂溶性成分丹参酮ⅡA的含量进行了测定研究。通过方法学验证，该方法操作简便、准确，重复性好，为丹参片的整体质量控制监管提供科学依据;并采用频数分布图和箱形图对其含量进行比较分析，现报道如下。
1 仪器与试药
高效液相色谱（HPLC）岛津LC20AT系统;天平：Mettler AE240电子天平（瑞士梅特勒公司）;对照品丹参酮ⅡA（批号：110766-201520标示量为98.9%）购自中国食品药品检定研究院;甲醇为色谱级（美国Merck公司），水为重蒸水（自制），其它试剂均为国产分析纯;丹参片为2015年国家评价性抽验抽取的样品。
2 溶液制备
2.1 对照品溶液 精密称取丹参酮ⅡA对照品22.36mg，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解
并稀释至刻度，再精密量取1mL，置100mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成每1mL含22.11μg的溶液，即得。
2.2 供试品溶液 取本品10片，糖衣片除去糖衣，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形
瓶中，精密加入甲醇溶液50mL，称定重量，超声处理30min（功率：280w;频率：40 kHz），
放冷至室温，再称定重量，用甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
2.3 阴性样品溶液 取缺丹参的丹参片阴性样品，按“2.2”项下的方法，制得阴性样品溶液，即得。
3 方法与结果
3.1 色谱条件 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Aglient C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱;流动相：甲醇-水（75∶25）; 柱温30℃;流速为1mL·min.-1;检测波长270nm。进样量：10μL。在此色谱条件下，丹参酮ⅡA对照品，样品和缺丹参的阴性样品的分离色谱图如图1所示。
3.2 线性关系考察 分别精密量取2.1项下配制的对照品溶液 1mL、1mL、1mL、2mL、3mL、20mL至25mL、10mL、5mL、5mL、5mL、25mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得线性关系各浓度对照品溶液。精密吸取上述各浓度对照品溶液10μL，注入液相色谱仪进行测定，以进样量（μg）为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，得到丹参酮ⅡA的回归方程为： y=3813.8x+36.125（R.2=1.0000）线性范围为0.00885～0.221μg。结果表明线性关系良好。
3.3 精密度试验 取对照品溶液③，连续进样6次，每次10μL，测定峰面积值，结果丹参酮ⅡA峰面积的RSD为0.01%。表明仪器精密度良好。
3.4 稳定性试验 取同一供试品溶液分别于0、2、4、12、16和24h进样10μL进行测定，结果丹参酮ⅡA峰面积的RSD为0.01%。表明供试品溶液中的待测成分丹参酮ⅡA在室温放置24h内基本稳定。
3.5 重复性试验 取同一批丹参片样品（批号：150305），按“2.2”项下的方法平行制得6份供试品溶液，在上述色谱条件下进样10μL进行测定并计算，结果平均含量值为1.037 mg·g.-1， RSD为和0.02%。表明其重复性良好。
3.6 回收率试验 取丹参片样品（批号：150305）适量，精密称取6份，每份约0.5g， 置具塞锥形瓶中，精密加入丹参酮ⅡA对照品溶液⑦ （质量浓度为176.91μg·mL.-1）3mL，再精密加入甲醇溶液50mL，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，进样10μL进行测定。结果丹参酮ⅡA平均回收率（n=6）为99.6%，RSD为0.02%。表明该方法的回收率良好。 3.7 样品的测定 取8个厂家74批次丹参片样品，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样10μL进行测定，计算含量，结果见表1和图2。
3.8 结果 由表1和图2可以看出，8个厂家74批次丹参片中丹参酮ⅡA含量变化幅度较大，批间差异明显，最高含量为每片0.6533mg，最低含量为每片0.0484mg，最高者为最低者的13.5倍; B企业和F企业样品中丹参酮ⅡA含量明显高于其他企业;D企业和H企业样品中丹参酮ⅡA含量居中;A企业、C企业E企业和G企业样品中丹参酮ⅡA含量明显偏低;其中D和H企业存在明显的批间差异。
4 讨论
4.1 提取溶剂的选择 分别以甲醇、体积分数为50%甲醇、70%甲醇和90%甲醇超声提取30min。结果以甲醇提取效率最高，故选择甲醇为提取溶剂。
4.2 提取方法的选择 以甲醇为提取溶剂，分别进行超声15、30和60min及加热回流0.5、1和2h。实验结果表明，超声提取与加热回流提取效果相当，超声30min与60min效果相当，故提取方法确定为超声提取30min。
4.3 流动相种类的选择 分别以①甲醇-体积分数为0.1%的甲酸;②甲醇-体积分数为0.1%的磷酸;③乙腈-体积分数为0.1%的甲酸;④乙腈-体积分数为0.1%的磷酸;⑤甲醇-水;⑥乙腈-水对供试品溶液进行了含量测定。实验结果表明，采用甲醇-水作流动相效果最佳。
4.4 检测波长的选择 我们参考相关文献和中国药典，选用λ=270nm作为丹参酮ⅡA含量测定的检测波长。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：678.
[2]梁春，汤西双，任雨笙，等. 丹参片改善心脏X综合征患者临床症状及作用机制[J].上海医学，2007，30（5）：367-368.
[3]任雨笙，粱 春，吴宗贵，等.丹参片对稳定型心绞痛患者运动耐量的影响[J].上海医学，2007，30（3）：204-205.
[4]胡伟国，梁寿彭，虞种花，等.丹参片舌下含服对心肌缺血的影响[J]. 中国中西医结合杂志，2007，27（3）：279.
[5]姬晓鹏，蒋斌，潘琳，等. 复方丹参片与丹参片对冠状动脉粥样硬化患者血小板活化抑制作用的比铰[J]. 中国药房，2010，21（19）：1805-1806.
[6]何昱，成金乐，徐吉银，等. HPLC-DAD同时测定丹参中原儿茶醛、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮ⅡA四种成分的含量[J].世界科学技术—中医药现代化，2011，13（4）：688-691.
[7] 黎瓊红， 张国刚， 徐世义，等. 丹参药材脂溶性成分的HPLC指纹图谱[J].沈阳药科大学学报， 2006，23（1）：22-25.
[8]李倩，刘伟，罗祖良，等. 测多评法测定丹参中丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮I、二氢丹参酮I的含量[J].中国中药杂志，2012，37（6）：824-828.
[9]程茜菲.高效液相色谱法同时测定丹参中6种化学成分的含量[J]. 西北药学杂志，2016，31（6）：551-554.
[10]周维，胡昌江，戴德荣，等. 丹参饮片、标准水煎剂、配方颗粒HPLC特征图谱相关性研究[J]. 中国现代中药，2016，18（9）：1100-1103.
[11]周晓希，孔羽，魏宇昆，等. RP-HPLC-DAD同时测定丹参及丹参片中6种水溶性成分的含量[J].中药材，2014，37（2）：337-339.
[12]杨春智，徐玉红，李玉珍，等. 不同厂家复方丹参片的有效成分含量考察[J]. 中国药业，2012，21（8）：55-57.
[13]吕凤莲，宋韶锦，宋吉莲，等. 不同厂家复方丹参片的质量考察[J]. 时珍国医国药，2007，18（9）：2230-2231.
[14]尹爱群，刘群，邱明丰，等. 不同厂家复方丹参片中丹参酮ⅡA的含量测定[J]. 中国中药杂志，2006，31（20）：1729-1731.
（收稿日期：2019-05-09 编辑：程鹏飞）
【关键词】 丹参片;脂溶性成分;丹参酮ⅡA;高效液相色谱法;频数分布图;箱形图
【中图分类号】R286 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2019）15-0031-04
丹参片是《中国药典）一部收载的品种，具有活血化瘀的作用， 用于瘀血闭阻所致的胸痹，症见胸部疼痛、痛处固定、舌质紫暗;冠心病心绞痛见上述证候者[1-5]。军事训练伤急性损伤后期或软组织慢性损伤，有瘀斑或瘀血并伴肿痛，口服丹参片有活血化瘀及缓解肿痛的作用。研究表明，丹参中的活性成分主要有脂溶性的丹参酮类和水溶性的酚酸类成分[6-14]。丹参片在中国药典2015年版一部中的含量测定项为HPLC法测定丹参中丹酚酸B的含量，而丹参片的另一类主要成分即脂溶性成分未作相应的含量测定控制[1]。而且临床应用中发现，不同厂家生产的丹参片质量和疗效存在很大差异，为此，本实验运用HPLC法对本次国家评价性抽验的8个不同厂家74批次丹参片样品，在检测波长为270nm下对脂溶性成分丹参酮ⅡA的含量进行了测定研究。通过方法学验证，该方法操作简便、准确，重复性好，为丹参片的整体质量控制监管提供科学依据;并采用频数分布图和箱形图对其含量进行比较分析，现报道如下。
1 仪器与试药
高效液相色谱（HPLC）岛津LC20AT系统;天平：Mettler AE240电子天平（瑞士梅特勒公司）;对照品丹参酮ⅡA（批号：110766-201520标示量为98.9%）购自中国食品药品检定研究院;甲醇为色谱级（美国Merck公司），水为重蒸水（自制），其它试剂均为国产分析纯;丹参片为2015年国家评价性抽验抽取的样品。
2 溶液制备
2.1 对照品溶液 精密称取丹参酮ⅡA对照品22.36mg，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解
并稀释至刻度，再精密量取1mL，置100mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成每1mL含22.11μg的溶液，即得。
2.2 供试品溶液 取本品10片，糖衣片除去糖衣，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形
瓶中，精密加入甲醇溶液50mL，称定重量，超声处理30min（功率：280w;频率：40 kHz），
放冷至室温，再称定重量，用甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
2.3 阴性样品溶液 取缺丹参的丹参片阴性样品，按“2.2”项下的方法，制得阴性样品溶液，即得。
3 方法与结果
3.1 色谱条件 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Aglient C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱;流动相：甲醇-水（75∶25）; 柱温30℃;流速为1mL·min.-1;检测波长270nm。进样量：10μL。在此色谱条件下，丹参酮ⅡA对照品，样品和缺丹参的阴性样品的分离色谱图如图1所示。
3.2 线性关系考察 分别精密量取2.1项下配制的对照品溶液 1mL、1mL、1mL、2mL、3mL、20mL至25mL、10mL、5mL、5mL、5mL、25mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得线性关系各浓度对照品溶液。精密吸取上述各浓度对照品溶液10μL，注入液相色谱仪进行测定，以进样量（μg）为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，得到丹参酮ⅡA的回归方程为： y=3813.8x+36.125（R.2=1.0000）线性范围为0.00885～0.221μg。结果表明线性关系良好。
3.3 精密度试验 取对照品溶液③，连续进样6次，每次10μL，测定峰面积值，结果丹参酮ⅡA峰面积的RSD为0.01%。表明仪器精密度良好。
3.4 稳定性试验 取同一供试品溶液分别于0、2、4、12、16和24h进样10μL进行测定，结果丹参酮ⅡA峰面积的RSD为0.01%。表明供试品溶液中的待测成分丹参酮ⅡA在室温放置24h内基本稳定。
3.5 重复性试验 取同一批丹参片样品（批号：150305），按“2.2”项下的方法平行制得6份供试品溶液，在上述色谱条件下进样10μL进行测定并计算，结果平均含量值为1.037 mg·g.-1， RSD为和0.02%。表明其重复性良好。
3.6 回收率试验 取丹参片样品（批号：150305）适量，精密称取6份，每份约0.5g， 置具塞锥形瓶中，精密加入丹参酮ⅡA对照品溶液⑦ （质量浓度为176.91μg·mL.-1）3mL，再精密加入甲醇溶液50mL，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，进样10μL进行测定。结果丹参酮ⅡA平均回收率（n=6）为99.6%，RSD为0.02%。表明该方法的回收率良好。 3.7 样品的测定 取8个厂家74批次丹参片样品，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样10μL进行测定，计算含量，结果见表1和图2。
3.8 结果 由表1和图2可以看出，8个厂家74批次丹参片中丹参酮ⅡA含量变化幅度较大，批间差异明显，最高含量为每片0.6533mg，最低含量为每片0.0484mg，最高者为最低者的13.5倍; B企业和F企业样品中丹参酮ⅡA含量明显高于其他企业;D企业和H企业样品中丹参酮ⅡA含量居中;A企业、C企业E企业和G企业样品中丹参酮ⅡA含量明显偏低;其中D和H企业存在明显的批间差异。
4 讨论
4.1 提取溶剂的选择 分别以甲醇、体积分数为50%甲醇、70%甲醇和90%甲醇超声提取30min。结果以甲醇提取效率最高，故选择甲醇为提取溶剂。
4.2 提取方法的选择 以甲醇为提取溶剂，分别进行超声15、30和60min及加热回流0.5、1和2h。实验结果表明，超声提取与加热回流提取效果相当，超声30min与60min效果相当，故提取方法确定为超声提取30min。
4.3 流动相种类的选择 分别以①甲醇-体积分数为0.1%的甲酸;②甲醇-体积分数为0.1%的磷酸;③乙腈-体积分数为0.1%的甲酸;④乙腈-体积分数为0.1%的磷酸;⑤甲醇-水;⑥乙腈-水对供试品溶液进行了含量测定。实验结果表明，采用甲醇-水作流动相效果最佳。
4.4 检测波长的选择 我们参考相关文献和中国药典，选用λ=270nm作为丹参酮ⅡA含量测定的检测波长。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：678.
[2]梁春，汤西双，任雨笙，等. 丹参片改善心脏X综合征患者临床症状及作用机制[J].上海医学，2007，30（5）：367-368.
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[4]胡伟国，梁寿彭，虞种花，等.丹参片舌下含服对心肌缺血的影响[J]. 中国中西医结合杂志，2007，27（3）：279.
[5]姬晓鹏，蒋斌，潘琳，等. 复方丹参片与丹参片对冠状动脉粥样硬化患者血小板活化抑制作用的比铰[J]. 中国药房，2010，21（19）：1805-1806.
[6]何昱，成金乐，徐吉银，等. HPLC-DAD同时测定丹参中原儿茶醛、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮ⅡA四种成分的含量[J].世界科学技术—中医药现代化，2011，13（4）：688-691.
[7] 黎瓊红， 张国刚， 徐世义，等. 丹参药材脂溶性成分的HPLC指纹图谱[J].沈阳药科大学学报， 2006，23（1）：22-25.
[8]李倩，刘伟，罗祖良，等. 测多评法测定丹参中丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮I、二氢丹参酮I的含量[J].中国中药杂志，2012，37（6）：824-828.
[9]程茜菲.高效液相色谱法同时测定丹参中6种化学成分的含量[J]. 西北药学杂志，2016，31（6）：551-554.
[10]周维，胡昌江，戴德荣，等. 丹参饮片、标准水煎剂、配方颗粒HPLC特征图谱相关性研究[J]. 中国现代中药，2016，18（9）：1100-1103.
[11]周晓希，孔羽，魏宇昆，等. RP-HPLC-DAD同时测定丹参及丹参片中6种水溶性成分的含量[J].中药材，2014，37（2）：337-339.
[12]杨春智，徐玉红，李玉珍，等. 不同厂家复方丹参片的有效成分含量考察[J]. 中国药业，2012，21（8）：55-57.
[13]吕凤莲，宋韶锦，宋吉莲，等. 不同厂家复方丹参片的质量考察[J]. 时珍国医国药，2007，18（9）：2230-2231.
[14]尹爱群，刘群，邱明丰，等. 不同厂家复方丹参片中丹参酮ⅡA的含量测定[J]. 中国中药杂志，2006，31（20）：1729-1731.
（收稿日期：2019-05-09 编辑：程鹏飞）