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【摘要】 目的 观察马齿苋总黄酮对大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMC)增殖的抑制作用及机制。方法 由细胞计数、MTT法测定细胞增殖率，采用羟胺法、TBA方法分别测定培养液中SOD活性、MDA含量。结果 马齿苋总黄酮（16.0、32.0、64.0 μg/ml）以浓度依赖方式抑制RASMC增殖及抑制氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）诱导RASMC增殖，可诱导少量RASMC凋亡，马齿苋总黄酮预处理24 h后已出现明显的抗增殖作用，提高培养液中SOD活性、降低MDA含量。结论 马齿苋总黄酮具有抗RASMC增殖作用，该作用与提高SOD活性、降低MDA含量有关。
【关键词】 马齿苋总黄酮；主动脉平滑肌细胞；细胞增殖；氧化型低密度脂蛋白；SOD；MDA
文章编号：1003-1383(2007)03-0237-03
中图分类号：R 285.5 文献标识码：A
动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是一类严重威胁人类健康的常见病、多发病，是心脑血管疾病的重要病理基础，由AS诱发的心脑血管疾病是导致世界人口死亡的主要原因。近年来，心脑血管疾病的发病率、死亡率在我国一直呈明显上升的趋势。病理状态下，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle clls,VSMC）由收缩型转变为合成型后，迁移至内膜，大量增殖和分泌细胞外基质，由此导致血管增生重构，这是许多心血管疾病的重要病理变化［1］。研究VSMC的异常增殖机制，通过不同方式阻断其增殖途径是治疗心血管疾病的策略之一，抑制VSMC增殖是目前有效防治AS、高血压、血管再狭窄和延缓衰老的新途径。马齿苋是我国常用的传统中药，也是人们常作蔬菜食用的野菜。现代药理学研究证实，马齿苋具有抗氧化、抗血栓、降血脂［2］、增加膜脂流动性［3］，整体动物实验显示有抗AS作用［4］。马齿苋总黄酮对VSMC增殖作用的影响及其作用机制的影响，在国内外报道很少，因此，本文报道研究马齿苋总黄酮抗VSMC增殖作用及其机制，为寻找开发满意的抗VSMC增殖药物，为马齿苋用于防治AS、高血压、血管成形术后再狭窄等主要心血管疾病和延缓衰老提供科学理论依据。
材料与方法
1.药品和仪器 马齿苋总黄酮（PTF）由本实验室按文献方法［5］制备,实验前用DMEM调渗透压、pH值,储存在-20℃冰箱中备用，加药时在培养基中稀释到所需浓度,使二甲基亚砜（DMSO）占培养基中的终浓度不超过1%。丙二醛（malonyldiadehyde,MDA）和超氧化物歧化酶（supuroxide
※基金项目：湖南省教育厅资助项目(项目编号：05C628)
作者简介：卢新华（1957-），男，湖南省郴州市人，高级实验师。 dismutase,SOD）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。胎牛血清（FBS）为杭州四季清生物材料有限公司产品，DMEM培养基为美国Gibco公司产品。MTT和DMSO为美国sigma公司产品。HH.CPTW水套式二氧化碳培养箱（上海福玛实验仪器有限公司），1×70荧光倒置相差显微镜（olympus公司,日本）,C×7 Delta 生化仪（Beckmom,美国）。
2.实验动物 雄性SpraqueDawley大鼠一只,8-10 W,100-150 g,由中南大学实验动物科学部提供。
3.大鼠主动脉的平滑肌细胞(RASMC)的原代培养、传代培养与鉴定［6］ 采用组织块种植法进行RASMC原代培养，无菌条件下取出大鼠胸动脉Hanks液洗涤,剪成25 mm×30 mm的血管段,放入10%FBS DMEM培养液(含1×105u·L-1青霉素,100 mg·L-1链霉素,25 mmol·L-1HEPES),剥离外膜,将动脉纵行剪开,刮去内膜,剪成1 mm3左右的组织块,移入培养瓶,于37℃孵箱静置培养。每三天更换一次培养液，待细胞生长融合出现“峰与谷”结构时,用0.05%胰蛋白酶(含0.02%EDTANa)消化,首次传代按1∶1,以后每隔3～5天按1∶3传代，经形态学和免疫组化鉴定为平滑肌细胞,实验用第5～10代细胞。
4.氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)分离提取［7］ LDL(α=1019～1060 g/ml)用序列超速离心方法分离正常人血浆获得，在0.005M Nacl，0.02%EDTA，pH7.4盐溶液中充氮透析48 h，4℃保存备用,在使用前透析48 h去除EDTA获得LDL。LDL在含10 μmmol/L,pH7.4 PBS中透析5 h，获得oxLDL，与非氧化LDL电泳速度为15∶1。
5.PTF对RVSMC增殖的影响
(1)RVSMC计数：取生长稳定80%～90%融合的VSMC,消化后以相同密度接种于24孔培养板,1×106/孔,1 ml/孔37℃培养24 h,更换含0.5%FBS的DMEM培养液培养48 h,细胞同步化。实验分组:空白对照组(含0.5%DMSO), PTF组：2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μg/ml。每组6个复孔，各组均用10%FBS DMEM培养液配制,加药后孵育72 h,终止反应,胎盼蓝(trypam blue)染色,活细胞计数,实验重复3次。
(2)MTT法：取传代培养5～10代RASMC 1×106/孔接种于96孔培养瓶中培养，实验分组剂量同(1)，每组6孔。培养24 h后每孔分别加入不同剂量的PTF，培养48 h后加入MTT液(20 μl/孔),继续培养4 h,吸出孔内培养基后,加入DMSO，终止反应,室温下振荡10 min，使结晶溶解，置酶标仪在吸收波长570 mm条件下测定吸光度值。
(3)PTF对oxLDL促平滑肌细胞增殖作用的影响：取传代培养5～10代的RASMC（1×106/孔）接种于96孔培养瓶中,培养24 h后每孔分别加入不同剂量的PTF (64.0、32.0、16.0、8.0 μg/ml)，每组6孔,每孔均加入oxLDL(10 μgLDL蛋白/ml)3 ml，空白对照组的细胞培养液中不加马齿苋总黄酮及oxLDL，oxLDL组的细胞培养液中加入相同剂量的oxLDL，培养48 h后用MTT法测定细胞数量。
6.PTF对RASMC计数时效关系的影响 取生长稳定80%～90%融合的RASMC,消化后以相同密度接种于24孔培养板，3×106/孔，1 ml/孔，37℃培养24 h。更换含0.5%FBS的DMEM培养液，培养48 h，细胞同步化，实验分组：①对照组（10%FBS DMEM 培养液配制）,②PTF组（PTF 32.0 μg/ml， DMEM配制），③oxLDL组（10 mgLDL蛋白/ml,DMEM配制），④PTF＋oxLDL组（同②、③），每组6个复孔,分别于孵育24 h,48 h，72 h终止反应,胎盼蓝染色,活细胞计数,实验重复3次。
7.PTF对RASMC凋亡的影响 取传代培养5～10代的RASMC（2×106/ml）接种于100 ml培养瓶中,48 h后给药。分4个组,第1～3组为PTF诱导细胞凋亡组（培养液中PTF浓度分别为128.0 μg/ml、64.0 μg/ml、32.0 μg/ml）, 第4组为空白对照组，每组3瓶。给药28 h后收获细胞，用Y啶橙结合台胎蓝染色观察细胞凋亡情况。
8.培养液中SOD、MDA含量测定 选用生长良好的第4～5代RASMC，调整细胞密度为2×105/ml，接种在小培养皿内的盖玻片上,每片0.1 ml，让其贴壁后从培养皿周边加培养液至15 ml,置培养箱中培养，待细胞生长成片状时,分为两组给以不同条件培养，对照组不加药, PTF组（终浓度为每ml培养液中含PTF 48.0 μg）,培养24 h后收集培养液,离心10 min（1000 r/min）。取上清液作为待测样品, 测定超氧化物歧化酶（SOD）活性和脂质过氧化物的稳定产物丙二醛（MDA）含量，按试剂盒方法测定。
9.统计学处理 所有实验数据均采用-±s表示，组间差异比较采用t检验。
结果
1.PTF对RVSMC增殖的影响 PTF 2.0、4.0、8.0 μg/ml剂量组与空白对照组比较无统计学意义(P>0.05)；剂量增加到 16.0、32.0、64.0 μg/ml时，抑制RASMC增殖作用与空白对照组比较有显著性差异（P<0.05或P<0.01），且存在明显的剂量效应关系。见表1。
2.PTF对oxLDL促RASMC增殖作用的影响 PTF 64.0、32.0、16.0 μg/ml剂量组对oxLDL促RASMC增殖具有显著的抑制作用，此抑制作用与oxLDL组比较有显著差异（P<0.05或P<0.01），能浓度依赖性地降低其数量；oxLDL具有显著的促RASMC增殖作用，与空白对照组比较有显著性差异（P<0.01）。见表2。
3.PTF对RASMC计数时效关系的影响 从PTF抑制oxLDL促RASMC增殖的时效关系显示,PTF预处理24～72 h，RASMC增殖数量比oxLDL组低，分别是oxLDL组的47.5%、32.6%、24.2%，能时间依赖性地抑制其生长。从RASMC计数时效关系显示，PTF预处理24～72 h，RASMC增殖数量比对照组低，分别是对照组的42.4%、35.3%、28.7%，能时间依赖性地抑制其生长，结果提示PTF孵育24 h已出现明显的抗增殖作用。
4.PTF对RASMC凋亡的影响 PTF 128.0 μg/ml、64.0 μg/ml、32.0 μg/ml剂量组的RASMC胎盼蓝着色百分率分别为(54.0±6.72)%，(10.45±2.43)%，(6.12±1.30)%，空白对照组的RASMC胎盼蓝着色百分率为(4.74±1.84)%；PTF 128.0 μg/ml、64.0 μg/ml、32.0 μg/ml剂量组的RASMC凋亡率分别为6.5%，4.7%，5.1%，空白对照组的RASMC凋亡率为0.8%；PTF组与空白对照组比较有显著差异（P<0.05）；PTF 64.0 μg/ml时，形态学观察未见明显的细胞形态变化。
5.PTF对培养液中SOD、MDA含量的影响 PTF预处理24 h后培养液中SOD含量明显高于空白对照组，MDA含量明显低于空白对照组，PTF组与空白对照组比较具有显著性差异（P<0.05）。见表3。
讨论
动脉粥样硬化（AS）是严重威胁人类健康的疾病之一,其发生机制十分复杂,在导致动脉粥样硬化的诸多危险因素中,一般认为高血脂症通过损伤血管内皮细胞,促进SMC异常增殖等作用而成为导致AS的重要致病因素，在AS的发生与发展中,VSMC的增殖、迁移及表型转变起着十分重要的作用,因而研究寻找抗VSMC增殖，特别是能够抑制oxLDL刺激的VSMC异常增殖的药物将具有重要意义。
研究发现氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）可促使血管平滑肌细胞由收缩转变为合成型，并有促使平滑肌细胞迁移和游走作用，可诱发一系列与细胞增殖有关的反应如SIS、JUN和RAS的表达增加，还可促使血管壁细胞合成内皮素、血小板源生长因子，激活蛋白激酶C，促使VSMC增殖［8］。本文实验结果显示oxLDL具有促使大鼠血管平滑肌细胞增殖作用，PTF能明显抑制oxLDL促大鼠血管平滑肌细胞增殖作用，同时也具有直接抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖作用，在一定剂量范围内呈现明显的剂量依赖性，能诱导少量大鼠血管平滑肌细胞凋亡。
近年研究发现，氧自由基能明显增强血管平滑肌细胞的SIS基因表达，促使大鼠血管平滑肌细胞增殖，活化的血管平滑肌细胞还可释放氧自由基，氧自由基易作用于膜脂质引起脂质过氧化，产生大量脂质过氧化物(LPO)，LPO能刺激中膜平滑肌细胞转入内膜增生。本文实验结果显示，PTF组培养液中SOD含量明显提高，MDA含量明显降低。结果提示，马齿苋总黄酮有抗RASMC增殖作用，该作用与提高SOD活性、降低MDA含量有关。但有关马齿苋总黄酮抗VSMC增殖作用及其机制的研究有待进一步探讨。
致谢：本实验研究承蒙中南大学湘雅医学院陈钢等老师的大力支持，在此致以衷心的感谢。
本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
【关键词】 马齿苋总黄酮；主动脉平滑肌细胞；细胞增殖；氧化型低密度脂蛋白；SOD；MDA
文章编号：1003-1383(2007)03-0237-03
中图分类号：R 285.5 文献标识码：A
动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是一类严重威胁人类健康的常见病、多发病，是心脑血管疾病的重要病理基础，由AS诱发的心脑血管疾病是导致世界人口死亡的主要原因。近年来，心脑血管疾病的发病率、死亡率在我国一直呈明显上升的趋势。病理状态下，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle clls,VSMC）由收缩型转变为合成型后，迁移至内膜，大量增殖和分泌细胞外基质，由此导致血管增生重构，这是许多心血管疾病的重要病理变化［1］。研究VSMC的异常增殖机制，通过不同方式阻断其增殖途径是治疗心血管疾病的策略之一，抑制VSMC增殖是目前有效防治AS、高血压、血管再狭窄和延缓衰老的新途径。马齿苋是我国常用的传统中药，也是人们常作蔬菜食用的野菜。现代药理学研究证实，马齿苋具有抗氧化、抗血栓、降血脂［2］、增加膜脂流动性［3］，整体动物实验显示有抗AS作用［4］。马齿苋总黄酮对VSMC增殖作用的影响及其作用机制的影响，在国内外报道很少，因此，本文报道研究马齿苋总黄酮抗VSMC增殖作用及其机制，为寻找开发满意的抗VSMC增殖药物，为马齿苋用于防治AS、高血压、血管成形术后再狭窄等主要心血管疾病和延缓衰老提供科学理论依据。
材料与方法
1.药品和仪器 马齿苋总黄酮（PTF）由本实验室按文献方法［5］制备,实验前用DMEM调渗透压、pH值,储存在-20℃冰箱中备用，加药时在培养基中稀释到所需浓度,使二甲基亚砜（DMSO）占培养基中的终浓度不超过1%。丙二醛（malonyldiadehyde,MDA）和超氧化物歧化酶（supuroxide
※基金项目：湖南省教育厅资助项目(项目编号：05C628)
作者简介：卢新华（1957-），男，湖南省郴州市人，高级实验师。 dismutase,SOD）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。胎牛血清（FBS）为杭州四季清生物材料有限公司产品，DMEM培养基为美国Gibco公司产品。MTT和DMSO为美国sigma公司产品。HH.CPTW水套式二氧化碳培养箱（上海福玛实验仪器有限公司），1×70荧光倒置相差显微镜（olympus公司,日本）,C×7 Delta 生化仪（Beckmom,美国）。
2.实验动物 雄性SpraqueDawley大鼠一只,8-10 W,100-150 g,由中南大学实验动物科学部提供。
3.大鼠主动脉的平滑肌细胞(RASMC)的原代培养、传代培养与鉴定［6］ 采用组织块种植法进行RASMC原代培养，无菌条件下取出大鼠胸动脉Hanks液洗涤,剪成25 mm×30 mm的血管段,放入10%FBS DMEM培养液(含1×105u·L-1青霉素,100 mg·L-1链霉素,25 mmol·L-1HEPES),剥离外膜,将动脉纵行剪开,刮去内膜,剪成1 mm3左右的组织块,移入培养瓶,于37℃孵箱静置培养。每三天更换一次培养液，待细胞生长融合出现“峰与谷”结构时,用0.05%胰蛋白酶(含0.02%EDTANa)消化,首次传代按1∶1,以后每隔3～5天按1∶3传代，经形态学和免疫组化鉴定为平滑肌细胞,实验用第5～10代细胞。
4.氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)分离提取［7］ LDL(α=1019～1060 g/ml)用序列超速离心方法分离正常人血浆获得，在0.005M Nacl，0.02%EDTA，pH7.4盐溶液中充氮透析48 h，4℃保存备用,在使用前透析48 h去除EDTA获得LDL。LDL在含10 μmmol/L,pH7.4 PBS中透析5 h，获得oxLDL，与非氧化LDL电泳速度为15∶1。
5.PTF对RVSMC增殖的影响
(1)RVSMC计数：取生长稳定80%～90%融合的VSMC,消化后以相同密度接种于24孔培养板,1×106/孔,1 ml/孔37℃培养24 h,更换含0.5%FBS的DMEM培养液培养48 h,细胞同步化。实验分组:空白对照组(含0.5%DMSO), PTF组：2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μg/ml。每组6个复孔，各组均用10%FBS DMEM培养液配制,加药后孵育72 h,终止反应,胎盼蓝(trypam blue)染色,活细胞计数,实验重复3次。
(2)MTT法：取传代培养5～10代RASMC 1×106/孔接种于96孔培养瓶中培养，实验分组剂量同(1)，每组6孔。培养24 h后每孔分别加入不同剂量的PTF，培养48 h后加入MTT液(20 μl/孔),继续培养4 h,吸出孔内培养基后,加入DMSO，终止反应,室温下振荡10 min，使结晶溶解，置酶标仪在吸收波长570 mm条件下测定吸光度值。
(3)PTF对oxLDL促平滑肌细胞增殖作用的影响：取传代培养5～10代的RASMC（1×106/孔）接种于96孔培养瓶中,培养24 h后每孔分别加入不同剂量的PTF (64.0、32.0、16.0、8.0 μg/ml)，每组6孔,每孔均加入oxLDL(10 μgLDL蛋白/ml)3 ml，空白对照组的细胞培养液中不加马齿苋总黄酮及oxLDL，oxLDL组的细胞培养液中加入相同剂量的oxLDL，培养48 h后用MTT法测定细胞数量。
6.PTF对RASMC计数时效关系的影响 取生长稳定80%～90%融合的RASMC,消化后以相同密度接种于24孔培养板，3×106/孔，1 ml/孔，37℃培养24 h。更换含0.5%FBS的DMEM培养液，培养48 h，细胞同步化，实验分组：①对照组（10%FBS DMEM 培养液配制）,②PTF组（PTF 32.0 μg/ml， DMEM配制），③oxLDL组（10 mgLDL蛋白/ml,DMEM配制），④PTF＋oxLDL组（同②、③），每组6个复孔,分别于孵育24 h,48 h，72 h终止反应,胎盼蓝染色,活细胞计数,实验重复3次。
7.PTF对RASMC凋亡的影响 取传代培养5～10代的RASMC（2×106/ml）接种于100 ml培养瓶中,48 h后给药。分4个组,第1～3组为PTF诱导细胞凋亡组（培养液中PTF浓度分别为128.0 μg/ml、64.0 μg/ml、32.0 μg/ml）, 第4组为空白对照组，每组3瓶。给药28 h后收获细胞，用Y啶橙结合台胎蓝染色观察细胞凋亡情况。
8.培养液中SOD、MDA含量测定 选用生长良好的第4～5代RASMC，调整细胞密度为2×105/ml，接种在小培养皿内的盖玻片上,每片0.1 ml，让其贴壁后从培养皿周边加培养液至15 ml,置培养箱中培养，待细胞生长成片状时,分为两组给以不同条件培养，对照组不加药, PTF组（终浓度为每ml培养液中含PTF 48.0 μg）,培养24 h后收集培养液,离心10 min（1000 r/min）。取上清液作为待测样品, 测定超氧化物歧化酶（SOD）活性和脂质过氧化物的稳定产物丙二醛（MDA）含量，按试剂盒方法测定。
9.统计学处理 所有实验数据均采用-±s表示，组间差异比较采用t检验。
结果
1.PTF对RVSMC增殖的影响 PTF 2.0、4.0、8.0 μg/ml剂量组与空白对照组比较无统计学意义(P>0.05)；剂量增加到 16.0、32.0、64.0 μg/ml时，抑制RASMC增殖作用与空白对照组比较有显著性差异（P<0.05或P<0.01），且存在明显的剂量效应关系。见表1。
2.PTF对oxLDL促RASMC增殖作用的影响 PTF 64.0、32.0、16.0 μg/ml剂量组对oxLDL促RASMC增殖具有显著的抑制作用，此抑制作用与oxLDL组比较有显著差异（P<0.05或P<0.01），能浓度依赖性地降低其数量；oxLDL具有显著的促RASMC增殖作用，与空白对照组比较有显著性差异（P<0.01）。见表2。
3.PTF对RASMC计数时效关系的影响 从PTF抑制oxLDL促RASMC增殖的时效关系显示,PTF预处理24～72 h，RASMC增殖数量比oxLDL组低，分别是oxLDL组的47.5%、32.6%、24.2%，能时间依赖性地抑制其生长。从RASMC计数时效关系显示，PTF预处理24～72 h，RASMC增殖数量比对照组低，分别是对照组的42.4%、35.3%、28.7%，能时间依赖性地抑制其生长，结果提示PTF孵育24 h已出现明显的抗增殖作用。
4.PTF对RASMC凋亡的影响 PTF 128.0 μg/ml、64.0 μg/ml、32.0 μg/ml剂量组的RASMC胎盼蓝着色百分率分别为(54.0±6.72)%，(10.45±2.43)%，(6.12±1.30)%，空白对照组的RASMC胎盼蓝着色百分率为(4.74±1.84)%；PTF 128.0 μg/ml、64.0 μg/ml、32.0 μg/ml剂量组的RASMC凋亡率分别为6.5%，4.7%，5.1%，空白对照组的RASMC凋亡率为0.8%；PTF组与空白对照组比较有显著差异（P<0.05）；PTF 64.0 μg/ml时，形态学观察未见明显的细胞形态变化。
5.PTF对培养液中SOD、MDA含量的影响 PTF预处理24 h后培养液中SOD含量明显高于空白对照组，MDA含量明显低于空白对照组，PTF组与空白对照组比较具有显著性差异（P<0.05）。见表3。
讨论
动脉粥样硬化（AS）是严重威胁人类健康的疾病之一,其发生机制十分复杂,在导致动脉粥样硬化的诸多危险因素中,一般认为高血脂症通过损伤血管内皮细胞,促进SMC异常增殖等作用而成为导致AS的重要致病因素，在AS的发生与发展中,VSMC的增殖、迁移及表型转变起着十分重要的作用,因而研究寻找抗VSMC增殖，特别是能够抑制oxLDL刺激的VSMC异常增殖的药物将具有重要意义。
研究发现氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）可促使血管平滑肌细胞由收缩转变为合成型，并有促使平滑肌细胞迁移和游走作用，可诱发一系列与细胞增殖有关的反应如SIS、JUN和RAS的表达增加，还可促使血管壁细胞合成内皮素、血小板源生长因子，激活蛋白激酶C，促使VSMC增殖［8］。本文实验结果显示oxLDL具有促使大鼠血管平滑肌细胞增殖作用，PTF能明显抑制oxLDL促大鼠血管平滑肌细胞增殖作用，同时也具有直接抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖作用，在一定剂量范围内呈现明显的剂量依赖性，能诱导少量大鼠血管平滑肌细胞凋亡。
近年研究发现，氧自由基能明显增强血管平滑肌细胞的SIS基因表达，促使大鼠血管平滑肌细胞增殖，活化的血管平滑肌细胞还可释放氧自由基，氧自由基易作用于膜脂质引起脂质过氧化，产生大量脂质过氧化物(LPO)，LPO能刺激中膜平滑肌细胞转入内膜增生。本文实验结果显示，PTF组培养液中SOD含量明显提高，MDA含量明显降低。结果提示，马齿苋总黄酮有抗RASMC增殖作用，该作用与提高SOD活性、降低MDA含量有关。但有关马齿苋总黄酮抗VSMC增殖作用及其机制的研究有待进一步探讨。
致谢：本实验研究承蒙中南大学湘雅医学院陈钢等老师的大力支持，在此致以衷心的感谢。
本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。