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摘 要：無菌的猕猴桃种子是猕猴桃胚乳培养、实生苗微嫁接等技术的基础材料，利用消毒剂灭菌是常用的无菌种子采集手段，应用最广泛的消毒剂为升汞（mercuric chloride）和次氯酸钠（NaClO）。为了避免使用消毒剂，该研究提出了一种新的无菌猕猴桃种子采集方法——无菌搅拌法，同时为探索其准确性和应用性，比较了0.2%升汞灭菌20 min、10%次氯酸钠灭菌20 min、无菌搅拌法三种方式采集无菌猕猴桃种子的效果，并对种子萌发和幼苗形成的影响进行了研究。结果表明：无菌搅拌法、0.2%升汞灭菌20 min是稳定有效的无菌猕猴桃采集方式，10%次氯酸钠灭菌20 min的采集效果不稳定;在相同的时间内，无菌搅拌法的种子发芽率最高，为89.90%，但发芽势较低，均可正常成苗;10%次氯酸钠灭菌20 min的发芽率次之，与无菌搅拌法的种子无显著差异，发芽势和成苗率最高，分别为47.47%和67.86%，且有打破猕猴桃种子休眠的作用，整体作用类似于赤霉素（GA3）浸种的效果;0.2%升汞灭菌20 min对猕猴桃种子的萌发有抑制作用，各项指标均显著低于无菌搅拌法种子，且生长缓慢。此外，无菌搅拌法是物理处理，对种子、操作人员、环境均无害。这证实了无菌搅拌法的实用性和优势，发现了次氯酸钠在打破猕猴桃种子休眠方面的作用，为其它同类型果实的无菌种子采集提供了参考。
关键词：种子， 猕猴桃， 无菌， 萌发， 搅拌
中图分类号：Q945.6
文献标识码：A
文章编号：1000-3142（2019）04-0472-10
Abstract：Aseptic seeds of kiwifruit is fundamental tested material of endosperm culture， micro-grafting and other researches. It is a usual way to gather aseptic seeds to usedisinfectant to sterilize. Among them， mercuric chloride and NaClO are the most widely useddisinfectants. This article showed that aseptic stirring method is a new method to obtain aseptic seeds of kiwifruit. In order to explore accuracy and applicability of aseptic stirring method， kiwifruit seeds were used to study the effects of three methods， including 0.2% mercuric chloride sterilization for 20 min， 10% NaClO sterilization for 20 min， aseptic stirring method， and their effects on seed germination and plant growth. The results showed that aseptic stirring method and 0.2% mercuric chloride sterilization for 20 min were an effective and reproductive way for gathering aseptic seeds of kiwifruit. Oppositely， gathering aseptic seeds of kiwifruit which in 10% NaClO sterilization for 20 min was unstable. The results also showed that the three methods were effective， and at the same time， seed germination rate of aseptic stirring method was the highest. And the rate was 89.90%， but its germination energy was lower， sprouts could grow healthily， germination rate of seeds with 10% NaClO sterilization for 20 min was the second place， but there was no significantdifference in germination rate of seeds between 10% NaClO sterilization for 20 min and aseptic stirring method， its germination energy and seedling rate were the highest which were 47.47% and 67.86% respectively， and could give the seed a premature start and also could break effectively thedormancy of kiwifruit seeds like GA3. And 0.2% mercuric chloride sterilization for 20 min inhibited germination of kiwifruit seeds， the various index was significantly lower than aseptic stirring method， sprouts grew slowly， most of the seeds could notdevelop into young seedlings within the allotted time. In addition， aseptic stirring method was a physical method， and it was harmless for seeds， workers and environment. The study indicated that the practicality and advantage of aseptic stirring method， and found the ability of NaClO to break thedormancy of kiwifruit seeds， which provided a reference for the obtaining aseptic seeds of other same type of fruits. Key words：seeds， kiwifruit， aseptic， germination， stirring
种子是种子植物的繁殖体，对延续物种起着重要作用。猕猴桃是猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属（Actinidia）的多年生藤本植物（吴秀华等，2013），原产地在中国，现已在世界范围内广泛种植（Belrose， 2009），果实可口且营养丰富，因维生素 C 含量高而被誉为“水果之王”，根、茎、叶、花均可入药，可谓‘全身是宝’（周玲艳等，2013）。猕猴桃种子数量多、体积小，镶嵌在果肉中，影响果实的口感和部分产品的加工（如果汁等）。为得到无籽猕猴桃果实，许多学者进行了深入研究。被子植物的胚乳培养是获取不育植株的重要手段，目前已在西番莲（张琴等，2000）、杨桃（吴清等，2002）、枇杷（彭晓军和王永清，2002）等果树研究中广泛应用;猕猴桃的胚乳培养也有很大进展，且已获得了三倍体植株（林颖等，2012）。猕猴桃种质资源具有丰富的多样性（王发明等，2018），但童期长，基因高度杂合（叶开玉等，2012），现阶段的繁殖手段多为实生嫁接法，周期长且创伤易感染溃疡病。微嫁接技术是组织培养和嫁接技术的结合，目前在葡萄（郝新意，2017）、苹果（周瑞金等，2007）等果树上广泛应用，利用种子在无菌培养基上培育实生苗，再无菌嫁接优良品种，可缩短繁殖周期、提高成活率、避免溃疡病感染。
上述两种技术都需要无菌的猕猴桃种子为基础材料。常用的猕猴桃无菌种子是利用消毒剂杀菌获得，升汞、次氯酸钠是使用最多的消毒剂。实际上，猕猴桃正常完整果实的内部是无菌环境，种子被无菌的果肉包裹，也是无菌的。为避免在取种时将种子暴露在有菌环境中，去掉不必要的工作量，直接采集无菌猕猴桃种子，本研究提出了一种新的无菌猕猴桃种子采集方法——无菌搅拌法，避免了使用消毒剂，优化了胚乳培养、微嫁接技术的前期工作。
1 材料与方法
1.1 材料
选取6个猕猴桃品种的果实作为供试材料，分别为‘贵长’‘红阳’‘徐香’‘翠香’‘Hort 16A’‘海沃德’，由超市购买或从西峡县猕猴桃种植果园中采集。
1.2 方法
1.2.1 试验条件 所用的培养基均为MS培养基，试验地点在南阳师范学院植物培养室，培养基、磁力搅拌子、去离子水、果酱瓶等均用高压蒸汽灭菌锅灭菌，赤霉素用0.2 μm的微孔滤膜过滤除菌，温度控制在25 ℃左右，每天的光照时间为12 h，光照强度在1 500～2 000 lx之间，试验除了“无菌种子采集方式效果的稳定性测定”这一步外，其余工作均在12月份开始。
1.2.2 无菌种子采集
1.2.2.1 无菌搅拌法 在试验中，先选取‘贵长’‘Hort 16A’‘翠香’猕猴桃完全成熟的完整果实，用无菌搅拌法采集种子，具体步骤如下：在超净工作台中，把猕猴桃果实放在无菌滤纸上，先用酒精棉球擦拭果实表面，再用无菌的镊子和手术刀做剥皮处理。剥皮的过程中应多次在酒精灯上灼烧镊子、手术刀与果皮接触的部分，保证其始终无菌。剥皮后的果肉先移放到另一张无菌滤纸上，用灼烧过的手术刀削去表面的果肉，然后放入无菌的果酱瓶中，用无菌镊子捣碎，加入无菌水至果酱瓶体积的2/3，拧紧瓶盖，置于磁力搅拌器上搅拌3
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5 min，静置，观察种子与果肉的分离状况，再用无菌水冲走果肉碎屑，留下猕猴桃种子。采集的猕猴桃种子在超净工作台上直接接种于MS培养基，每个培养基上接种6粒，接种10个培养基，共接60粒种子，20d时观察种子的污染状况，记录数据，待第一粒种子萌发后第20天停止观察，记录种子的萌芽是否带菌。无菌搅拌法采集的‘贵长’‘Hort 16A’‘翠香’三个品种的种子分别标记为A1、A2、A3。同时，试验设置有菌环境中，用磁力搅拌器搅拌采集的‘贵长’‘Hort 16A’‘翠香’猕猴桃种子作为对照组，分别标记为CK1、CK2、CK3，与无菌搅拌法采集的种子比较。为进一步证实无菌搅拌法的可靠性，试验再选用‘徐香’‘海沃德’‘红阳’三个品种猕猴桃作为无菌搅拌法的供试材料，获取种子，具体观察记录方式与无菌搅拌法一致。
1.2.2.2 消毒剂灭菌 试验选用的消毒剂为升汞、次氯酸钠，浓度分别为0.2%、10%，滅菌时间为20 min，这也是文献中应用过的有效灭菌处理。消毒剂灭菌所用的种子是通过常规取种方式采集的，即选择‘贵长’‘Hort 16A’‘翠香’猕猴桃完全成熟的完整果实，在有菌环境中挤出果肉，利用纱布包裹后反复淘洗，去掉果肉和漂浮于水面的空瘪种子，留下饱满种子。升汞灭菌后的 ‘贵长’‘Hort 16A’‘翠香’种子分别标记为B1、B2、B3，次氯酸钠灭菌后的‘贵长’‘Hort 16A’‘翠香’种子分别标记为C1、C2、C3。灭菌后的猕猴桃种子在超净工作台上直接接种于MS培养基，每个培养基上接种6粒，接种10个培养基，共接60粒种子，20d时观察种子的污染状况，记录数据，待第一粒种子萌发后第20天停止观察，记录种子的萌芽是否带菌。
1.2.2.3 无菌种子采集方式效果的稳定性测定 为了更好地确定无菌搅拌法和消毒剂灭菌的效果，以‘贵长’猕猴桃的果实为材料，分别用这两种方式在12月、1月、2月、3月分别采集一次无菌猕猴桃种子，观察记录方式与上述（1）、（2）一致。
1.2.3 种子萌发培养 培养种子萌发和观察芽的生长状况主要是用于分析两种无菌种子采集方式各自的优缺点，进一步验证无菌搅拌法的实用性。以‘贵长’猕猴桃果实为材料，进行以下研究。
1.2.3.1 无菌种子的直接培养 试验用无菌搅拌法、0.2%升汞灭菌20 min、10%次氯酸钠灭菌20 min采集的无菌种子接种于MS培养基，使其自然萌芽生长，以10d为一个单位，观察一次种子的萌发情况，待种子萌发结束后观察成苗情况（长出真叶的芽为成苗），观察时长为50d。试验设3次重复，每次重复33粒左右。 1.2.3.2 赤霉素处理 试验用无菌搅拌法、0.2%升汞灭菌20 min采集的无菌种子，在浓度为25 mg·L-1的赤霉素中分别浸种0、5、8、15、20、24 h，无菌搅拌法种子按顺序标记为D1、D2、D3、D4、D5、D6，升汞灭菌的种子按顺序标记为D7、D8、D9、D10、D11、D12。经赤霉素处理后的无菌种子于MS培养基上培养，观察记录种子的萌发、生长等情况，时长为50d。设置3次重复，每次重复31粒左右。发芽率=最终发芽的种子数/供试种子数
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100%;发芽势=试验前20d发芽种子数/供试种子数100%;成苗率=试验结束时萌芽的成苗数/供试种子数100%。
1.2.4 统计学分析 采用Excel 2013软件整理数据和制作图表，用SPSS 22.0统计软件作统计学分析，用one-way ANOVAduncan法完成多重比较。
2 结果与分析
2.1 无菌搅拌法的无菌猕猴桃种子采集效果
无菌搅拌法可顺利采集猕猴桃种子（图1：A、D），搅拌果肉时可清楚观察到种子与果肉分离（图1：B），静置后饱满的种子沉在果酱瓶底部，空瘪种子漂浮在去离子水上部（图1：C），表明无菌搅拌法是一种可靠的猕猴桃种子采集方法。
利用无菌搅拌法采集‘贵长’‘Hort 16A’‘翠香’三个猕猴桃品种无菌种子的效果如表1所示。三个品种的对照组种子全部污染，确认污染的时间在310d之间;无菌搅拌法采集的三个猕猴桃品种种子接种于MS培养基，经20d的观察，‘贵长’‘Hort 16A’两个品种各有1粒种子污染，确认污染的时间分别在第7天、第6天，‘翠香’的种子无污染产生。三个品种的对照组由于种子全部污染，因此无萌芽产生，而无菌搅拌法组中，三个品种的种子开始萌发时间并无显著差异，均在1316d之间，因此对萌芽污染情况的观察时间统一至第36天结束，所有的种子萌芽均不带菌。可见，无菌搅拌法是可以用来采集无菌猕猴桃种子的，试验中出现的2粒种子污染应该是试验操作不严谨造成的。
在试验中为了确认表1中出现的2粒种子污染不是方法本身的问题，本研究选用‘徐香’‘红阳’‘海沃德’三个猕猴桃品种为材料，利用无菌搅拌法取种，具体采集效果如表2所示。采集的三个猕猴桃品种种子是无菌的，经20d观察，无污染产生，种子的开始发芽时间‘徐香’约在第14天，‘红阳’约在第16天，‘海沃德’约在第14天，因此对萌芽的观察时间分别持续至第34、36、34天，种子的萌芽也无污染现象。可见，表1中的2粒种子污染与无菌搅拌法本身并无关联，无菌搅拌法是一种可靠的无菌猕猴桃种子采集方法。
2.2 消毒剂灭菌采集无菌猕猴桃种子的效果
消毒剂灭菌采集无菌猕猴桃种子的效果如表3所示。对于‘贵长’‘Hort 16A’‘翠香’三个品种的种子，经0.2%升汞处理20 min和10%次氯酸钠处理20 min后在20d内均无细菌或真菌污染，每种处理的60粒种子都是无菌的。0.2%升汞处理20 min后的种子开始发芽较晚，‘贵长’大约在第17天，‘Hort 16A’大约在第18天，‘翠香’大约在第16天，对萌芽污染情况的观察分别至第37天、第38天、第36天结束，萌芽均不带菌。10%次氯酸钠处理20 min后的种子开始发芽有所时间提前，‘贵长’大约在第11天，‘Hort 16A’ 大约在第12天，‘翠香’大约在第11天，对萌芽污染情况的观察分别至第31天、第32天、第31天结束，萌芽均不带菌。可见，消毒剂灭菌也能采集无菌猕猴桃种子。
2.3 不同无菌猕猴桃种子采集方式效果的稳定性
不同无菌猕猴桃种子采集方式效果的稳定性测定效果如表4所示。无菌搅拌法在12月采集的无菌 ‘贵长’猕猴桃种子有1粒污染， 其余3个月
无污染;0.2% 升汞20 min处理在4次无菌‘贵长’猕猴桃种子采集中均无污染产生;10% 次氯酸钠20 min处理在12月、1月两次无菌‘贵长’猕猴桃种子采集中无污染现象，而在2月时有7粒污染，3月有11粒种子污染。在2.1中已经证明‘贵长’猕猴桃的那1粒种子污染与无菌搅拌法本身无关，因此无菌搅拌法和0.2% 升汞20 min处理都是效果比较稳定的猕猴桃无菌种子的采集方式，10% 次氯酸钠20 min处理2月、3月两次的无菌种子采集效果与前两者有明显差异，可参考性不强。
2.4 不同无菌种子采集方式对‘贵长’猕猴桃种子发芽及成苗的影响
从图2可以看出，消毒剂灭菌和无菌搅拌法采集的无菌‘贵长’猕猴桃种子的发芽是在1040d之间，010d之间无种子萌发，4050d之间发芽率基本无变化。10%次氯酸钠灭菌20 min的种子开始萌发时间大约在第11天，1120d之间发芽率达到47.47%，到30d时发芽率为53.53%，而3040d之间才有29.80%的种子发芽;无菌搅拌法采集的无菌种子大约在第15天开始萌发，3040d之间的种子发芽率为57.81%，而前30d只有32.09%，后期发芽率接近于前期的2倍;0.2%升汞灭菌20 min后的种子开始萌发时间较晚，大约在第17天，前30d的发芽率19.19%，40d时的最终发芽率为46.46%，整体种子发芽率显著低于无菌搅拌法和10%次氯酸钠灭菌20 min（图1，表5，P<0.05），种子开始萌发的时间约比无菌搅拌法晚2d，比10%次氯酸钠灭菌20 min晚6d，可見，无菌搅拌法种子的发芽高峰时段为试验后期，开始萌发时间较晚，说明‘贵长’猕猴桃种子有休眠性;10%次氯酸钠灭菌20 min的种子发芽高峰时段是在试验前期，且开始萌发时间提前无菌搅拌法种子4d，说明10%次氯酸钠灭菌20 min有助于‘贵长’猕猴桃种子的破眠;0.2%升汞灭菌20 min的种子各方面指标都低，开始萌发时间最晚，说明0.2%升汞灭菌20 min会抑制‘贵长’猕猴桃种子的萌发。 再到长出真叶，所需时间和10%次氯酸钠灭菌20 min的种子无明显差异，根健壮，分根多，由于开始萌发时间晚，规定时间内成苗率不及次氯酸钠处理（图4：左1）;0.2%升汞灭菌20 min的种子萌发、生长状况都很差，许多种子虽然萌发，会长出一点根，但到试验结束基本无变化，一小部分会长出子叶和真叶，成苗率显著低于前两者（P<0.05），规定时间内成苗的芽根细且短小，分根少（图4：左3）。可见，从获取实生苗的角度看，10%次氯酸钠灭菌20 min显然效果更好，无菌搅拌法也能获得健壮的实生苗，两者的差异主要体现在种子开始发芽的时间上。
2.5 赤霉素浸种对不同方式采集的无菌猕猴桃种子萌发的影响
赤霉素浸种对不同方式采集的无菌猕猴桃种96.77%，略微超过D3处理的94.62%（图4：左4），两者并无显著差异（P<0.05），但D3处理的浸种时间比D5处理少12 h。可见，D3即赤霉素浸种8 h是‘贵长’猕猴桃种子的最佳的浸种时间。浸种时间最短的D2处理，3个指标均处于一般水平，而浸种时间最长的D6处理，发芽势、成苗率却最低，和D3、D4、D5都有显著差异（P<0.05），发芽高峰时段也有所推迟。可见，赤霉素的破眠作用只是在一定的范围内有效。0.2%升汞灭菌20 min的种子经赤霉素浸种后，D11处理发芽率最高，为94.62%，D10发芽势最高，为50.54%，D12成苗率最高，为70.05%（图4：左5），显著低于除D6、D1外所有的无菌搅拌法浸种处理（P<0.05）。可见，即使打破种子的休眠，0.2%升汞滅菌20 min依然不利于种子的萌发、生长，这也从另一方面印证了2.4的结论。
综上所述，适当利用赤霉素浸种在打破猕猴桃种子休眠上有很好的作用，试验中探索出的最佳方案为25 mg·L-1的赤霉素浸种8 h。
3 讨论
采集无菌种子时，采集方式的效果、种子活性的保持、附带问题的存在和解决是必须考虑的三大因素。本研究结果表明，无菌搅拌法、消毒剂灭菌都可有效采集无菌的猕猴桃种子，但消毒剂中的次氯酸钠灭菌效果不稳定，在天气较冷的12月、1月灭菌效果很好，但在天气转暖的2月、3月灭菌效果较差。王羽悦（2016）在探索猕猴桃茎段的最佳取材时间时发现季节转换对茎段的污染有影响，天气转暖会导致污染率的上升。本研究中升汞处理之所以能保持良好的灭菌效果，是因为试验中使用的浓度较高、浸种时间较长，而在其它外植体灭菌时，常用的升汞浓度为0.1%，灭菌时间在15 min以内，浓度过高、时间过长会抑制外植体的活性（何官榕等，2017），陈雪鹃等（2012）在做芙蓉菊组培时、蒋时姣等（2014）在采集柳杉无菌种子时的灭菌探索都印证了此结论。0.2%升汞灭菌20 min是众多猕猴桃胚乳培养文献中常用的种子灭菌方式（林颖等，2012;龙自立，2008;赵丹丹，2011），灭菌效果好却存在一些附带问题。首先，升汞灭菌的原因在于其含有的Hg2+是重金属离子，会与菌体内带有负电荷的蛋白质结合，使蛋白质变性，进而杀灭菌体，但Hg2+会残留在被灭菌的外植体表面不易清除，影响外植体的存活，林妃等（2013）在做花梨木组织培养时有此结论;其次，汞是一种重金属，对环境污染大，对操作人员有潜在危害，妥善处理升汞废液、避免对人体伤害是不容忽视却又较难解决的问题（Bjrklund et al.， 2017）。无菌搅拌法是一种物理取种方法，与消毒剂灭菌相比，操作过程简单，不会对猕猴桃种子造成伤害，也不存在环境、安全等附加问题，适合实验室中的无菌猕猴桃种子采集。
种子的休眠是植物在长期的系统发育过程中形成的抵抗外界不良环境条件，以保持物种不断发展和进化的生态特性，是调节种子萌发最佳时机和空间分布的一种机制（郑道君等，2017）。猕猴桃种子体积微小，有一定的休眠特性。低温沙藏法是打破猕猴桃种子休眠常用的方法，一般在冬天开始，时间为2
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3个月不等，低温沙藏过程中还需控制沙的湿度、种子表面的空气流动等问题（王亚威，2017），整个方法受限条件多，过程繁琐。赤霉素是打破种子休眠的常用试剂（常青山等，2016）。本研究在探索无菌搅拌法优势时，利用25 mg·L-1的赤霉素浸种，得出一定的浓度下赤霉素浸种促进猕猴桃种子萌发只在一定时间范围内有效的结论，这与周玲艳等（2009）用2.5 mg·L-1的赤霉素浸泡美味猕猴桃种子时的结论不谋而合。25 mg·L-1浓度的赤霉素浸种8 h是本研究中赤霉素浸种的最佳处理。另外，本研究中用次氯酸钠灭菌时发现，次氯酸钠亦有打破猕猴桃种子休眠的作用，这可能是因为次氯酸钠腐蚀了猕猴桃种子的种皮，让胚更易吸收外界的水分及无机盐离子。10%次氯酸钠灭菌20 min的种子在开始萌发时间、发芽高峰时段上和赤霉素浸种的最佳处理无差异，两者的差异在于11
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20d时种子的发芽数量，赤霉素处理为82.79%，次氯酸钠处理为47.47%，相差35.32%，但都显著高于不做处理的普通种子（无菌搅拌法种子）。因此，25 mg·L-1赤霉素浸种8 h处理的破眠效果优于10%次氯酸钠灭菌20 min处理。不过，浸种时间短是次氯酸钠的优势，20 min是8 h的1/24，本研究只是观察了10%的次氯酸浸种20 min的破眠效果，有一定的片面性，但次氯酸钠的破眠作用是可以肯定的，具体潜力有待进一步探究。
综上所述，升汞灭菌的附带问题较多，最好避免使用;次氯酸钠灭菌的效果不稳定，相比之下，用于打破猕猴桃种子休眠更有意义;无菌搅拌法可避免升汞、次氯酸钠灭菌时的短处，适合用于采集无菌的猕猴桃种子。本研究证实了无菌搅拌法的可靠性和实用性，为采集无菌的猕猴桃种子提供了新的高效、安全的方法，具有较大的实用价值，也为类似植物的无菌种子采集拓展了新思路。 参考文献：
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关键词：种子， 猕猴桃， 无菌， 萌发， 搅拌
中图分类号：Q945.6
文献标识码：A
文章编号：1000-3142（2019）04-0472-10
Abstract：Aseptic seeds of kiwifruit is fundamental tested material of endosperm culture， micro-grafting and other researches. It is a usual way to gather aseptic seeds to usedisinfectant to sterilize. Among them， mercuric chloride and NaClO are the most widely useddisinfectants. This article showed that aseptic stirring method is a new method to obtain aseptic seeds of kiwifruit. In order to explore accuracy and applicability of aseptic stirring method， kiwifruit seeds were used to study the effects of three methods， including 0.2% mercuric chloride sterilization for 20 min， 10% NaClO sterilization for 20 min， aseptic stirring method， and their effects on seed germination and plant growth. The results showed that aseptic stirring method and 0.2% mercuric chloride sterilization for 20 min were an effective and reproductive way for gathering aseptic seeds of kiwifruit. Oppositely， gathering aseptic seeds of kiwifruit which in 10% NaClO sterilization for 20 min was unstable. The results also showed that the three methods were effective， and at the same time， seed germination rate of aseptic stirring method was the highest. And the rate was 89.90%， but its germination energy was lower， sprouts could grow healthily， germination rate of seeds with 10% NaClO sterilization for 20 min was the second place， but there was no significantdifference in germination rate of seeds between 10% NaClO sterilization for 20 min and aseptic stirring method， its germination energy and seedling rate were the highest which were 47.47% and 67.86% respectively， and could give the seed a premature start and also could break effectively thedormancy of kiwifruit seeds like GA3. And 0.2% mercuric chloride sterilization for 20 min inhibited germination of kiwifruit seeds， the various index was significantly lower than aseptic stirring method， sprouts grew slowly， most of the seeds could notdevelop into young seedlings within the allotted time. In addition， aseptic stirring method was a physical method， and it was harmless for seeds， workers and environment. The study indicated that the practicality and advantage of aseptic stirring method， and found the ability of NaClO to break thedormancy of kiwifruit seeds， which provided a reference for the obtaining aseptic seeds of other same type of fruits. Key words：seeds， kiwifruit， aseptic， germination， stirring
种子是种子植物的繁殖体，对延续物种起着重要作用。猕猴桃是猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属（Actinidia）的多年生藤本植物（吴秀华等，2013），原产地在中国，现已在世界范围内广泛种植（Belrose， 2009），果实可口且营养丰富，因维生素 C 含量高而被誉为“水果之王”，根、茎、叶、花均可入药，可谓‘全身是宝’（周玲艳等，2013）。猕猴桃种子数量多、体积小，镶嵌在果肉中，影响果实的口感和部分产品的加工（如果汁等）。为得到无籽猕猴桃果实，许多学者进行了深入研究。被子植物的胚乳培养是获取不育植株的重要手段，目前已在西番莲（张琴等，2000）、杨桃（吴清等，2002）、枇杷（彭晓军和王永清，2002）等果树研究中广泛应用;猕猴桃的胚乳培养也有很大进展，且已获得了三倍体植株（林颖等，2012）。猕猴桃种质资源具有丰富的多样性（王发明等，2018），但童期长，基因高度杂合（叶开玉等，2012），现阶段的繁殖手段多为实生嫁接法，周期长且创伤易感染溃疡病。微嫁接技术是组织培养和嫁接技术的结合，目前在葡萄（郝新意，2017）、苹果（周瑞金等，2007）等果树上广泛应用，利用种子在无菌培养基上培育实生苗，再无菌嫁接优良品种，可缩短繁殖周期、提高成活率、避免溃疡病感染。
上述两种技术都需要无菌的猕猴桃种子为基础材料。常用的猕猴桃无菌种子是利用消毒剂杀菌获得，升汞、次氯酸钠是使用最多的消毒剂。实际上，猕猴桃正常完整果实的内部是无菌环境，种子被无菌的果肉包裹，也是无菌的。为避免在取种时将种子暴露在有菌环境中，去掉不必要的工作量，直接采集无菌猕猴桃种子，本研究提出了一种新的无菌猕猴桃种子采集方法——无菌搅拌法，避免了使用消毒剂，优化了胚乳培养、微嫁接技术的前期工作。
1 材料与方法
1.1 材料
选取6个猕猴桃品种的果实作为供试材料，分别为‘贵长’‘红阳’‘徐香’‘翠香’‘Hort 16A’‘海沃德’，由超市购买或从西峡县猕猴桃种植果园中采集。
1.2 方法
1.2.1 试验条件 所用的培养基均为MS培养基，试验地点在南阳师范学院植物培养室，培养基、磁力搅拌子、去离子水、果酱瓶等均用高压蒸汽灭菌锅灭菌，赤霉素用0.2 μm的微孔滤膜过滤除菌，温度控制在25 ℃左右，每天的光照时间为12 h，光照强度在1 500～2 000 lx之间，试验除了“无菌种子采集方式效果的稳定性测定”这一步外，其余工作均在12月份开始。
1.2.2 无菌种子采集
1.2.2.1 无菌搅拌法 在试验中，先选取‘贵长’‘Hort 16A’‘翠香’猕猴桃完全成熟的完整果实，用无菌搅拌法采集种子，具体步骤如下：在超净工作台中，把猕猴桃果实放在无菌滤纸上，先用酒精棉球擦拭果实表面，再用无菌的镊子和手术刀做剥皮处理。剥皮的过程中应多次在酒精灯上灼烧镊子、手术刀与果皮接触的部分，保证其始终无菌。剥皮后的果肉先移放到另一张无菌滤纸上，用灼烧过的手术刀削去表面的果肉，然后放入无菌的果酱瓶中，用无菌镊子捣碎，加入无菌水至果酱瓶体积的2/3，拧紧瓶盖，置于磁力搅拌器上搅拌3
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5 min，静置，观察种子与果肉的分离状况，再用无菌水冲走果肉碎屑，留下猕猴桃种子。采集的猕猴桃种子在超净工作台上直接接种于MS培养基，每个培养基上接种6粒，接种10个培养基，共接60粒种子，20d时观察种子的污染状况，记录数据，待第一粒种子萌发后第20天停止观察，记录种子的萌芽是否带菌。无菌搅拌法采集的‘贵长’‘Hort 16A’‘翠香’三个品种的种子分别标记为A1、A2、A3。同时，试验设置有菌环境中，用磁力搅拌器搅拌采集的‘贵长’‘Hort 16A’‘翠香’猕猴桃种子作为对照组，分别标记为CK1、CK2、CK3，与无菌搅拌法采集的种子比较。为进一步证实无菌搅拌法的可靠性，试验再选用‘徐香’‘海沃德’‘红阳’三个品种猕猴桃作为无菌搅拌法的供试材料，获取种子，具体观察记录方式与无菌搅拌法一致。
1.2.2.2 消毒剂灭菌 试验选用的消毒剂为升汞、次氯酸钠，浓度分别为0.2%、10%，滅菌时间为20 min，这也是文献中应用过的有效灭菌处理。消毒剂灭菌所用的种子是通过常规取种方式采集的，即选择‘贵长’‘Hort 16A’‘翠香’猕猴桃完全成熟的完整果实，在有菌环境中挤出果肉，利用纱布包裹后反复淘洗，去掉果肉和漂浮于水面的空瘪种子，留下饱满种子。升汞灭菌后的 ‘贵长’‘Hort 16A’‘翠香’种子分别标记为B1、B2、B3，次氯酸钠灭菌后的‘贵长’‘Hort 16A’‘翠香’种子分别标记为C1、C2、C3。灭菌后的猕猴桃种子在超净工作台上直接接种于MS培养基，每个培养基上接种6粒，接种10个培养基，共接60粒种子，20d时观察种子的污染状况，记录数据，待第一粒种子萌发后第20天停止观察，记录种子的萌芽是否带菌。
1.2.2.3 无菌种子采集方式效果的稳定性测定 为了更好地确定无菌搅拌法和消毒剂灭菌的效果，以‘贵长’猕猴桃的果实为材料，分别用这两种方式在12月、1月、2月、3月分别采集一次无菌猕猴桃种子，观察记录方式与上述（1）、（2）一致。
1.2.3 种子萌发培养 培养种子萌发和观察芽的生长状况主要是用于分析两种无菌种子采集方式各自的优缺点，进一步验证无菌搅拌法的实用性。以‘贵长’猕猴桃果实为材料，进行以下研究。
1.2.3.1 无菌种子的直接培养 试验用无菌搅拌法、0.2%升汞灭菌20 min、10%次氯酸钠灭菌20 min采集的无菌种子接种于MS培养基，使其自然萌芽生长，以10d为一个单位，观察一次种子的萌发情况，待种子萌发结束后观察成苗情况（长出真叶的芽为成苗），观察时长为50d。试验设3次重复，每次重复33粒左右。 1.2.3.2 赤霉素处理 试验用无菌搅拌法、0.2%升汞灭菌20 min采集的无菌种子，在浓度为25 mg·L-1的赤霉素中分别浸种0、5、8、15、20、24 h，无菌搅拌法种子按顺序标记为D1、D2、D3、D4、D5、D6，升汞灭菌的种子按顺序标记为D7、D8、D9、D10、D11、D12。经赤霉素处理后的无菌种子于MS培养基上培养，观察记录种子的萌发、生长等情况，时长为50d。设置3次重复，每次重复31粒左右。发芽率=最终发芽的种子数/供试种子数
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100%;发芽势=试验前20d发芽种子数/供试种子数100%;成苗率=试验结束时萌芽的成苗数/供试种子数100%。
1.2.4 统计学分析 采用Excel 2013软件整理数据和制作图表，用SPSS 22.0统计软件作统计学分析，用one-way ANOVAduncan法完成多重比较。
2 结果与分析
2.1 无菌搅拌法的无菌猕猴桃种子采集效果
无菌搅拌法可顺利采集猕猴桃种子（图1：A、D），搅拌果肉时可清楚观察到种子与果肉分离（图1：B），静置后饱满的种子沉在果酱瓶底部，空瘪种子漂浮在去离子水上部（图1：C），表明无菌搅拌法是一种可靠的猕猴桃种子采集方法。
利用无菌搅拌法采集‘贵长’‘Hort 16A’‘翠香’三个猕猴桃品种无菌种子的效果如表1所示。三个品种的对照组种子全部污染，确认污染的时间在310d之间;无菌搅拌法采集的三个猕猴桃品种种子接种于MS培养基，经20d的观察，‘贵长’‘Hort 16A’两个品种各有1粒种子污染，确认污染的时间分别在第7天、第6天，‘翠香’的种子无污染产生。三个品种的对照组由于种子全部污染，因此无萌芽产生，而无菌搅拌法组中，三个品种的种子开始萌发时间并无显著差异，均在1316d之间，因此对萌芽污染情况的观察时间统一至第36天结束，所有的种子萌芽均不带菌。可见，无菌搅拌法是可以用来采集无菌猕猴桃种子的，试验中出现的2粒种子污染应该是试验操作不严谨造成的。
在试验中为了确认表1中出现的2粒种子污染不是方法本身的问题，本研究选用‘徐香’‘红阳’‘海沃德’三个猕猴桃品种为材料，利用无菌搅拌法取种，具体采集效果如表2所示。采集的三个猕猴桃品种种子是无菌的，经20d观察，无污染产生，种子的开始发芽时间‘徐香’约在第14天，‘红阳’约在第16天，‘海沃德’约在第14天，因此对萌芽的观察时间分别持续至第34、36、34天，种子的萌芽也无污染现象。可见，表1中的2粒种子污染与无菌搅拌法本身并无关联，无菌搅拌法是一种可靠的无菌猕猴桃种子采集方法。
2.2 消毒剂灭菌采集无菌猕猴桃种子的效果
消毒剂灭菌采集无菌猕猴桃种子的效果如表3所示。对于‘贵长’‘Hort 16A’‘翠香’三个品种的种子，经0.2%升汞处理20 min和10%次氯酸钠处理20 min后在20d内均无细菌或真菌污染，每种处理的60粒种子都是无菌的。0.2%升汞处理20 min后的种子开始发芽较晚，‘贵长’大约在第17天，‘Hort 16A’大约在第18天，‘翠香’大约在第16天，对萌芽污染情况的观察分别至第37天、第38天、第36天结束，萌芽均不带菌。10%次氯酸钠处理20 min后的种子开始发芽有所时间提前，‘贵长’大约在第11天，‘Hort 16A’ 大约在第12天，‘翠香’大约在第11天，对萌芽污染情况的观察分别至第31天、第32天、第31天结束，萌芽均不带菌。可见，消毒剂灭菌也能采集无菌猕猴桃种子。
2.3 不同无菌猕猴桃种子采集方式效果的稳定性
不同无菌猕猴桃种子采集方式效果的稳定性测定效果如表4所示。无菌搅拌法在12月采集的无菌 ‘贵长’猕猴桃种子有1粒污染， 其余3个月
无污染;0.2% 升汞20 min处理在4次无菌‘贵长’猕猴桃种子采集中均无污染产生;10% 次氯酸钠20 min处理在12月、1月两次无菌‘贵长’猕猴桃种子采集中无污染现象，而在2月时有7粒污染，3月有11粒种子污染。在2.1中已经证明‘贵长’猕猴桃的那1粒种子污染与无菌搅拌法本身无关，因此无菌搅拌法和0.2% 升汞20 min处理都是效果比较稳定的猕猴桃无菌种子的采集方式，10% 次氯酸钠20 min处理2月、3月两次的无菌种子采集效果与前两者有明显差异，可参考性不强。
2.4 不同无菌种子采集方式对‘贵长’猕猴桃种子发芽及成苗的影响
从图2可以看出，消毒剂灭菌和无菌搅拌法采集的无菌‘贵长’猕猴桃种子的发芽是在1040d之间，010d之间无种子萌发，4050d之间发芽率基本无变化。10%次氯酸钠灭菌20 min的种子开始萌发时间大约在第11天，1120d之间发芽率达到47.47%，到30d时发芽率为53.53%，而3040d之间才有29.80%的种子发芽;无菌搅拌法采集的无菌种子大约在第15天开始萌发，3040d之间的种子发芽率为57.81%，而前30d只有32.09%，后期发芽率接近于前期的2倍;0.2%升汞灭菌20 min后的种子开始萌发时间较晚，大约在第17天，前30d的发芽率19.19%，40d时的最终发芽率为46.46%，整体种子发芽率显著低于无菌搅拌法和10%次氯酸钠灭菌20 min（图1，表5，P<0.05），种子开始萌发的时间约比无菌搅拌法晚2d，比10%次氯酸钠灭菌20 min晚6d，可見，无菌搅拌法种子的发芽高峰时段为试验后期，开始萌发时间较晚，说明‘贵长’猕猴桃种子有休眠性;10%次氯酸钠灭菌20 min的种子发芽高峰时段是在试验前期，且开始萌发时间提前无菌搅拌法种子4d，说明10%次氯酸钠灭菌20 min有助于‘贵长’猕猴桃种子的破眠;0.2%升汞灭菌20 min的种子各方面指标都低，开始萌发时间最晚，说明0.2%升汞灭菌20 min会抑制‘贵长’猕猴桃种子的萌发。 再到长出真叶，所需时间和10%次氯酸钠灭菌20 min的种子无明显差异，根健壮，分根多，由于开始萌发时间晚，规定时间内成苗率不及次氯酸钠处理（图4：左1）;0.2%升汞灭菌20 min的种子萌发、生长状况都很差，许多种子虽然萌发，会长出一点根，但到试验结束基本无变化，一小部分会长出子叶和真叶，成苗率显著低于前两者（P<0.05），规定时间内成苗的芽根细且短小，分根少（图4：左3）。可见，从获取实生苗的角度看，10%次氯酸钠灭菌20 min显然效果更好，无菌搅拌法也能获得健壮的实生苗，两者的差异主要体现在种子开始发芽的时间上。
2.5 赤霉素浸种对不同方式采集的无菌猕猴桃种子萌发的影响
赤霉素浸种对不同方式采集的无菌猕猴桃种96.77%，略微超过D3处理的94.62%（图4：左4），两者并无显著差异（P<0.05），但D3处理的浸种时间比D5处理少12 h。可见，D3即赤霉素浸种8 h是‘贵长’猕猴桃种子的最佳的浸种时间。浸种时间最短的D2处理，3个指标均处于一般水平，而浸种时间最长的D6处理，发芽势、成苗率却最低，和D3、D4、D5都有显著差异（P<0.05），发芽高峰时段也有所推迟。可见，赤霉素的破眠作用只是在一定的范围内有效。0.2%升汞灭菌20 min的种子经赤霉素浸种后，D11处理发芽率最高，为94.62%，D10发芽势最高，为50.54%，D12成苗率最高，为70.05%（图4：左5），显著低于除D6、D1外所有的无菌搅拌法浸种处理（P<0.05）。可见，即使打破种子的休眠，0.2%升汞滅菌20 min依然不利于种子的萌发、生长，这也从另一方面印证了2.4的结论。
综上所述，适当利用赤霉素浸种在打破猕猴桃种子休眠上有很好的作用，试验中探索出的最佳方案为25 mg·L-1的赤霉素浸种8 h。
3 讨论
采集无菌种子时，采集方式的效果、种子活性的保持、附带问题的存在和解决是必须考虑的三大因素。本研究结果表明，无菌搅拌法、消毒剂灭菌都可有效采集无菌的猕猴桃种子，但消毒剂中的次氯酸钠灭菌效果不稳定，在天气较冷的12月、1月灭菌效果很好，但在天气转暖的2月、3月灭菌效果较差。王羽悦（2016）在探索猕猴桃茎段的最佳取材时间时发现季节转换对茎段的污染有影响，天气转暖会导致污染率的上升。本研究中升汞处理之所以能保持良好的灭菌效果，是因为试验中使用的浓度较高、浸种时间较长，而在其它外植体灭菌时，常用的升汞浓度为0.1%，灭菌时间在15 min以内，浓度过高、时间过长会抑制外植体的活性（何官榕等，2017），陈雪鹃等（2012）在做芙蓉菊组培时、蒋时姣等（2014）在采集柳杉无菌种子时的灭菌探索都印证了此结论。0.2%升汞灭菌20 min是众多猕猴桃胚乳培养文献中常用的种子灭菌方式（林颖等，2012;龙自立，2008;赵丹丹，2011），灭菌效果好却存在一些附带问题。首先，升汞灭菌的原因在于其含有的Hg2+是重金属离子，会与菌体内带有负电荷的蛋白质结合，使蛋白质变性，进而杀灭菌体，但Hg2+会残留在被灭菌的外植体表面不易清除，影响外植体的存活，林妃等（2013）在做花梨木组织培养时有此结论;其次，汞是一种重金属，对环境污染大，对操作人员有潜在危害，妥善处理升汞废液、避免对人体伤害是不容忽视却又较难解决的问题（Bjrklund et al.， 2017）。无菌搅拌法是一种物理取种方法，与消毒剂灭菌相比，操作过程简单，不会对猕猴桃种子造成伤害，也不存在环境、安全等附加问题，适合实验室中的无菌猕猴桃种子采集。
种子的休眠是植物在长期的系统发育过程中形成的抵抗外界不良环境条件，以保持物种不断发展和进化的生态特性，是调节种子萌发最佳时机和空间分布的一种机制（郑道君等，2017）。猕猴桃种子体积微小，有一定的休眠特性。低温沙藏法是打破猕猴桃种子休眠常用的方法，一般在冬天开始，时间为2
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3个月不等，低温沙藏过程中还需控制沙的湿度、种子表面的空气流动等问题（王亚威，2017），整个方法受限条件多，过程繁琐。赤霉素是打破种子休眠的常用试剂（常青山等，2016）。本研究在探索无菌搅拌法优势时，利用25 mg·L-1的赤霉素浸种，得出一定的浓度下赤霉素浸种促进猕猴桃种子萌发只在一定时间范围内有效的结论，这与周玲艳等（2009）用2.5 mg·L-1的赤霉素浸泡美味猕猴桃种子时的结论不谋而合。25 mg·L-1浓度的赤霉素浸种8 h是本研究中赤霉素浸种的最佳处理。另外，本研究中用次氯酸钠灭菌时发现，次氯酸钠亦有打破猕猴桃种子休眠的作用，这可能是因为次氯酸钠腐蚀了猕猴桃种子的种皮，让胚更易吸收外界的水分及无机盐离子。10%次氯酸钠灭菌20 min的种子在开始萌发时间、发芽高峰时段上和赤霉素浸种的最佳处理无差异，两者的差异在于11
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20d时种子的发芽数量，赤霉素处理为82.79%，次氯酸钠处理为47.47%，相差35.32%，但都显著高于不做处理的普通种子（无菌搅拌法种子）。因此，25 mg·L-1赤霉素浸种8 h处理的破眠效果优于10%次氯酸钠灭菌20 min处理。不过，浸种时间短是次氯酸钠的优势，20 min是8 h的1/24，本研究只是观察了10%的次氯酸浸种20 min的破眠效果，有一定的片面性，但次氯酸钠的破眠作用是可以肯定的，具体潜力有待进一步探究。
综上所述，升汞灭菌的附带问题较多，最好避免使用;次氯酸钠灭菌的效果不稳定，相比之下，用于打破猕猴桃种子休眠更有意义;无菌搅拌法可避免升汞、次氯酸钠灭菌时的短处，适合用于采集无菌的猕猴桃种子。本研究证实了无菌搅拌法的可靠性和实用性，为采集无菌的猕猴桃种子提供了新的高效、安全的方法，具有较大的实用价值，也为类似植物的无菌种子采集拓展了新思路。 参考文献：
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