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摘要：目的：分析荧光定量PCR法检测胃癌血清中miR-21的表达情况，探讨miR-21在胃癌检测中的意义 方法：设计miR-21和U6茎环逆转录引物和PCR扩增引物，以U6为内参利用实时荧光定量PCR检测正常对照组、胃窦溃疡组、胃窦炎性息肉组及胃癌组的miR-21表达情况，并将术前与术后的miR-21表达情况进行对比分析。结果：胃癌组患者的miR-21表达水平明显均高于正常对照组、胃窦溃疡组及胃窦炎性息肉组，具有显著性差异（p<0.05）；胃癌组、胃窦溃疡组、胃窦炎性息肉组及正常对照组的miR-21相对表达量分别为 1.99（0.96，2.51）、1.25（0.97，2.36）、 1.31（1.13，2.66）及0.03（0.02，0.05）。胃癌组患者的miR-21表达水平明显均高于正常对照组、胃窦溃疡组及胃窦炎性息肉组，具有显著性差异（p<0.05）。结论：荧光定量PCR具有特异性强、灵敏度高等优点，可以运用于检测胃癌的早期诊断和分期，具有广阔的应用前景，值得进一步推广。
关键词：荧光定量PCR法；血清miR-21；表达情况；应用效果
胃癌属于一种恶性肿瘤，常发生于胃黏膜上皮细胞，其发病率高，给患者的生命健康造成很大的威胁。胃癌的早期诊断的金标准为胃镜及病理学诊断，现今，血清肿瘤标记物（如癌胚抗原）也逐渐开始应用于检测肿瘤，但其对胃癌诊断的敏感性和特异性相对较低[1-2]。微小RNA （ microRNAs ，miRNAs）是一种普遍存在于多种细胞生物中的内源性、非编码小RNA分子，长19 -22个核苷酸，约占基因总数的2%，通过剪切 mRNA及抑制翻译参与调控多种生理过程，其中包括时序发育、细胞凋亡、脂肪代谢、神经元发育、细胞分化和激素分泌等[3-4]。miR-21是人类发现较早、存在较为广泛的miRNA，通过作用于bcl-2 ，p53 ， caspase-3 /7 /9 ， pdcd4等多个靶基因在胃癌、肺癌、膀胱癌等肿瘤中发挥作用。荧光定量PCR技术利用PCR对脱氧核糖核酸（DNA）的高效扩增检测miR-21的表达水平，具有直观、重复性好、特异性强、敏感性高和易操作等优点。本研究就荧光定量PCR法在胃癌血清miR-21检测中的应用效果报道如下[1]：
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 标本收集
2010年10月-2012年10月我院收治的30例未经放化疗的胃癌患者，其中男17例，女13例，年龄42-67岁，平均年龄为（53.8 ±8.7）岁；正常人员30例，年龄41-64岁，平均年龄为（51.8±13.5）岁；胃窦溃疡患者27例，年龄40-66岁，平均年龄为（53.2 ±14.3 ）岁；胃窦炎性息肉患者19例，年龄43-63岁，平均年龄为（52.6±15.7）岁；标本包括术前外周静脉血及术后60d外周静脉血各3mL，手术切除的胃部组织标本，包括胃癌组织和癌旁组织（距肿瘤边缘>5cm）。所有病例均经病理学证实。组织标本获取后分离得到血清并置于-80℃冰箱保存。
1.1.2主要试剂和仪器
Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；miR-21荧光定量PCR试剂盒（上海吉玛公司）；逆转录所需的dNTPs及逆转录酶、100bp DNA Ladder Marken（广州达晖公司）；BIO-RAD CFX96实时荧光定量PCR仪（美国BIO-RAD公司）； Biophotometer生物分光光度计（Eppendorf公司）。
1.2 方法
1.2.1总RNA提取
采用Trizo法分别提取胃癌组织、正常组织、胃窦溃疡组织、胃窦炎性息肉及其癌旁组织的总RNA，Biophotometer生物分光光度计检测RNA质量和浓度，1.2%的甲醛变性凝胶电泳[2]。
1.2.2实时荧光定量PCR检测血清中miR-21含量
以RNA为模板，分别以miR-21和U6反转录引物行逆转录反应，反转录条件为420C 60min， 850C 5s，获得小鼠肝脏组织的miR-21和U6 cDNA。分别以miR-21和U6 cDNA为模板，以miR-21和U6的特异性引物实时荧光定量PCR，反应参数为950C l0min预变性，950C 15s，600C 30s荧光检测1次，共40个循环。阴性对照以生理盐水代替逆转录产物。设置熔解曲线判断是否有非特异性的扩增和引物二聚体的出现。以所有标本中miR-21基因Ct值最低的标本作为对照，△Ct = CtmiR-21-CtU6snRNA，△△Ct=△Ct实验标本-△Ct对照标本；miR-21基因相对表达量用2-△△Ct算[3]。
1.3统计学分析
经方差分析发现miR-21基因相对表达量不满足正态分布和方差齐性条件，故以只能以M（P25 ，P75）表示，采用SPSS17. 0软件进行，并利用Mann-Whitney U检验进行组间比较。当P <0.05为有统计学意义。
2结果
2.1实时荧光定量PCR熔解曲线
miR-21、U6的熔解曲线峰值单一，略有差异，未见杂峰信号；miR-21熔解温度为81℃，U6熔解温度为83℃。表明PCR参数选择适当，miR-21、U6逆转录引物和扩增引物能够扩增出miR-21， U6片段，产物特异度较好，非特异产物对结果影响较小[4]。见图1：
2.2实时荧光定量PCR检测结果
2.2.1 荧光定量PCR检测miR-21在各组血清中的表达情况比较
2.2.1 荧光定量PCR检测miR-21在术前与术后血清miR-21表达情况比较
3讨论
胃癌的早期诊断的金标准为胃镜及病理学诊断，由于它们在操作上存在一定的局限性，故一般不应用于胃癌的早期诊断。传统血清肿瘤标记物在胃癌患者血清中表达升高，但其特异性与敏感性均较低。近年来，人们通过生物信息学等高科技方法，对miR-21的靶基因及相关功能进了预测。miR-21的相当一部分靶基因则具有介导细胞凋亡，抑制细胞迁移、增殖。这说明在不同的肿瘤细胞中，miR-21可能扮演着致癌基因或肿瘤抑制基因的不同角色。miR-21的靶基因：PTEN，抑制细胞迁移、增殖的作用；Bcl-2，抑制细胞凋亡的作用；PDCD4，抑制细胞生长的作用；Nanog、Sox2、Octamer-4，维持胚胎肝细胞自我更新和多向分化潜能的作用；c-Myc，促进细胞分裂、增殖的作用；NFIB，抑制转录因子作用；SPRY2，影响细胞向外生长、分支和迁移；TIMP3，参与细胞外信号引导细胞凋亡；APAF1，调控细胞凋亡；caspase-3/9，介导细胞凋亡；MARCKS，参与细胞运动、分裂；WNT1，参与细胞迁移、分化；BTG2，抑制细胞增殖；BMPRⅡ，参与肿瘤的转移和恶化。miR-21不仅在某些肿瘤发生过程中类似致癌基因，而且还可促进肿瘤侵袭转移。miRNA-21主要通过抑制PTEN、PDCD4、TPM1、Maspin和SPRY2等靶基因来促进肿瘤发生和侵袭转移的，所有这些靶基因都是负向调控肿瘤生长和侵袭转移的。Meng等实验结果显示miRNA-21在肝癌细胞中比正常细胞高9倍，miRNA-21通过下调PTEN的表达而上调PI3K通路进而促进肿瘤细胞增殖转移。Roldo等运用基因芯片技术证实miR-21与胰腺癌的肝转移呈正相关，研究发现miR-21促进肿瘤细胞转化的作用部分是通过抑制抑癌基因程序性细胞死亡因子4 （PDCD4）实现的，转染miR-21下调PDCD4的表达，促进了肿瘤细胞的侵袭和转移。在转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，通过一定方法抑制miRNA-21或增加TPM1的表达都能明显减弱乳腺癌细胞的侵袭转移。
据报道，miR-21在胃癌患者的组织中相对含量较高，由于血清中miRNAs较易获得，另外miRNAs在血清中可长期稳定存在，耐RNA酶，在低温及酸碱等环境中均不会造成血清miRNAs的损失，易于定量检测。荧光定量PCR是近年发展起来的一项新技术，它巧妙地利用了PCR技术核酸扩增的高效性、探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性以及计量高准确性等优点，既克服了普通PCR技术易污染、不能定量等不足，又具有检测范围宽、灵敏性高、精确度高、产出率高及可以进行多重检测等优点。在疾病的基因诊断中有着广阔的应用前景。
综上所述， 荧光定量PCR法可以较为精确显现出胃癌患者血清中miR-21的表达水平，进而为胃癌的早期诊断提供参照指标，具有广阔的应用前景。
参考文献：
[1] 王君辅，李红浪，谢勇，等.循环microRNA在胃癌诊断及预后预测中应用的研究进展[J].广东医学，2012，33（24）：3828-3831.
[2] 张晟春，王燕，张兴毅，王才友，等.两种荧光定量聚合酶链反应法检测乳腺癌组织中微小RNA-21的应用分析[J].中国全科医学，2013，16（20）：624-628.
[3] 马文静，李鲁，吕国栋，刘涛，等.SYBR green实时荧光定量PCR检测微小RNA 21的方法建立及在食管鳞癌中的应用[J].生物技术，2010，20（1）：45-48.
[4] 陈文璟，温旺荣，等.SYBR green荧光定量PCR检测宫颈癌血清中miR-21的表达[J].临床检验杂志，2011，29（7）：523-525.
关键词：荧光定量PCR法；血清miR-21；表达情况；应用效果
胃癌属于一种恶性肿瘤，常发生于胃黏膜上皮细胞，其发病率高，给患者的生命健康造成很大的威胁。胃癌的早期诊断的金标准为胃镜及病理学诊断，现今，血清肿瘤标记物（如癌胚抗原）也逐渐开始应用于检测肿瘤，但其对胃癌诊断的敏感性和特异性相对较低[1-2]。微小RNA （ microRNAs ，miRNAs）是一种普遍存在于多种细胞生物中的内源性、非编码小RNA分子，长19 -22个核苷酸，约占基因总数的2%，通过剪切 mRNA及抑制翻译参与调控多种生理过程，其中包括时序发育、细胞凋亡、脂肪代谢、神经元发育、细胞分化和激素分泌等[3-4]。miR-21是人类发现较早、存在较为广泛的miRNA，通过作用于bcl-2 ，p53 ， caspase-3 /7 /9 ， pdcd4等多个靶基因在胃癌、肺癌、膀胱癌等肿瘤中发挥作用。荧光定量PCR技术利用PCR对脱氧核糖核酸（DNA）的高效扩增检测miR-21的表达水平，具有直观、重复性好、特异性强、敏感性高和易操作等优点。本研究就荧光定量PCR法在胃癌血清miR-21检测中的应用效果报道如下[1]：
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 标本收集
2010年10月-2012年10月我院收治的30例未经放化疗的胃癌患者，其中男17例，女13例，年龄42-67岁，平均年龄为（53.8 ±8.7）岁；正常人员30例，年龄41-64岁，平均年龄为（51.8±13.5）岁；胃窦溃疡患者27例，年龄40-66岁，平均年龄为（53.2 ±14.3 ）岁；胃窦炎性息肉患者19例，年龄43-63岁，平均年龄为（52.6±15.7）岁；标本包括术前外周静脉血及术后60d外周静脉血各3mL，手术切除的胃部组织标本，包括胃癌组织和癌旁组织（距肿瘤边缘>5cm）。所有病例均经病理学证实。组织标本获取后分离得到血清并置于-80℃冰箱保存。
1.1.2主要试剂和仪器
Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；miR-21荧光定量PCR试剂盒（上海吉玛公司）；逆转录所需的dNTPs及逆转录酶、100bp DNA Ladder Marken（广州达晖公司）；BIO-RAD CFX96实时荧光定量PCR仪（美国BIO-RAD公司）； Biophotometer生物分光光度计（Eppendorf公司）。
1.2 方法
1.2.1总RNA提取
采用Trizo法分别提取胃癌组织、正常组织、胃窦溃疡组织、胃窦炎性息肉及其癌旁组织的总RNA，Biophotometer生物分光光度计检测RNA质量和浓度，1.2%的甲醛变性凝胶电泳[2]。
1.2.2实时荧光定量PCR检测血清中miR-21含量
以RNA为模板，分别以miR-21和U6反转录引物行逆转录反应，反转录条件为420C 60min， 850C 5s，获得小鼠肝脏组织的miR-21和U6 cDNA。分别以miR-21和U6 cDNA为模板，以miR-21和U6的特异性引物实时荧光定量PCR，反应参数为950C l0min预变性，950C 15s，600C 30s荧光检测1次，共40个循环。阴性对照以生理盐水代替逆转录产物。设置熔解曲线判断是否有非特异性的扩增和引物二聚体的出现。以所有标本中miR-21基因Ct值最低的标本作为对照，△Ct = CtmiR-21-CtU6snRNA，△△Ct=△Ct实验标本-△Ct对照标本；miR-21基因相对表达量用2-△△Ct算[3]。
1.3统计学分析
经方差分析发现miR-21基因相对表达量不满足正态分布和方差齐性条件，故以只能以M（P25 ，P75）表示，采用SPSS17. 0软件进行，并利用Mann-Whitney U检验进行组间比较。当P <0.05为有统计学意义。
2结果
2.1实时荧光定量PCR熔解曲线
miR-21、U6的熔解曲线峰值单一，略有差异，未见杂峰信号；miR-21熔解温度为81℃，U6熔解温度为83℃。表明PCR参数选择适当，miR-21、U6逆转录引物和扩增引物能够扩增出miR-21， U6片段，产物特异度较好，非特异产物对结果影响较小[4]。见图1：
2.2实时荧光定量PCR检测结果
2.2.1 荧光定量PCR检测miR-21在各组血清中的表达情况比较
2.2.1 荧光定量PCR检测miR-21在术前与术后血清miR-21表达情况比较
3讨论
胃癌的早期诊断的金标准为胃镜及病理学诊断，由于它们在操作上存在一定的局限性，故一般不应用于胃癌的早期诊断。传统血清肿瘤标记物在胃癌患者血清中表达升高，但其特异性与敏感性均较低。近年来，人们通过生物信息学等高科技方法，对miR-21的靶基因及相关功能进了预测。miR-21的相当一部分靶基因则具有介导细胞凋亡，抑制细胞迁移、增殖。这说明在不同的肿瘤细胞中，miR-21可能扮演着致癌基因或肿瘤抑制基因的不同角色。miR-21的靶基因：PTEN，抑制细胞迁移、增殖的作用；Bcl-2，抑制细胞凋亡的作用；PDCD4，抑制细胞生长的作用；Nanog、Sox2、Octamer-4，维持胚胎肝细胞自我更新和多向分化潜能的作用；c-Myc，促进细胞分裂、增殖的作用；NFIB，抑制转录因子作用；SPRY2，影响细胞向外生长、分支和迁移；TIMP3，参与细胞外信号引导细胞凋亡；APAF1，调控细胞凋亡；caspase-3/9，介导细胞凋亡；MARCKS，参与细胞运动、分裂；WNT1，参与细胞迁移、分化；BTG2，抑制细胞增殖；BMPRⅡ，参与肿瘤的转移和恶化。miR-21不仅在某些肿瘤发生过程中类似致癌基因，而且还可促进肿瘤侵袭转移。miRNA-21主要通过抑制PTEN、PDCD4、TPM1、Maspin和SPRY2等靶基因来促进肿瘤发生和侵袭转移的，所有这些靶基因都是负向调控肿瘤生长和侵袭转移的。Meng等实验结果显示miRNA-21在肝癌细胞中比正常细胞高9倍，miRNA-21通过下调PTEN的表达而上调PI3K通路进而促进肿瘤细胞增殖转移。Roldo等运用基因芯片技术证实miR-21与胰腺癌的肝转移呈正相关，研究发现miR-21促进肿瘤细胞转化的作用部分是通过抑制抑癌基因程序性细胞死亡因子4 （PDCD4）实现的，转染miR-21下调PDCD4的表达，促进了肿瘤细胞的侵袭和转移。在转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，通过一定方法抑制miRNA-21或增加TPM1的表达都能明显减弱乳腺癌细胞的侵袭转移。
据报道，miR-21在胃癌患者的组织中相对含量较高，由于血清中miRNAs较易获得，另外miRNAs在血清中可长期稳定存在，耐RNA酶，在低温及酸碱等环境中均不会造成血清miRNAs的损失，易于定量检测。荧光定量PCR是近年发展起来的一项新技术，它巧妙地利用了PCR技术核酸扩增的高效性、探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性以及计量高准确性等优点，既克服了普通PCR技术易污染、不能定量等不足，又具有检测范围宽、灵敏性高、精确度高、产出率高及可以进行多重检测等优点。在疾病的基因诊断中有着广阔的应用前景。
综上所述， 荧光定量PCR法可以较为精确显现出胃癌患者血清中miR-21的表达水平，进而为胃癌的早期诊断提供参照指标，具有广阔的应用前景。
参考文献：
[1] 王君辅，李红浪，谢勇，等.循环microRNA在胃癌诊断及预后预测中应用的研究进展[J].广东医学，2012，33（24）：3828-3831.
[2] 张晟春，王燕，张兴毅，王才友，等.两种荧光定量聚合酶链反应法检测乳腺癌组织中微小RNA-21的应用分析[J].中国全科医学，2013，16（20）：624-628.
[3] 马文静，李鲁，吕国栋，刘涛，等.SYBR green实时荧光定量PCR检测微小RNA 21的方法建立及在食管鳞癌中的应用[J].生物技术，2010，20（1）：45-48.
[4] 陈文璟，温旺荣，等.SYBR green荧光定量PCR检测宫颈癌血清中miR-21的表达[J].临床检验杂志，2011，29（7）：523-525.