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摘 要：CBF基因是植物CBF抗冷途径的枢纽，对增强植物抗冷能力极为重要。本研究根据已知的核桃CBF基因序列设计通用性引物，对麻核桃cDNA进行PCR扩增，成功获得麻核桃CBF基因全长序列，命名为JhCBF。JhCBF全长820 bp，包含一个645 bp的开放读码框（ORF），编码214个氨基酸。序列分析表明JhCBF与其他物种来源的CBF具有较高的同源性，其中，与桦木科白桦的同源性最高，为6122%；JhCBF含有一个预测的AP2结构域及CBF特有的两段短肽序列。系统进化树分析表明JhCBF与桦木科白桦的亲缘关系最近，最先聚为一类。
关键词：麻核桃；CBF基因；克隆；生物信息学分析
中图分类号：Q785 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2013）11-0007-05
麻核桃（Juglans hopeiensis Hu）属胡桃科（Juglandaceae）胡桃属（Juglans），主要分布在河北、天津、山西和北京的部分山区。麻核桃集纹路多变、皮质良好、造型优美等优点于一身，在文玩核桃中属于最高档次的品种。低温冻害是影响核桃生长发育、造成核桃产量和质量下降的主要因素之一。南方的泡核桃引种到北方种植时，多数因低温胁迫致死，而我国独有的麻核桃能够在河北、北京等山区林地正常生长，因此，对麻核桃的抗寒性进行研究具有重要的理论和实践意义。
CBF（CRT/DRE-binding factor）基因是一种低温响应转录因子基因，其主要的抗冷机制为：当植物受低温驯化后，ICE（Inducer of CBF expression）转录因子被激活，与位于CBF基因上游启动子中的ICE盒相结合，诱导CBF基因表达，而后CBF基因表达产物与下游一系列COR（Cold-regulated gene）基因启动子中的CRT/DRE（C-repeat binding factor /dehydration-responsive element binding protein）元件结合，诱导系列抗冷基因表达，从而提高植物抗冷性[1]。自1997年Stockinger等[2]在拟南芥中克隆到CBF1基因以来，之后相继从油菜[1，3]、水稻[4]、大麦[5]等多种作物中分离和鉴定出CBF转录因子基因。迄今为止，在樱桃[6]、杨树[7，8]、葡萄[9]、柑橘[10]、榛子[11]等多种木本植物中也已克隆得到CBF基因。研究表明，CBF基因过量表达或异源表达能增加下游抗冷功能基因的表达，增加抗寒代谢物（包括抗氧化物质和渗调物质等）的积累量从而对提高植物的抗寒性发挥重要作用[12～14]。本试验根据已公布的核桃CBF基因序列设计通用引物，成功克隆JhCBF基因，并对其进行生物信息学分析，为JhCBF基因的进一步研究奠定基础。
1 材料与方法
11 材料与试剂
EASYspin植物RNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、RNase-Free DNaseⅠ和Mix均购自天根公司；引物及克隆载体pMD19-T Vector购自宝生物（大连）有限公司；反转录试剂盒购自Thermo Scientific公司。
12 试验方法
。
2 结果与分析
21 麻核桃CBF基因cDNA全长的获得
以麻核桃cDNA为模板，用通用引物进行PCR扩增，获得了长约820 bp的特异性条带（图1）。将测序结果在NCBI网站进行Blast比对发现，该cDNA序列与已注册其他植物的CBF基因具有较高的同源性，命名为JhCBF。JhCBF cDNA全长820 bp，包含一个645 bp的开放读码框（ORF），编码214个氨基酸。在第149个核苷酸处有起始密码子ATG，在第791个核苷酸处有终止密码子TAG（图2）。
22 JhCBF编码蛋白序列分析及系统进化树构建
3 结论 本研究首次获得了麻核桃CBF基因的全长cDNA，并对其进行了生物信息学分析，揭示出CBF在核桃种属之间保守存在。本研究为下一步深入探讨JhCBF基因的功能，揭示麻核桃响应低温胁迫的分子机制提供了基础，为增强核桃的抗寒性及培育具有抗寒能力的核桃新品种提供理论依据。下一步将抗寒基因与传统抗冷育种技术相结合，培育抗冷植物新品种，对农业生产具有十分重要的意义。
参 考 文 献：
[1] Zhou N， Wu G， Gao Y P， et al Molecular cloning of a cDNA encoding dehydration responsive element （DRE）binding protein in Brassic napus NCBI GenBank accession number AF084185 [DB/OL] http：//www ncbinlm.nih gov./， 1998
[2] Stochinger E J， Gilmour S J， Thomashow M F Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcription activator that binds to the C-repest/DRE， a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit [J] Proc Natl Acad Sci USA， 1997， 94（3）：1035-1040
[3] Jaglo-Ottosen K R， Kleff S， Amundsen K L， et al Components of the ArabidopsisC-repeat/dehydration-responsive element binding factor cold-response pathway are conserved in Brassica napus and other plant species[J] Plant Physiology， 2001， 127（3）： 910- 917 [4] Choi D W， Close T J. Rice（Oryza sativa cv Somegawa）DRE/CRT binding fator（CBF） NCBI GenBank accession number AF243384 [DB/OL] http：//www ncbinlm.nihgov./， 2000
[5] Choi D W， Close T J Isolation of CBF1-like mRNA（BCBF1）from Barley（Hordeum vulgare cv Morex） NCBI GenBank accession number AF298230 [DB/OL] http：//www ncbinlm.nihgov./， 2000
[6] Owens C L， Thomashow M F， Hancock J F， et al CBF orthologs in sour cherry and strawberry and the heterologous expression of CBF1 in strawberry[J] J Amer Soc Hort Sci， 2002， 127（4）： 489-494
[7] Benedict C， Skinner J S， Meng R， et al The CBF1-dependent low temperature signalling pathway， regulon and increase in freeze tolerance are conserved in Populus spp[J] Plant Cell Environ， 2006，29（7）： 1259-1272
[8] 周 洲，李永丽 毛白杨转录因子PtCBF5的表达模式分析[J] 林业科学， 2010，46（4）：58-63
[9] Xiao H， Siddiqua M， Braybrook S， et al Three grape CBF/DREB1 genes respond to low temperature， drought and abscisic acid [J] Plant Cell Environ， 2006，29（7）： 1410-1421
[10]Champ K I， Febres V J， Moore B D The role of CBF transcriptional activators in two Citrus species （Poncirus and Citrus） with contrasting levels of freezing tolerance[J] Physiologia Plantarum， 2007， 129（3）： 529-541
[11]陈 新，王贵禧，梁丽松， 等 平榛冷适应相关基因CBF的克隆及时空表达特性分析[J] 林业科学，2012， 48（1）：167-172
[12]Gilmour S J， Zarka D G， Stockinger E J， et al Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-induced COR gene expression[J] The Plant Journal， 1998， 16（4）：433-442
[13]严海燕，Steponkuspl CBF3基因过量表达的拟南芥细胞质膜组分的变化[J] 武汉植物学研究，2004，22（6）： 529-533
[14]金建凤，高 强，陈 勇， 等 转移拟南芥CBF1基因引起水稻植株脯氨酸含量提高[J] 细胞生物学杂志，2005， 27： 73-76
[15]Okamuo J K， Caster B， Villarroel R， et al The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins in Arabidopsis[J] Proc Natl Acad Sci USA， 1997， 94（13）：7076-7081
[16]李利斌，刘立锋，王殿峰，等.大白菜CBF4基因的克隆和遗传进化分析[J].山东农业科学， 2009，4：1-4.
[17]Medina J， Bargues M， Terol J， et al The Arabidopsis CBF gene family is composed of three genes encoding AP2 domain-containing proteins whose expression is regulated by low temperature but not by abscisic acid or dehydration[J] Plant Physiology， 1999， 119（2）：463-470
[18]Allen M D， Yamasaki K， Ohme-Takagi M， et al A novel mode of DNA recognition by a β-sheet revealed by the solution structure of the GCC-box binding domain in complex with DNA [J] EMBO J， 1998， 17（18）：5484-5496
关键词：麻核桃；CBF基因；克隆；生物信息学分析
中图分类号：Q785 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2013）11-0007-05
麻核桃（Juglans hopeiensis Hu）属胡桃科（Juglandaceae）胡桃属（Juglans），主要分布在河北、天津、山西和北京的部分山区。麻核桃集纹路多变、皮质良好、造型优美等优点于一身，在文玩核桃中属于最高档次的品种。低温冻害是影响核桃生长发育、造成核桃产量和质量下降的主要因素之一。南方的泡核桃引种到北方种植时，多数因低温胁迫致死，而我国独有的麻核桃能够在河北、北京等山区林地正常生长，因此，对麻核桃的抗寒性进行研究具有重要的理论和实践意义。
CBF（CRT/DRE-binding factor）基因是一种低温响应转录因子基因，其主要的抗冷机制为：当植物受低温驯化后，ICE（Inducer of CBF expression）转录因子被激活，与位于CBF基因上游启动子中的ICE盒相结合，诱导CBF基因表达，而后CBF基因表达产物与下游一系列COR（Cold-regulated gene）基因启动子中的CRT/DRE（C-repeat binding factor /dehydration-responsive element binding protein）元件结合，诱导系列抗冷基因表达，从而提高植物抗冷性[1]。自1997年Stockinger等[2]在拟南芥中克隆到CBF1基因以来，之后相继从油菜[1，3]、水稻[4]、大麦[5]等多种作物中分离和鉴定出CBF转录因子基因。迄今为止，在樱桃[6]、杨树[7，8]、葡萄[9]、柑橘[10]、榛子[11]等多种木本植物中也已克隆得到CBF基因。研究表明，CBF基因过量表达或异源表达能增加下游抗冷功能基因的表达，增加抗寒代谢物（包括抗氧化物质和渗调物质等）的积累量从而对提高植物的抗寒性发挥重要作用[12～14]。本试验根据已公布的核桃CBF基因序列设计通用引物，成功克隆JhCBF基因，并对其进行生物信息学分析，为JhCBF基因的进一步研究奠定基础。
1 材料与方法
11 材料与试剂
EASYspin植物RNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、RNase-Free DNaseⅠ和Mix均购自天根公司；引物及克隆载体pMD19-T Vector购自宝生物（大连）有限公司；反转录试剂盒购自Thermo Scientific公司。
12 试验方法
。
2 结果与分析
21 麻核桃CBF基因cDNA全长的获得
以麻核桃cDNA为模板，用通用引物进行PCR扩增，获得了长约820 bp的特异性条带（图1）。将测序结果在NCBI网站进行Blast比对发现，该cDNA序列与已注册其他植物的CBF基因具有较高的同源性，命名为JhCBF。JhCBF cDNA全长820 bp，包含一个645 bp的开放读码框（ORF），编码214个氨基酸。在第149个核苷酸处有起始密码子ATG，在第791个核苷酸处有终止密码子TAG（图2）。
22 JhCBF编码蛋白序列分析及系统进化树构建
3 结论 本研究首次获得了麻核桃CBF基因的全长cDNA，并对其进行了生物信息学分析，揭示出CBF在核桃种属之间保守存在。本研究为下一步深入探讨JhCBF基因的功能，揭示麻核桃响应低温胁迫的分子机制提供了基础，为增强核桃的抗寒性及培育具有抗寒能力的核桃新品种提供理论依据。下一步将抗寒基因与传统抗冷育种技术相结合，培育抗冷植物新品种，对农业生产具有十分重要的意义。
参 考 文 献：
[1] Zhou N， Wu G， Gao Y P， et al Molecular cloning of a cDNA encoding dehydration responsive element （DRE）binding protein in Brassic napus NCBI GenBank accession number AF084185 [DB/OL] http：//www ncbinlm.nih gov./， 1998
[2] Stochinger E J， Gilmour S J， Thomashow M F Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcription activator that binds to the C-repest/DRE， a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit [J] Proc Natl Acad Sci USA， 1997， 94（3）：1035-1040
[3] Jaglo-Ottosen K R， Kleff S， Amundsen K L， et al Components of the ArabidopsisC-repeat/dehydration-responsive element binding factor cold-response pathway are conserved in Brassica napus and other plant species[J] Plant Physiology， 2001， 127（3）： 910- 917 [4] Choi D W， Close T J. Rice（Oryza sativa cv Somegawa）DRE/CRT binding fator（CBF） NCBI GenBank accession number AF243384 [DB/OL] http：//www ncbinlm.nihgov./， 2000
[5] Choi D W， Close T J Isolation of CBF1-like mRNA（BCBF1）from Barley（Hordeum vulgare cv Morex） NCBI GenBank accession number AF298230 [DB/OL] http：//www ncbinlm.nihgov./， 2000
[6] Owens C L， Thomashow M F， Hancock J F， et al CBF orthologs in sour cherry and strawberry and the heterologous expression of CBF1 in strawberry[J] J Amer Soc Hort Sci， 2002， 127（4）： 489-494
[7] Benedict C， Skinner J S， Meng R， et al The CBF1-dependent low temperature signalling pathway， regulon and increase in freeze tolerance are conserved in Populus spp[J] Plant Cell Environ， 2006，29（7）： 1259-1272
[8] 周 洲，李永丽 毛白杨转录因子PtCBF5的表达模式分析[J] 林业科学， 2010，46（4）：58-63
[9] Xiao H， Siddiqua M， Braybrook S， et al Three grape CBF/DREB1 genes respond to low temperature， drought and abscisic acid [J] Plant Cell Environ， 2006，29（7）： 1410-1421
[10]Champ K I， Febres V J， Moore B D The role of CBF transcriptional activators in two Citrus species （Poncirus and Citrus） with contrasting levels of freezing tolerance[J] Physiologia Plantarum， 2007， 129（3）： 529-541
[11]陈 新，王贵禧，梁丽松， 等 平榛冷适应相关基因CBF的克隆及时空表达特性分析[J] 林业科学，2012， 48（1）：167-172
[12]Gilmour S J， Zarka D G， Stockinger E J， et al Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-induced COR gene expression[J] The Plant Journal， 1998， 16（4）：433-442
[13]严海燕，Steponkuspl CBF3基因过量表达的拟南芥细胞质膜组分的变化[J] 武汉植物学研究，2004，22（6）： 529-533
[14]金建凤，高 强，陈 勇， 等 转移拟南芥CBF1基因引起水稻植株脯氨酸含量提高[J] 细胞生物学杂志，2005， 27： 73-76
[15]Okamuo J K， Caster B， Villarroel R， et al The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins in Arabidopsis[J] Proc Natl Acad Sci USA， 1997， 94（13）：7076-7081
[16]李利斌，刘立锋，王殿峰，等.大白菜CBF4基因的克隆和遗传进化分析[J].山东农业科学， 2009，4：1-4.
[17]Medina J， Bargues M， Terol J， et al The Arabidopsis CBF gene family is composed of three genes encoding AP2 domain-containing proteins whose expression is regulated by low temperature but not by abscisic acid or dehydration[J] Plant Physiology， 1999， 119（2）：463-470
[18]Allen M D， Yamasaki K， Ohme-Takagi M， et al A novel mode of DNA recognition by a β-sheet revealed by the solution structure of the GCC-box binding domain in complex with DNA [J] EMBO J， 1998， 17（18）：5484-5496