论文部分内容阅读
摘要：以卷曲霉素产生的菌卷曲链霉菌作为出发菌，经过UV诱变和五氯酚浓缩处理，得到一株效价在7950u/ml左右的营养缺陷型卷曲霉素菌株，再经过EMS诱变处理筛选得到更多突变株和高产菌，整个过程中卷曲霉素的效价都能保持在稳定的状态。采用单因子实验与多因子正交实验进行分析，经过研究确定卷曲霉素菌株N13最佳发酵条件，此时卷曲霉素效价达到了9483u/ml，比出发菌的效价提升了42.8%以上。
关键词：卷曲霉素;卷曲链霉菌;结核杆菌;发酵生产;菌种改良
引言：卷曲霉素主要是由卷曲链霉菌产生的环状多肽类抗生素，对结核杆菌传染引发的肺结核有着较好的治疗效果，且副作用比较小。目前卷曲霉素已成为较为理想的抗结核菌药物，由于其发酵效价成本低，成药价格略高，有必要对卷曲霉素产生菌进行有效的改良与分析，经过物理或化学诱变剂处理方法做出改良，并得到理想化实验结果。
1.卷曲霉素的研究现状
卷曲霉素简称CPM，是由卷曲链霉菌或指孢囊菌产生，类似于紫霉素的环状多肽类抗生素，卷曲霉素中的组份十分相似，可以溶于水，但无法溶于多数有机溶剂，卷曲霉素在酸碱度4-8的水溶液中比较稳定，其抗菌机理是抑制细菌蛋白质的合成。当前人们将卷曲霉素用于抗结核杆菌感染，这是有效控制耐药性结核疾病的重要抗生素，随着肺结核抗菌素的研制成功，肺结核已经基本得到控制，但近年来该疾病再次蔓延，世卫组织于1993年宣布肺结核为全球性急症，1996年将4月24日定为世界防治结核病日[1]。
2.卷曲霉素产生菌的改良研究
2.1材料与方法
2.1.1菌株与试剂
卷曲霉素产生菌的改良试验主要用到两种菌株，一种是出发菌株卷曲链霉素4006，另一种是检测菌枯草芽孢杆菌6633，这两种菌株目前都由中国科学研成都生物所负责保存。
本实验使用到的方法主要有以下几种：（1）紫外线诱变筛选。紫外线诱变就是将出发菌卷曲链霉素在高氏一号斜面培养基中培养10天左右，温度控制在28℃，使用无菌生理盐水洗下孢子，再用玻珠摇匀，制作为每毫升106个孢子悬液。取下50ml的孢子悬液，将其放在500ml烧杯内，紫外灯先预热20min，随后将烧杯放在磁力搅拌器上，用40w灯在距离30cm的位置照射0-5min，分别取样10ml即可。等待样品稀释取0.1ml稀释液涂布ES平板，在28℃环境下避光培养一周即可，测定卷曲霉素紫外诱变后的存活情況。（2）营养缺陷型筛选。使用无菌牙签将ES平板上长出的菌落分别点中在基础平板和ES平板中，并与出发菌4006进行对照分析，每个平板需点中菌落52个，在28℃的环境温度下培养10天左右。在基础平板上不长，但是在ES平板上生长的菌落就是营养缺陷型。（3）CPM抑制卷曲链霉菌4006实验分析。
2.1.2培养基
对于实验中需要用到的培养基，主要有以下几种：高氏一号培养基，使用蒸馏水定容后到1L，要求酸碱度在7.2左右;种子培养基，其中包含蛋白、玉米淀粉、葡萄糖、碳酸钙、氯化钠、氢氧化钠等，用蒸馏水定容，酸碱值达到7.2;发酵培养基，主要用于卷曲霉素初筛和复筛，与种子培养基要求相同;NO.13与NO.39培养基，前者需要将20g的掩埋在1L蒸馏水内煮沸20分钟，纱布过滤后加入18g琼脂，补充蒸馏水到1L，调整酸碱值为7.2，再加入1ml微量元素溶液。NO.39培养基中包含葡萄糖、麦芽酚、碳酸钙、琼脂以酵母膏，加入蒸馏水后还需使用KOH调整PH值。
2.1.3原生质体NTG诱变
首先，培养菌丝体生长。将出发菌孢子使用生理盐水洗下，玻璃珠摇匀后接入盛装25mlPM1培养液的三角瓶内，要求温度控制在30℃，每分钟150r匀速培养24小时。其次，制备原生质体，最终溶菌酶的浓度应达到1g/L，在摇床上保持每分钟100r的速度，35℃下酶处理60分钟。最后，NTG诱变原生质体，取10ml离心管，共3支，分别加入4ml原生质体悬液，再加入NTG，洗涤后制作原生质体溶液并涂布在平板上，30℃的温度下培养一周，最终确定原生质体再生频率。
2.1.4筛选卷曲霉素高产菌
初步筛选时使用琼脂块法，复筛使用摇瓶发酵法，将斜面上生长好的孢子接种在25ml种子培养液内，在250ml三角瓶中以每分钟240r的速度培养48小时，种子长好以后再以10%的接种量，将其接种在25ml发酵培养液内，同等培养条件培养96小时。
2.2研究结果
2.2.1获得营养缺陷型高产菌
取经过紫外线诱变5分钟，致死率94%，且经过五氯酚处理后的卷曲霉素孢子悬液涂布在ES平板中，再从菌落中筛选出营养缺陷型4株，经过琼脂法和摇瓶发酵的筛选方法，从缺陷型菌株中筛出卷曲霉素效价在7950u/ml的营养缺陷型高产菌，其突变株产量比出发菌4006产量高出19.7%[2]。
2.2.2获得抗终产物CPM高产菌
取经过EMS诱变2分钟且致死率在74%的出发菌4006的孢子液，涂布在ES平板内，平板中含有CPM，挑取290株CPM突变株，使用琼脂块法经过初筛后发现抑菌圈大于出发菌，摇瓶发酵进行复筛，得出抗性突变株5-41，与4006-35株相比产量提高了6.4%。所以抗终产物CPM突变株5-41可以作为下一轮原生质体NTG诱变出发菌株。
2.2.3NTG诱变原生质体筛选高产菌
再生平板中的原生质体占比92%，使用NTG溶液诱变原生质体30分钟，筛选出卷曲霉素高产菌，挑选出出高产菌后还需经过初筛与复筛，发现没有得到超过出发菌5-41的菌株，经过NTG诱变CPM抗性突变株原生质体再生菌落内选730株做初筛与复筛，最终得到了9050u/ml突变株N13，与出发菌5-41相比产量提高了7.2%。
总结：总而言之，当前人们加深了对微生物遗传学的研究深度，有目的的筛选出了与产品质量和数量相符合的突变型菌株，避免了以往筛选工作的盲目性。本文采用筛选营养缺陷型突变株的方法得到了卷曲霉素高产突变菌株，在达到卷曲霉素高产菌朱目的的同时为后续结核菌的抑制奠定了基础。
参考文献：
[1]李桂莲，万康林.5种中国罕见慢速生长非结核分枝杆菌标准株及临床分离株的药物敏感性分析[J].疾病监测，2020，35（05）：435-441.
[2]许磊.观察卷曲霉素在耐多药肺结核治疗中应用价值并分析用药安全性[J].人人健康，2020（08）：223-224.
关键词：卷曲霉素;卷曲链霉菌;结核杆菌;发酵生产;菌种改良
引言：卷曲霉素主要是由卷曲链霉菌产生的环状多肽类抗生素，对结核杆菌传染引发的肺结核有着较好的治疗效果，且副作用比较小。目前卷曲霉素已成为较为理想的抗结核菌药物，由于其发酵效价成本低，成药价格略高，有必要对卷曲霉素产生菌进行有效的改良与分析，经过物理或化学诱变剂处理方法做出改良，并得到理想化实验结果。
1.卷曲霉素的研究现状
卷曲霉素简称CPM，是由卷曲链霉菌或指孢囊菌产生，类似于紫霉素的环状多肽类抗生素，卷曲霉素中的组份十分相似，可以溶于水，但无法溶于多数有机溶剂，卷曲霉素在酸碱度4-8的水溶液中比较稳定，其抗菌机理是抑制细菌蛋白质的合成。当前人们将卷曲霉素用于抗结核杆菌感染，这是有效控制耐药性结核疾病的重要抗生素，随着肺结核抗菌素的研制成功，肺结核已经基本得到控制，但近年来该疾病再次蔓延，世卫组织于1993年宣布肺结核为全球性急症，1996年将4月24日定为世界防治结核病日[1]。
2.卷曲霉素产生菌的改良研究
2.1材料与方法
2.1.1菌株与试剂
卷曲霉素产生菌的改良试验主要用到两种菌株，一种是出发菌株卷曲链霉素4006，另一种是检测菌枯草芽孢杆菌6633，这两种菌株目前都由中国科学研成都生物所负责保存。
本实验使用到的方法主要有以下几种：（1）紫外线诱变筛选。紫外线诱变就是将出发菌卷曲链霉素在高氏一号斜面培养基中培养10天左右，温度控制在28℃，使用无菌生理盐水洗下孢子，再用玻珠摇匀，制作为每毫升106个孢子悬液。取下50ml的孢子悬液，将其放在500ml烧杯内，紫外灯先预热20min，随后将烧杯放在磁力搅拌器上，用40w灯在距离30cm的位置照射0-5min，分别取样10ml即可。等待样品稀释取0.1ml稀释液涂布ES平板，在28℃环境下避光培养一周即可，测定卷曲霉素紫外诱变后的存活情況。（2）营养缺陷型筛选。使用无菌牙签将ES平板上长出的菌落分别点中在基础平板和ES平板中，并与出发菌4006进行对照分析，每个平板需点中菌落52个，在28℃的环境温度下培养10天左右。在基础平板上不长，但是在ES平板上生长的菌落就是营养缺陷型。（3）CPM抑制卷曲链霉菌4006实验分析。
2.1.2培养基
对于实验中需要用到的培养基，主要有以下几种：高氏一号培养基，使用蒸馏水定容后到1L，要求酸碱度在7.2左右;种子培养基，其中包含蛋白、玉米淀粉、葡萄糖、碳酸钙、氯化钠、氢氧化钠等，用蒸馏水定容，酸碱值达到7.2;发酵培养基，主要用于卷曲霉素初筛和复筛，与种子培养基要求相同;NO.13与NO.39培养基，前者需要将20g的掩埋在1L蒸馏水内煮沸20分钟，纱布过滤后加入18g琼脂，补充蒸馏水到1L，调整酸碱值为7.2，再加入1ml微量元素溶液。NO.39培养基中包含葡萄糖、麦芽酚、碳酸钙、琼脂以酵母膏，加入蒸馏水后还需使用KOH调整PH值。
2.1.3原生质体NTG诱变
首先，培养菌丝体生长。将出发菌孢子使用生理盐水洗下，玻璃珠摇匀后接入盛装25mlPM1培养液的三角瓶内，要求温度控制在30℃，每分钟150r匀速培养24小时。其次，制备原生质体，最终溶菌酶的浓度应达到1g/L，在摇床上保持每分钟100r的速度，35℃下酶处理60分钟。最后，NTG诱变原生质体，取10ml离心管，共3支，分别加入4ml原生质体悬液，再加入NTG，洗涤后制作原生质体溶液并涂布在平板上，30℃的温度下培养一周，最终确定原生质体再生频率。
2.1.4筛选卷曲霉素高产菌
初步筛选时使用琼脂块法，复筛使用摇瓶发酵法，将斜面上生长好的孢子接种在25ml种子培养液内，在250ml三角瓶中以每分钟240r的速度培养48小时，种子长好以后再以10%的接种量，将其接种在25ml发酵培养液内，同等培养条件培养96小时。
2.2研究结果
2.2.1获得营养缺陷型高产菌
取经过紫外线诱变5分钟，致死率94%，且经过五氯酚处理后的卷曲霉素孢子悬液涂布在ES平板中，再从菌落中筛选出营养缺陷型4株，经过琼脂法和摇瓶发酵的筛选方法，从缺陷型菌株中筛出卷曲霉素效价在7950u/ml的营养缺陷型高产菌，其突变株产量比出发菌4006产量高出19.7%[2]。
2.2.2获得抗终产物CPM高产菌
取经过EMS诱变2分钟且致死率在74%的出发菌4006的孢子液，涂布在ES平板内，平板中含有CPM，挑取290株CPM突变株，使用琼脂块法经过初筛后发现抑菌圈大于出发菌，摇瓶发酵进行复筛，得出抗性突变株5-41，与4006-35株相比产量提高了6.4%。所以抗终产物CPM突变株5-41可以作为下一轮原生质体NTG诱变出发菌株。
2.2.3NTG诱变原生质体筛选高产菌
再生平板中的原生质体占比92%，使用NTG溶液诱变原生质体30分钟，筛选出卷曲霉素高产菌，挑选出出高产菌后还需经过初筛与复筛，发现没有得到超过出发菌5-41的菌株，经过NTG诱变CPM抗性突变株原生质体再生菌落内选730株做初筛与复筛，最终得到了9050u/ml突变株N13，与出发菌5-41相比产量提高了7.2%。
总结：总而言之，当前人们加深了对微生物遗传学的研究深度，有目的的筛选出了与产品质量和数量相符合的突变型菌株，避免了以往筛选工作的盲目性。本文采用筛选营养缺陷型突变株的方法得到了卷曲霉素高产突变菌株，在达到卷曲霉素高产菌朱目的的同时为后续结核菌的抑制奠定了基础。
参考文献：
[1]李桂莲，万康林.5种中国罕见慢速生长非结核分枝杆菌标准株及临床分离株的药物敏感性分析[J].疾病监测，2020，35（05）：435-441.
[2]许磊.观察卷曲霉素在耐多药肺结核治疗中应用价值并分析用药安全性[J].人人健康，2020（08）：223-224.