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【摘 要】 目的：研究翻白草总黄酮提取工艺及化学成分。方法：处理样本，进行溶剂类型、浓度、回流时间、回流次数、水温五个因素正交法分析，以最大提取法提取溶液，处理后在400nm-720mm范围内进行光谱扫描，绘制标准曲线，进行精密度、回收率、稳定性试验，以甲醇溶剂系统梯度洗脱，进行反复柱层析;鉴定提取的化合物。结果：正交实验显示，最佳提取工艺即70%甲醇、回流120min、2次、80℃提取的总黄酮含量最高，提取率为3.1‰，光谱分析在510nm处获得最大吸收度，标准曲线Y=3.544X±0.024，r=0.984，线性范围0.021-0.053mg/ml，精密度、稳定性、回收率实验均较好;共确认5种单体化合物，包括乌苏酸、β-谷甾醇、齐墩果酸、十四烷酸、3`，4`，3，5，7-五羟基黄酮。结论：翻白草总黄酮提取工艺及化学成分的研究为下一步药理学研究奠定了基础。
【关键词】 翻白草 总黄酮 提取工艺 化学成分
翻白草是一种传统中药材，广泛分布于北方温带区域，传统中医认为其具有利尿消肿、清热解毒、降低血糖、止血止痢等功效，主治腹泻、疟疾、咳血等证，现仍被广泛于应用于细菌性痢疾、溃疡性结肠炎等病，疗效显著[1-2]。现代药理学研究证实，其富含多种生物活性成分，主要包括鞣质、黄酮类、酚类化合物等，具有较高的制药价值[3]。总黄酮是翻白草主要有效成分，具有多种药理作用，可防治心血管疾病、消炎抗菌、抗氧化、降血糖、抗辐射、增强免疫力[4]。研究翻白草总黄酮提取工艺及化学成分具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Mettler 电子天平，TDL-40B离心机，标准筛，高速粉碎机，旋转蒸发仪，捣碎机HW S26电热恒温水浴锅，超声波清洗机，RE旋转蒸发仪，紫外线可见分光光度计，Agilent 1100高压液相色谱仪，色谱数据工作站、ZRS-8G智能溶出试验儀等。试剂主要包括乙醇、甲醇、二氯甲烷、氯仿、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、芦丁对照品等。
1.2 方法
1.2.1 实验一
分析不同提取工艺对翻白草总黄酮提取率影响，选择最佳方法。
（1）处理样本：从药园获取翻白草，清洗，恒温干燥箱30℃至衡重，粉碎后，搅拌，容器盛装药物粉末，密封，待用。
（2）提取工艺：①提取方法研究，取粉末400g，等分为4分，分别在用超声法、连续回流法、渗漉法、冷浸法提取，最后提取率分别为0.9%、1.1%、0.7%、0.53%，故选择超连续回流法开始下一研究;②采用连续回流法提取，从溶剂类型、浓度、回流时间、回流次数、水温五个角度进行正交法分析，浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%、90%，溶剂分别为甲醇、乙醇、丙酮，回流时间分别为30min、60min、90min、120min、150min，回流次数分别为1-3次，水流温度为70℃、80℃、90℃，最后得到的滤液，以旋转蒸发器收回，加入离子水，冷冻除渣，重复2次，以乙醚萃取，水层浓缩干燥，称量粗提物，共进行28组实验。
1.2.2 实验二
总黄酮含量测定与成分鉴定主要内容如下。
（1）总黄酮含量测定：①以干燥衡重2mg芦丁对照品+70%乙醇制得0.1mg/ml溶液;②以最大提取法提取溶液，回收溶剂，取提取粉末，干燥后70%乙醇溶解为供试品;③分别取3ml对照品溶液、供试品溶液，+0.3ml的5%亚硝酸钠，摇匀，浸置6min，取0.3ml的10%硝酸铝，摇匀，+4ml的氢氧化钠溶液，摇匀，放置6min，以70%乙醇稀释至10ml刻度，摇匀，静置15min，在400nm-720mm范围内进行光谱扫描，测定最大吸收波长;④绘制标准曲线，同法，以横坐标数字为吸光度，以浓度为纵坐标，建立线性回归方程;⑤最后进行精密度、回收率、稳定性试验。
（2）物质鉴定：①取药粉0.5kg，以最佳方法提取，105℃下活化5h，加入氯仿均匀搅拌，装柱，以甲醇溶剂系统梯度洗脱，每10ml分流，TLC检测，合并相同分流，进行反复柱层析;②参照相关文献，鉴定提取的化合物[5]。
1.3 统计学处理
WINDOWS EXCEL收集录入数据资料，以SPSS18.0软件进行计算处理，以P<0.05表示检验水平。
2 结果
正交实验显示，最佳组合应该为A3B1C4D2E2组合，即70%甲醇、回流120min、2次、80℃提取的总黄酮含量最高，提取率为3.1‰。光谱分析在510nm处获得最大吸收度。对照品浓度分别为0.00mg/ml、0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.08mg/ml，则对应的吸光光度为0.00、0.057、0.096、0.162、0.304，线性分析显示两者存在线性关系，Y=3.544X±0.024，r=0.984，线性范围0.021-0.053mg/ml，呈现高度线性相关。连续5次测定，结果显示RSD%=3.63%，提示吸光光度具有较好的精密度，留置1h，随机时间内检测1份待测吸光度，结果显示RSD%=0.889%，在室温条件下1h内供试品总黄酮较稳定。重复性检测10次，RSD%=1.05%，提示该法测定总黄酮含量重现性较好。连测7次，平均回收率为99.99%，RSD%为1.07%，提示该法结果较准确，回收率较高。分离得到化合物，进行理化性质、熔点、波谱解析，参照相关文献以及标准物质中心提供了有关物质性质参数，共确认5种单体化合物，包括乌苏酸、β-谷甾醇、齐墩果酸、十四烷酸、3`，4`，3，5，7-五羟基黄酮。
3 讨论
本次研究获得了翻白草总黄酮最佳提取工艺，并分离鉴定出5种单体化合物，为下一步药理学研究奠定了基础。
参考文献
[1]国家药典委员会.中国药典[S].—部.北京：中国医药科技出版社，2010：359-360
[2]殷杰，夏昂.中药翻白草的鉴别研究[J].医学信息2009，22（9）：1893-1894
[3]张莉，杨杰，陈筱清等.翻白草的化学成分[J]，植物资源与环境学报，2010，19（2）：94-96
[4]曹纬国，刘志勤，邵云等.黄酮类化合物药理作用的研究进展[J].西北植物学报，2003，23（12）：2241-2247.
[5]王晶，马桔云.翻白草的研究进展[J]，黑龙江医药，2010，23（1）：16-18.
【关键词】 翻白草 总黄酮 提取工艺 化学成分
翻白草是一种传统中药材，广泛分布于北方温带区域，传统中医认为其具有利尿消肿、清热解毒、降低血糖、止血止痢等功效，主治腹泻、疟疾、咳血等证，现仍被广泛于应用于细菌性痢疾、溃疡性结肠炎等病，疗效显著[1-2]。现代药理学研究证实，其富含多种生物活性成分，主要包括鞣质、黄酮类、酚类化合物等，具有较高的制药价值[3]。总黄酮是翻白草主要有效成分，具有多种药理作用，可防治心血管疾病、消炎抗菌、抗氧化、降血糖、抗辐射、增强免疫力[4]。研究翻白草总黄酮提取工艺及化学成分具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Mettler 电子天平，TDL-40B离心机，标准筛，高速粉碎机，旋转蒸发仪，捣碎机HW S26电热恒温水浴锅，超声波清洗机，RE旋转蒸发仪，紫外线可见分光光度计，Agilent 1100高压液相色谱仪，色谱数据工作站、ZRS-8G智能溶出试验儀等。试剂主要包括乙醇、甲醇、二氯甲烷、氯仿、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、芦丁对照品等。
1.2 方法
1.2.1 实验一
分析不同提取工艺对翻白草总黄酮提取率影响，选择最佳方法。
（1）处理样本：从药园获取翻白草，清洗，恒温干燥箱30℃至衡重，粉碎后，搅拌，容器盛装药物粉末，密封，待用。
（2）提取工艺：①提取方法研究，取粉末400g，等分为4分，分别在用超声法、连续回流法、渗漉法、冷浸法提取，最后提取率分别为0.9%、1.1%、0.7%、0.53%，故选择超连续回流法开始下一研究;②采用连续回流法提取，从溶剂类型、浓度、回流时间、回流次数、水温五个角度进行正交法分析，浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%、90%，溶剂分别为甲醇、乙醇、丙酮，回流时间分别为30min、60min、90min、120min、150min，回流次数分别为1-3次，水流温度为70℃、80℃、90℃，最后得到的滤液，以旋转蒸发器收回，加入离子水，冷冻除渣，重复2次，以乙醚萃取，水层浓缩干燥，称量粗提物，共进行28组实验。
1.2.2 实验二
总黄酮含量测定与成分鉴定主要内容如下。
（1）总黄酮含量测定：①以干燥衡重2mg芦丁对照品+70%乙醇制得0.1mg/ml溶液;②以最大提取法提取溶液，回收溶剂，取提取粉末，干燥后70%乙醇溶解为供试品;③分别取3ml对照品溶液、供试品溶液，+0.3ml的5%亚硝酸钠，摇匀，浸置6min，取0.3ml的10%硝酸铝，摇匀，+4ml的氢氧化钠溶液，摇匀，放置6min，以70%乙醇稀释至10ml刻度，摇匀，静置15min，在400nm-720mm范围内进行光谱扫描，测定最大吸收波长;④绘制标准曲线，同法，以横坐标数字为吸光度，以浓度为纵坐标，建立线性回归方程;⑤最后进行精密度、回收率、稳定性试验。
（2）物质鉴定：①取药粉0.5kg，以最佳方法提取，105℃下活化5h，加入氯仿均匀搅拌，装柱，以甲醇溶剂系统梯度洗脱，每10ml分流，TLC检测，合并相同分流，进行反复柱层析;②参照相关文献，鉴定提取的化合物[5]。
1.3 统计学处理
WINDOWS EXCEL收集录入数据资料，以SPSS18.0软件进行计算处理，以P<0.05表示检验水平。
2 结果
正交实验显示，最佳组合应该为A3B1C4D2E2组合，即70%甲醇、回流120min、2次、80℃提取的总黄酮含量最高，提取率为3.1‰。光谱分析在510nm处获得最大吸收度。对照品浓度分别为0.00mg/ml、0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.08mg/ml，则对应的吸光光度为0.00、0.057、0.096、0.162、0.304，线性分析显示两者存在线性关系，Y=3.544X±0.024，r=0.984，线性范围0.021-0.053mg/ml，呈现高度线性相关。连续5次测定，结果显示RSD%=3.63%，提示吸光光度具有较好的精密度，留置1h，随机时间内检测1份待测吸光度，结果显示RSD%=0.889%，在室温条件下1h内供试品总黄酮较稳定。重复性检测10次，RSD%=1.05%，提示该法测定总黄酮含量重现性较好。连测7次，平均回收率为99.99%，RSD%为1.07%，提示该法结果较准确，回收率较高。分离得到化合物，进行理化性质、熔点、波谱解析，参照相关文献以及标准物质中心提供了有关物质性质参数，共确认5种单体化合物，包括乌苏酸、β-谷甾醇、齐墩果酸、十四烷酸、3`，4`，3，5，7-五羟基黄酮。
3 讨论
本次研究获得了翻白草总黄酮最佳提取工艺，并分离鉴定出5种单体化合物，为下一步药理学研究奠定了基础。
参考文献
[1]国家药典委员会.中国药典[S].—部.北京：中国医药科技出版社，2010：359-360
[2]殷杰，夏昂.中药翻白草的鉴别研究[J].医学信息2009，22（9）：1893-1894
[3]张莉，杨杰，陈筱清等.翻白草的化学成分[J]，植物资源与环境学报，2010，19（2）：94-96
[4]曹纬国，刘志勤，邵云等.黄酮类化合物药理作用的研究进展[J].西北植物学报，2003，23（12）：2241-2247.
[5]王晶，马桔云.翻白草的研究进展[J]，黑龙江医药，2010，23（1）：16-18.