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摘要：山东桑树细菌性疫病除有黑枯型和缩叶型外，近年在多地连年出现新症状类型——断柄型。病原菌的培养性状及生理生化性状比较表明：该病病原菌与江苏、浙江的断柄型细菌性疫病病原为同一致病型。室内药物筛选、田间防效研究认为：该病宜于桑树发芽脱苞前喷施30%琥胶肥酸铜（DT）悬浮剂500 mg/kg，防效可达84.4%，其次喷施链霉素或盐酸环丙沙星或盐酸恩诺沙星100 mg/kg液。
关键词：桑细菌性疫病；断柄型；症状；生理生化性状；防治方法
中图分类号：S888.71+9 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）03-0093-04
AbstractBesides two types of mulberry bacterial diseases，black blight and crinkle leaf，a new type，broken leafstalk， was discovered in many places of Shandong Province in recent years. Through the comparisons of culture， physiological and biochemical properties of the pathogen， it was found that this pathogen was the same to that in Jiangsu and Zhejiang Province. The indoor and field control tests showed that spraying 30% DT SC with the concentration of 500 mg/kg before green tip sprouting stage was the best with the control efficiency up to 84.4%. Streptomycin， ciprofloxacin hydrochloride or enrofloxacin hydrochloride with the concentration of 100 mg/kg were the followed ones.
Key wordsMulberry bacterial disease；Broken-leafstalk type；Symptom；Physiological and biochemical properties；Control method
桑细菌性疫病是危害桑树的主要病害，在全国各地均普遍发生且危害严重。20世纪90年代以前，研究认为该病有两种致病型：一种是以缩叶症状为主的缩叶型，即“桑缩叶型疫病”；另一种是以嫩梢变黑枯死症状为主的黑枯型，称为“桑黑枯型疫病”[1，2]。20世纪90年代末，毛建萍等[3]在江苏、浙江两省新发现了另一种表现为桑树嫩叶叶柄缢缩、叶片下垂枯萎的细菌性疫病，称为“桑断柄型细菌性疫病”，故认为桑细菌性疫病有三种类型。丁爱云等（2001）[4]调查研究了山东省蚕区16个县（市）桑细菌性疫病病原生物型、病害侵染循环等，提出山东桑树细菌性疫病分为黑枯症、枝裂症、缩叶症和叶斑症4种症状类型，未发现山东有断柄型疫病。
笔者于2002年起在山东省高密市柴沟镇等多处桑园中发现，较多的桑叶叶柄缢缩、叶片下垂枯萎，2003～2004年又在高密市周边诸城、安丘、平度、五莲等县（市）桑园中发现此种病害。为搞清该病是否系先前毛建萍等以江苏、浙江材料所定名的桑断柄型细菌性疫病，我们参照文献[3]的主要试验方法，对该病病原菌的培养性状、生理生化性状进行了测定，对发病规律和防治方法进行了研究。
1材料与方法
1.1供试菌株
如表1所示。
1.2病原菌的分离和人工接种
将采集的病叶叶柄，委托高密市农业局植病实验室经表面消毒并用稀释法分离培养获得纯菌后，对桑树新芽第2叶叶柄用针刺、涂抹、喷雾三种方法进行人工接种，并以塑料袋保湿18 h，从接种菌株M1-1的桑树上有典型症状的病叶中重新分离出菌株M1-1备用。
1.3病原菌初次侵染试验
试验于2006年开展，设4种处理：（1）3月底桑树发芽前，在田间用涂抹法接种桑条；（2）4月份在田间选择长约1.5 cm的嫩芽用涂抹法接种；（3）田间选择桑枝条标记作为自然发病的对照；（4）桑树夏伐后在田间选择长约1 cm的嫩芽用涂抹法接种。每处理为10根枝条或桑芽，重复3次，20 d起调查是否发病，记录发病症状。
1.4培养性状测定
将菌株M1-1分别采用牛肉汁蛋白胨琼脂平板、斜面、半固体以及肉汤胨水、牛乳液、修改金氏培养基、Fermi液、Cohn液、灭菌的马铃薯块培养基等接种，28℃培养，观察其生长情况[5，6]。
1.5生理生化性状测定
将各菌株分别接种在肉汤胨水培养液中，在不同温度下培养48 h后，用722光栅分光光度计在640 nm波长下比较光密度大小，以测定病原菌最适生长温度[7]。对氧化酶、糖醇发酵等按参考文献[5，6]方法进行，各菌株在半固体牛肉汁蛋白胨琼脂斜面培养24 h后，测试颜色反应。
1.6室内药效测定
试验于2005年10月开展。应用培养皿圆滤纸片法，将NA培养基斜面上培养48 h的M1-1菌株用无菌水制备108 cfu/ml菌悬液，取1 ml菌悬液加入99 ml液化并冷却至45℃的NA培养基中，摇匀后倒平板，将浸药液的直径为0.5 cm的圆滤纸片置入培养皿中，每皿3片，28℃培养48～72 h，检查抑菌圈直径。试验选用5种抗生素和11种杀菌剂，分别为环丙沙星、 恩诺沙星、阿奇霉素、链霉素、土霉素、萘啶酸、 氟哌酸、 苯扎氯铵、吡哌酸、DT -301、硫酸铜、二氯化磷酸三钠、百菌清、琥胶肥酸铜、戊二醛、双乙酸钠，每处理重复3皿。 1.7田间防治试验
田间防治试验在高密市拒城河桑园中进行，供试品种为选792，试验分成4个小区，每小区设6个处理，分别喷施链霉素粉剂100 mg/kg、30%琥胶肥酸铜悬浮剂500 mg/kg、盐酸环丙沙星粉剂100 mg/kg、盐酸恩诺沙星100 mg/kg和甲K杀菌灵水剂555 mg/kg 5种药剂，设无菌水喷施作对照。自2006年3月下旬开始喷药，每7天1次，共喷6次。调查统计株发病率和芽发病率。
2结果与分析
2.1病害的发生与分布
自2002年春季起，发现高密的柴沟等大部分乡镇的桑园有该病害发生。以后陆续调查周边的诸城、安丘、五莲、平度等县市也都有不同程度的发生。重者株发病率达67.7%，芽（新梢）发病率4.9%。该病在山东仅出现在春蚕期，即4月中旬至5月中旬，其他时间未见发病。选792、农桑10号、沙2×伦109等推广桑品种的新老桑园均有病害出现，病害有点片发生和发病中心的趋势，也广泛地零星发生。
断柄型病原生命力较强，在各种处理（保存）下均能活到翌年5月份，且在自然表土及10 cm深的无菌土中活得更长，这些土壤、病残体上的越夏、越冬病原，通过雨水飞溅或其他途径传播到桑枝桑芽上，成为来年发病的侵染源。
2.2发病症状
自然条件下发病的症状，先是桑树新梢第1～2片嫩叶的叶柄中段底部出现由浅变深的褐色病斑，病斑逐渐变黑缢缩，使叶柄逐渐向下弯折，叶片随之下垂、枯萎，并从叶柄缢缩处脱落。这时新梢上已长出3～5片叶，病叶大都处于第4叶位[8]。病叶枯萎前若遇风雨，会从叶柄缢缩处折断而落地。该病通常1个新梢上只有1片叶发病，极少有2片叶发病者，这与缩叶型及黑枯型明显不同（图1）。
2.3病原菌的致病性测定
在3～4月份将病原菌进行人工接种，发病症状与桑园自然发病症状完全相同。7～8月份对夏伐后桑树新梢嫩叶接种均不发病。
2.4病原菌培养性状
培养性状与文献[3]基本相同，如：牛肉汁蛋白胨琼脂平板都生成圆形、乳白色、半透明、中间凸起表面湿润的丝状交织菌落，斜面划线的菌苔呈线状、边缘有小突起；在修改金氏B培养基中菌落生长良好，能产生绿色萤光；牛肉汁琼脂半固体培养基穿刺接种，菌体都沿穿刺沟向四周扩散生长；在肉汤胨水培养液中，接种培养2 d后多见浑浊，4 d后表层产生环状膜，底层有沉淀出现；牛乳培养也生长良好，基质稍透明，液面有膜；在Fermi液培养中，菌株都生长良好，基质浑浊，液面有环状膜；在Cohn培养液中，菌体不生长；在灭菌马铃薯块上，菌体都生长良好，菌苔呈灰色，基质不变色；菌体在鲜马铃薯上不生长。
2.5生理生化性状
根据光密度测定结果，可以推出断柄型菌株的最适生长温度为28～30℃。
供试断柄型菌株与文献[3]一样，均能产氨，不还原硝酸，不产生硫化氢和吲哚，不液化明胶，淀粉水解弱，V.P 及氧化酶反应为阴性，30%蔗糖生长及过氧化氢酶试验均为阳性，能使石蕊牛乳产碱变蓝，能利用柠檬酸盐及丙二酸盐。
所测定的对16种糖、醇的利用能力，结果是断柄型菌株对葡萄糖、甘露糖、D-果糖、半乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、密尔糖、菊糖产酸不产气（其中对阿拉伯糖、木糖等的利用因菌株不同而有差异）；对山梨醇、鼠李糖、乳糖、甘露醇、糊精、甘油等均不能利用产酸（表2）。
2.6室内药效测定
采用培养皿圆滤纸片法测定11种杀菌剂和5种抗生素对致病菌M1-1抑制作用。结果表明链霉素、70%百菌清、琥胶肥酸铜、盐酸环丙沙星等对M1-1均有抑制作用。其中链霉素、70%百菌清、琥胶肥酸铜等抑菌效果好。
2.7田间防治试验
桑园试验表明，断柄型桑疫病的药物防治，以桑树近发芽至桑芽脱苞前喷药效果为好，等症状出现后施药效果很差。所用药物以30%琥胶肥酸铜悬浮剂最好，防效可达84.4%，其次为链霉素，防效58.0%，再次为盐酸环丙沙星与恩诺沙星（表3）。
3结论与讨论
通过对高密等地新发现的桑树断柄型桑疫病病原菌的培养性状、生理生化性状的测定，该病与浙江的桑断柄型细菌性疫病为同一病原菌。经室内及田间药物筛选、药效试验，总结出该病的防治措施，普通发病较轻的桑园无须单独打药防治，而对于发病重的桑园，应在春季桑芽萌动或脱苞前向桑树枝条喷500 mg/kg 30%琥胶肥酸铜悬浮剂，每5～7天喷1次，连喷5次，该药养蚕安全期7～10 d，也可喷洒100 mg/kg链霉素液，还可用100 mg/kg盐酸环丙沙星与盐酸恩诺沙星进行交替防治，两药间隔7 d，各喷2～3次。
经过多年研究探讨，桑疫病化学防治效果不理想，没有高效的防治药物，今后应与化工领域专家共同努力，研制出高效低毒、绿色的防治药物。
参考文献：
[1]
堵鹤鸣，李国喜，戴荷芳，等.关于桑树细菌性黑枯病病原菌的研究[J].蚕业科学，1979，5（3）：152-158.
[2]戴荷芳，周水良，堵鹤鸣，等.关于桑树细菌性黑枯病——叶型病的研究[J].蚕业科学，1980，6（3）：150-154.
[3]毛建萍，堵鹤鸣，浦冠勤，等.桑断柄型细菌性疫病的研究[J].蚕业科学，1999，25（4）：203-207.
[4]丁爱云，郑继法，万平平，等.山东省桑树细菌性疫病的发生与防治研究[J].蚕业科学，2002，28（3）：185-189.
[5]方中达.植病研究法[M].北京：农业出版社，1979：161-222.
[6]中国科学院微生物研究所细菌分类组.一般细菌常用鉴定方法[M].北京：科学出版社，1978：135-180.
[7]堵鹤鸣，李国喜，戴荷芳，等.桑细菌性疫病与若干因子的关系[J].蚕业科学，1982，8（2）：82-86.
[8]华德公，胡必利.图说桑蚕病虫害防治[M].北京：金盾出版社，2006：7-9.
关键词：桑细菌性疫病；断柄型；症状；生理生化性状；防治方法
中图分类号：S888.71+9 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）03-0093-04
AbstractBesides two types of mulberry bacterial diseases，black blight and crinkle leaf，a new type，broken leafstalk， was discovered in many places of Shandong Province in recent years. Through the comparisons of culture， physiological and biochemical properties of the pathogen， it was found that this pathogen was the same to that in Jiangsu and Zhejiang Province. The indoor and field control tests showed that spraying 30% DT SC with the concentration of 500 mg/kg before green tip sprouting stage was the best with the control efficiency up to 84.4%. Streptomycin， ciprofloxacin hydrochloride or enrofloxacin hydrochloride with the concentration of 100 mg/kg were the followed ones.
Key wordsMulberry bacterial disease；Broken-leafstalk type；Symptom；Physiological and biochemical properties；Control method
桑细菌性疫病是危害桑树的主要病害，在全国各地均普遍发生且危害严重。20世纪90年代以前，研究认为该病有两种致病型：一种是以缩叶症状为主的缩叶型，即“桑缩叶型疫病”；另一种是以嫩梢变黑枯死症状为主的黑枯型，称为“桑黑枯型疫病”[1，2]。20世纪90年代末，毛建萍等[3]在江苏、浙江两省新发现了另一种表现为桑树嫩叶叶柄缢缩、叶片下垂枯萎的细菌性疫病，称为“桑断柄型细菌性疫病”，故认为桑细菌性疫病有三种类型。丁爱云等（2001）[4]调查研究了山东省蚕区16个县（市）桑细菌性疫病病原生物型、病害侵染循环等，提出山东桑树细菌性疫病分为黑枯症、枝裂症、缩叶症和叶斑症4种症状类型，未发现山东有断柄型疫病。
笔者于2002年起在山东省高密市柴沟镇等多处桑园中发现，较多的桑叶叶柄缢缩、叶片下垂枯萎，2003～2004年又在高密市周边诸城、安丘、平度、五莲等县（市）桑园中发现此种病害。为搞清该病是否系先前毛建萍等以江苏、浙江材料所定名的桑断柄型细菌性疫病，我们参照文献[3]的主要试验方法，对该病病原菌的培养性状、生理生化性状进行了测定，对发病规律和防治方法进行了研究。
1材料与方法
1.1供试菌株
如表1所示。
1.2病原菌的分离和人工接种
将采集的病叶叶柄，委托高密市农业局植病实验室经表面消毒并用稀释法分离培养获得纯菌后，对桑树新芽第2叶叶柄用针刺、涂抹、喷雾三种方法进行人工接种，并以塑料袋保湿18 h，从接种菌株M1-1的桑树上有典型症状的病叶中重新分离出菌株M1-1备用。
1.3病原菌初次侵染试验
试验于2006年开展，设4种处理：（1）3月底桑树发芽前，在田间用涂抹法接种桑条；（2）4月份在田间选择长约1.5 cm的嫩芽用涂抹法接种；（3）田间选择桑枝条标记作为自然发病的对照；（4）桑树夏伐后在田间选择长约1 cm的嫩芽用涂抹法接种。每处理为10根枝条或桑芽，重复3次，20 d起调查是否发病，记录发病症状。
1.4培养性状测定
将菌株M1-1分别采用牛肉汁蛋白胨琼脂平板、斜面、半固体以及肉汤胨水、牛乳液、修改金氏培养基、Fermi液、Cohn液、灭菌的马铃薯块培养基等接种，28℃培养，观察其生长情况[5，6]。
1.5生理生化性状测定
将各菌株分别接种在肉汤胨水培养液中，在不同温度下培养48 h后，用722光栅分光光度计在640 nm波长下比较光密度大小，以测定病原菌最适生长温度[7]。对氧化酶、糖醇发酵等按参考文献[5，6]方法进行，各菌株在半固体牛肉汁蛋白胨琼脂斜面培养24 h后，测试颜色反应。
1.6室内药效测定
试验于2005年10月开展。应用培养皿圆滤纸片法，将NA培养基斜面上培养48 h的M1-1菌株用无菌水制备108 cfu/ml菌悬液，取1 ml菌悬液加入99 ml液化并冷却至45℃的NA培养基中，摇匀后倒平板，将浸药液的直径为0.5 cm的圆滤纸片置入培养皿中，每皿3片，28℃培养48～72 h，检查抑菌圈直径。试验选用5种抗生素和11种杀菌剂，分别为环丙沙星、 恩诺沙星、阿奇霉素、链霉素、土霉素、萘啶酸、 氟哌酸、 苯扎氯铵、吡哌酸、DT -301、硫酸铜、二氯化磷酸三钠、百菌清、琥胶肥酸铜、戊二醛、双乙酸钠，每处理重复3皿。 1.7田间防治试验
田间防治试验在高密市拒城河桑园中进行，供试品种为选792，试验分成4个小区，每小区设6个处理，分别喷施链霉素粉剂100 mg/kg、30%琥胶肥酸铜悬浮剂500 mg/kg、盐酸环丙沙星粉剂100 mg/kg、盐酸恩诺沙星100 mg/kg和甲K杀菌灵水剂555 mg/kg 5种药剂，设无菌水喷施作对照。自2006年3月下旬开始喷药，每7天1次，共喷6次。调查统计株发病率和芽发病率。
2结果与分析
2.1病害的发生与分布
自2002年春季起，发现高密的柴沟等大部分乡镇的桑园有该病害发生。以后陆续调查周边的诸城、安丘、五莲、平度等县市也都有不同程度的发生。重者株发病率达67.7%，芽（新梢）发病率4.9%。该病在山东仅出现在春蚕期，即4月中旬至5月中旬，其他时间未见发病。选792、农桑10号、沙2×伦109等推广桑品种的新老桑园均有病害出现，病害有点片发生和发病中心的趋势，也广泛地零星发生。
断柄型病原生命力较强，在各种处理（保存）下均能活到翌年5月份，且在自然表土及10 cm深的无菌土中活得更长，这些土壤、病残体上的越夏、越冬病原，通过雨水飞溅或其他途径传播到桑枝桑芽上，成为来年发病的侵染源。
2.2发病症状
自然条件下发病的症状，先是桑树新梢第1～2片嫩叶的叶柄中段底部出现由浅变深的褐色病斑，病斑逐渐变黑缢缩，使叶柄逐渐向下弯折，叶片随之下垂、枯萎，并从叶柄缢缩处脱落。这时新梢上已长出3～5片叶，病叶大都处于第4叶位[8]。病叶枯萎前若遇风雨，会从叶柄缢缩处折断而落地。该病通常1个新梢上只有1片叶发病，极少有2片叶发病者，这与缩叶型及黑枯型明显不同（图1）。
2.3病原菌的致病性测定
在3～4月份将病原菌进行人工接种，发病症状与桑园自然发病症状完全相同。7～8月份对夏伐后桑树新梢嫩叶接种均不发病。
2.4病原菌培养性状
培养性状与文献[3]基本相同，如：牛肉汁蛋白胨琼脂平板都生成圆形、乳白色、半透明、中间凸起表面湿润的丝状交织菌落，斜面划线的菌苔呈线状、边缘有小突起；在修改金氏B培养基中菌落生长良好，能产生绿色萤光；牛肉汁琼脂半固体培养基穿刺接种，菌体都沿穿刺沟向四周扩散生长；在肉汤胨水培养液中，接种培养2 d后多见浑浊，4 d后表层产生环状膜，底层有沉淀出现；牛乳培养也生长良好，基质稍透明，液面有膜；在Fermi液培养中，菌株都生长良好，基质浑浊，液面有环状膜；在Cohn培养液中，菌体不生长；在灭菌马铃薯块上，菌体都生长良好，菌苔呈灰色，基质不变色；菌体在鲜马铃薯上不生长。
2.5生理生化性状
根据光密度测定结果，可以推出断柄型菌株的最适生长温度为28～30℃。
供试断柄型菌株与文献[3]一样，均能产氨，不还原硝酸，不产生硫化氢和吲哚，不液化明胶，淀粉水解弱，V.P 及氧化酶反应为阴性，30%蔗糖生长及过氧化氢酶试验均为阳性，能使石蕊牛乳产碱变蓝，能利用柠檬酸盐及丙二酸盐。
所测定的对16种糖、醇的利用能力，结果是断柄型菌株对葡萄糖、甘露糖、D-果糖、半乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、密尔糖、菊糖产酸不产气（其中对阿拉伯糖、木糖等的利用因菌株不同而有差异）；对山梨醇、鼠李糖、乳糖、甘露醇、糊精、甘油等均不能利用产酸（表2）。
2.6室内药效测定
采用培养皿圆滤纸片法测定11种杀菌剂和5种抗生素对致病菌M1-1抑制作用。结果表明链霉素、70%百菌清、琥胶肥酸铜、盐酸环丙沙星等对M1-1均有抑制作用。其中链霉素、70%百菌清、琥胶肥酸铜等抑菌效果好。
2.7田间防治试验
桑园试验表明，断柄型桑疫病的药物防治，以桑树近发芽至桑芽脱苞前喷药效果为好，等症状出现后施药效果很差。所用药物以30%琥胶肥酸铜悬浮剂最好，防效可达84.4%，其次为链霉素，防效58.0%，再次为盐酸环丙沙星与恩诺沙星（表3）。
3结论与讨论
通过对高密等地新发现的桑树断柄型桑疫病病原菌的培养性状、生理生化性状的测定，该病与浙江的桑断柄型细菌性疫病为同一病原菌。经室内及田间药物筛选、药效试验，总结出该病的防治措施，普通发病较轻的桑园无须单独打药防治，而对于发病重的桑园，应在春季桑芽萌动或脱苞前向桑树枝条喷500 mg/kg 30%琥胶肥酸铜悬浮剂，每5～7天喷1次，连喷5次，该药养蚕安全期7～10 d，也可喷洒100 mg/kg链霉素液，还可用100 mg/kg盐酸环丙沙星与盐酸恩诺沙星进行交替防治，两药间隔7 d，各喷2～3次。
经过多年研究探讨，桑疫病化学防治效果不理想，没有高效的防治药物，今后应与化工领域专家共同努力，研制出高效低毒、绿色的防治药物。
参考文献：
[1]
堵鹤鸣，李国喜，戴荷芳，等.关于桑树细菌性黑枯病病原菌的研究[J].蚕业科学，1979，5（3）：152-158.
[2]戴荷芳，周水良，堵鹤鸣，等.关于桑树细菌性黑枯病——叶型病的研究[J].蚕业科学，1980，6（3）：150-154.
[3]毛建萍，堵鹤鸣，浦冠勤，等.桑断柄型细菌性疫病的研究[J].蚕业科学，1999，25（4）：203-207.
[4]丁爱云，郑继法，万平平，等.山东省桑树细菌性疫病的发生与防治研究[J].蚕业科学，2002，28（3）：185-189.
[5]方中达.植病研究法[M].北京：农业出版社，1979：161-222.
[6]中国科学院微生物研究所细菌分类组.一般细菌常用鉴定方法[M].北京：科学出版社，1978：135-180.
[7]堵鹤鸣，李国喜，戴荷芳，等.桑细菌性疫病与若干因子的关系[J].蚕业科学，1982，8（2）：82-86.
[8]华德公，胡必利.图说桑蚕病虫害防治[M].北京：金盾出版社，2006：7-9.