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【摘 要】 目的：建立HPLC测定龙须藤乙酸乙酯部位中3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素和山奈酚含量的方法，考察不同产地龙须藤中4种黄酮类成分的含量。方法：Diamonsil C18 色谱柱（250×4.6 mm，5μm），流动相乙腈（A）-0.1%的磷酸（B），梯度洗脱（0 min，25 % A，75 % B；15 min，45 % A，55 % B；40 min，50 % A，50 % B），流速为0.8 mL/min，检测波长为324 nm。结果：3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素和山奈酚进样量10 μL分别在0.5100～5.100 μg（r=0.9962）、0.1006～50.30 μg（r= 0.9998）、1.440～288.0 μg（ r=0.9997）和0.2910～14.55 μg（r=0.9998）以上浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率分别为99.48 %、99.32 %、98.99 %和98.75 %，RSD分别为0.40 %、0.62 %、0.50 %和0.44 %（n=6）。结论：该方法操作简单，稳定性、精密度、重复性良好，适合于测定该药材中3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素和山奈酚含量的测定。
【关键词】 高效液相色谱；龙须藤；黄酮；含量测定
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2017）09-0016-04
Determination of Four Flavonoid Components in Ethyl AcetateParts of BauhiniaChampionii by HPLC
SUN Chengtao LAI Xin ZHANG Hua CHEN Shuyun YE Yonghua XU Wei*
Pharmacy college of Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China
Abstract：Objective To establish a quantitative determination method of HPLC for Four flavonoid components in ethyl acetate parts of Bauhinia championii.To investigate the content of 4 kinds of flavonoids in different regions of bauhinia championii.Methods The determination was performed on a Diamonsil ODS column （250mm× 4.6mm，5μm） with acetonitrile（A）-0.1% phosphoric acid（B） as the mobile phase by gradint elution（0min，25%A， 75% B；15min，45%A， 55%B； 40min，50%A，55%B）.The flow rate was 0.8 mL/min and the detection wavelength was set at 324 nm.Results 3，4，5，5，7-pentamethoxyflavone，Myricetin，Quercetin and Kaempferol injection volume 10uL respectively 0.1674mg/mL ～ 1.674mg / mL （r=0.9998）， 0.0688mg/mL ～ 0.6880mg/mL（r=0.9998） and 0.1704mg / mL～1.7040mg /mL（r=0.9997） within the above range of concentrations peak area with excellent linearity.3，4，5，5，7-pentamethoxyflavone，Myricetin，Quercetin and Kaempferol average recoveries were respectively 99.48 %， 99.32 %， 98.99 % and 98.75 %， RSD were respectively 0.40 %， 0.62 %， 0.50 % and 0.44 %（n=6）.Conclusion This method is simple and in good reproducibility， precision and stability. It can be used as the quality control of the four flavonoid components in ethyl acetate parts of Bauhinia championii.
Keywords：HPLC； Bauhinia Championii； Flavonoids； Quantitative Determination
龍须藤又称羊蹄藤、乌郎藤、过岗圆龙、九龙藤、梅花入骨丹等，为双子叶植物豆科羊蹄甲属植物多年生藤，分布于华东、华中、华南、西南等地。龙须藤作为一种畲医病证论治中针对痹症治疗的特色药，其苦、涩、平，具有祛风除湿，活血止痛，健脾理气等功效[1]，临床用于治疗风湿痹痛、中风偏瘫、胃脘胀痛、跌打损伤、小儿疳积、痢疾等症[2]。龙须藤乙酸乙酯部位是龙须藤抗炎镇痛、治疗类风湿性关节炎的有效部位[3]，其主要化学成分为黄酮类，另外还含有原花青素类、挥发油、糖类及没食子酸等成分[4]，现代药理研究表明龙须藤提取物具有较强的抗炎、镇痛等活性[5-6]，其中总黄酮的抗炎作用显著[7]。目前，对龙须藤的基础研究尚不够深入，且其抗类风湿性关节炎的有效成分尚不清楚，以主要成分为基础的质量标准研究较少。因此，实验采用HPLC对龙须藤药材中3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素和山奈酚进行含量测定，以对龙须藤药材的质量进行有效控制。 1 仪器与试药
1.1 仪器 XS105Du十万分之一电子天平（Mettler Toledo）；SHIMADZU LC-20A配SPD-20A双波长紫外检测器（日本岛津）；Milli-Q纯水器（Millipore公司，美国）。
1.2 试药 3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮对照品（批号：MUST-05071306，成都曼思特生物科技有限公司）；杨梅素对照品（批号：MUST-04102214，成都曼思特生物科技有限公司）槲皮素标准品（批号：100081-200406，中国药品生物制品检定所）；山奈酚对照品（批号： 0861-200002，中国药品生物制品检定所）；药材由江苏药物研究所提供，经福建中医学院药学系中药鉴定教研室杨成梓副教授鉴定为豆科羊蹄甲属植物龙须藤Bauhinia championii Benth.的藤；乙腈为色谱纯（美国DIKMA公司）；实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件及系统适应性试验 Diamonsil C18 色谱柱（250×4.6mm，5μm），流动相乙腈（A）-0.1%的磷酸（B），梯度洗脱（0min，25 % A，75 % B；15min，45 % A，55 % B；40min，50 % A，50 % B），柱温为30 ℃，检测波长为324nm，流速为0.8mL/min，进样量为10μL。在此色谱条件下，3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素、山奈酚4种成分色谱峰理论板数不低于1500，峰间分离度良好。结果见图1。
2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素、山奈酚标准对照品适量，置于量瓶中，加入甲醇分别制备含8.30、5.03、0.96、2.92 mg/mL单一对照品储备液。混合对照品溶液均由各标品储备液混合并稀释得到，均置于4 ℃保存。
2.3 供试品溶液的制备 取龙须藤干燥药材2 kg，95 %乙醇浸泡回流提取，提取3次后合并提取液，加热浓缩后加适量水混悬，依次用石油醚（1∶1）、乙酸乙酯（1∶1）进行萃取，得乙酸乙酯部位13.810 g。取龙须藤乙酸乙酯部位0.35021 g，置于100 mL的量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀后用0.45 μm的微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
2.4 线性关系的考察 分别将不同浓度梯度对照品溶液按照“2.1”项下的色谱条件进行分析，以峰面积为纵坐标，对照品溶液的浓度为横坐标，得到4种成分的回归方程和相关系数，见表1。由表1可知，4种黄酮类成分在相应的浓度范围内线性关系良好。
2.5 精密度试验 分别取对照品原始溶液，按照“2.1”项下的色谱条件连续进样6次，计算得4种黄酮类成分（3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素、山奈酚）的峰面积的RSD分别为1.10 %、1.41 %、1.59 %、1.73 %，表明仪器的精密度良好。
2.6 重复性试验 取同一批次龙须藤药材，按“2.3”项下方法得到乙酸乙酯部位并制备供试品溶液，平行制备6份供试品溶液，测定峰面积，计算药材中3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮的平均含量为（n=6，RSD=1.57 %）、杨梅素的平均含量为（n=6，RSD=1.64 %）、槲皮素的平均含量为（n=6，RSD=1.15 %）和山奈酚的平均含量为（n=6，RSD=1.86 %），表明方法的重复性良好。
2.7 稳定性试验 同一批次龙须藤药材，按“2.3”项下方法得到乙酸乙酯部位并制备供试品溶液，分别于制备好后的0、2、4、8、12、24 h测定峰面积，得供试品溶液中4种黄酮类成分（3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素、山奈酚）在24h内的峰面积RSD分别为1.98 %、1.57 %、1.01 %、1.57 %，表明供试品溶液在制备好后的24 h内稳定。
2.8 加样回收率试验 取已知3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素和山奈酚浓度的龙须藤乙酸乙酯部位粉末0.35g，共6份，精确称定，置入100mL容量瓶中，分别精确加入质量浓度4.98mg/mL的3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮对照品溶液2.70mL、质量浓度0.08mg/mL的杨梅素对照品溶液0.8mL、质量浓度为0.96mg/mL的槲皮素对照瓶溶液2.00mL及质量浓度0.23mg/mL的山奈酚对照品溶液1mL。加甲醇溶解并稀释至刻度，按“2.1”项下色谱条件，注入高效液相色谱仪测定，计算4 种成分的平均回收率。
2.9 样品的测定 分别称取不同产地龙须藤药材2 kg，按“2.3”项下方法操作，按“2.1”项下色谱条件测定，计算这4种黄酮类成分的含量，结果表明，不同产地龙须藤乙酸乙酯部位中黄酮类成分含量均有一定差异。
3 讨论
3.1 供试样品溶液的配制 对龙须藤中4种黄酮类成分的提取，实验中曾采用超聲提取、浸渍法和回流提取这3种方法，结果超声提取法重复性较差，浸渍法提取法提取效果较回流提取差，综合评定，最终选用回流提取。
3.2 流动相的选择 实验比较了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水以及乙腈-0.1 %磷酸，结果表明乙腈-0.1 %磷酸溶液对黄酮类成分的分离较好，保留时间适宜，峰型好，加入0.1 %磷酸能有效改善拖尾效应；采用梯度洗脱可明显改善特征峰的分离度，使其与其他杂质成分有效分离，故本实验用乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相。
3.3 不同产地龙须藤药材的质量差异 实验通过考察龙须藤乙酸乙酯部位中四种黄酮类成分的含量，对不同产地的龙须藤进行测定。经测定：福建闽侯所产龙须藤中的3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮和槲皮素含量最高，3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮含量为广东清远所产龙须藤的1.57倍；槲皮素含量为福建永泰所产龙须藤的1.39倍。福建永泰所产龙须藤中杨梅素含量最高，含量为广东清远所产龙须藤的1.27倍。福建连江所产龙须藤中的山奈酚含量最高，含量为广东清远所产龙须藤的2.53倍。综上，四种黄酮类成分中，产地差异最明显的为山奈酚。
参考文献
[1]南京中医药大学.中药大辞典（上）[M].2版.上海：上海科学技术出版社，2006：878.
[2]广东省食品药品监督管理局.广东省中药材标准（第2册）[M].广州：广东科技出版社，2011：114.
[3]郑海音，徐伟，李煌，等.龙须藤抗类风湿关节炎有效部位的研究[J].浙江中医药大学学报，2013，03：321-325.
[4]BAI H Y， ZHAN Q F， XIA Z H， et al. Studies on the chemical constituents of Baubinia championii Benth[J]. Nat Prod Res Dev（天然产物研究与开发）， 2004， 16（4）： 312-313.
[5]张玉琴.龙须藤抗类风湿关节炎的药效物质基础研究及作用机制研究[J].福州：福建中医药大学，2013.
[6]易荆丽，张嘉家，周毅生，等.龙须藤提取物的镇痛抗炎作用[J].广东药学院学报，2012，28（6）：647.
[7]林丽微，周毅生，周臻，等.龙须藤总黄酮对膝关节炎模型大鼠的抗炎作用[J].广东药学院学报，2014（05）：608-611.
（收稿日期：2017-03-06 编辑：陶希睿）
【关键词】 高效液相色谱；龙须藤；黄酮；含量测定
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2017）09-0016-04
Determination of Four Flavonoid Components in Ethyl AcetateParts of BauhiniaChampionii by HPLC
SUN Chengtao LAI Xin ZHANG Hua CHEN Shuyun YE Yonghua XU Wei*
Pharmacy college of Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China
Abstract：Objective To establish a quantitative determination method of HPLC for Four flavonoid components in ethyl acetate parts of Bauhinia championii.To investigate the content of 4 kinds of flavonoids in different regions of bauhinia championii.Methods The determination was performed on a Diamonsil ODS column （250mm× 4.6mm，5μm） with acetonitrile（A）-0.1% phosphoric acid（B） as the mobile phase by gradint elution（0min，25%A， 75% B；15min，45%A， 55%B； 40min，50%A，55%B）.The flow rate was 0.8 mL/min and the detection wavelength was set at 324 nm.Results 3，4，5，5，7-pentamethoxyflavone，Myricetin，Quercetin and Kaempferol injection volume 10uL respectively 0.1674mg/mL ～ 1.674mg / mL （r=0.9998）， 0.0688mg/mL ～ 0.6880mg/mL（r=0.9998） and 0.1704mg / mL～1.7040mg /mL（r=0.9997） within the above range of concentrations peak area with excellent linearity.3，4，5，5，7-pentamethoxyflavone，Myricetin，Quercetin and Kaempferol average recoveries were respectively 99.48 %， 99.32 %， 98.99 % and 98.75 %， RSD were respectively 0.40 %， 0.62 %， 0.50 % and 0.44 %（n=6）.Conclusion This method is simple and in good reproducibility， precision and stability. It can be used as the quality control of the four flavonoid components in ethyl acetate parts of Bauhinia championii.
Keywords：HPLC； Bauhinia Championii； Flavonoids； Quantitative Determination
龍须藤又称羊蹄藤、乌郎藤、过岗圆龙、九龙藤、梅花入骨丹等，为双子叶植物豆科羊蹄甲属植物多年生藤，分布于华东、华中、华南、西南等地。龙须藤作为一种畲医病证论治中针对痹症治疗的特色药，其苦、涩、平，具有祛风除湿，活血止痛，健脾理气等功效[1]，临床用于治疗风湿痹痛、中风偏瘫、胃脘胀痛、跌打损伤、小儿疳积、痢疾等症[2]。龙须藤乙酸乙酯部位是龙须藤抗炎镇痛、治疗类风湿性关节炎的有效部位[3]，其主要化学成分为黄酮类，另外还含有原花青素类、挥发油、糖类及没食子酸等成分[4]，现代药理研究表明龙须藤提取物具有较强的抗炎、镇痛等活性[5-6]，其中总黄酮的抗炎作用显著[7]。目前，对龙须藤的基础研究尚不够深入，且其抗类风湿性关节炎的有效成分尚不清楚，以主要成分为基础的质量标准研究较少。因此，实验采用HPLC对龙须藤药材中3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素和山奈酚进行含量测定，以对龙须藤药材的质量进行有效控制。 1 仪器与试药
1.1 仪器 XS105Du十万分之一电子天平（Mettler Toledo）；SHIMADZU LC-20A配SPD-20A双波长紫外检测器（日本岛津）；Milli-Q纯水器（Millipore公司，美国）。
1.2 试药 3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮对照品（批号：MUST-05071306，成都曼思特生物科技有限公司）；杨梅素对照品（批号：MUST-04102214，成都曼思特生物科技有限公司）槲皮素标准品（批号：100081-200406，中国药品生物制品检定所）；山奈酚对照品（批号： 0861-200002，中国药品生物制品检定所）；药材由江苏药物研究所提供，经福建中医学院药学系中药鉴定教研室杨成梓副教授鉴定为豆科羊蹄甲属植物龙须藤Bauhinia championii Benth.的藤；乙腈为色谱纯（美国DIKMA公司）；实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件及系统适应性试验 Diamonsil C18 色谱柱（250×4.6mm，5μm），流动相乙腈（A）-0.1%的磷酸（B），梯度洗脱（0min，25 % A，75 % B；15min，45 % A，55 % B；40min，50 % A，50 % B），柱温为30 ℃，检测波长为324nm，流速为0.8mL/min，进样量为10μL。在此色谱条件下，3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素、山奈酚4种成分色谱峰理论板数不低于1500，峰间分离度良好。结果见图1。
2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素、山奈酚标准对照品适量，置于量瓶中，加入甲醇分别制备含8.30、5.03、0.96、2.92 mg/mL单一对照品储备液。混合对照品溶液均由各标品储备液混合并稀释得到，均置于4 ℃保存。
2.3 供试品溶液的制备 取龙须藤干燥药材2 kg，95 %乙醇浸泡回流提取，提取3次后合并提取液，加热浓缩后加适量水混悬，依次用石油醚（1∶1）、乙酸乙酯（1∶1）进行萃取，得乙酸乙酯部位13.810 g。取龙须藤乙酸乙酯部位0.35021 g，置于100 mL的量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀后用0.45 μm的微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
2.4 线性关系的考察 分别将不同浓度梯度对照品溶液按照“2.1”项下的色谱条件进行分析，以峰面积为纵坐标，对照品溶液的浓度为横坐标，得到4种成分的回归方程和相关系数，见表1。由表1可知，4种黄酮类成分在相应的浓度范围内线性关系良好。
2.5 精密度试验 分别取对照品原始溶液，按照“2.1”项下的色谱条件连续进样6次，计算得4种黄酮类成分（3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素、山奈酚）的峰面积的RSD分别为1.10 %、1.41 %、1.59 %、1.73 %，表明仪器的精密度良好。
2.6 重复性试验 取同一批次龙须藤药材，按“2.3”项下方法得到乙酸乙酯部位并制备供试品溶液，平行制备6份供试品溶液，测定峰面积，计算药材中3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮的平均含量为（n=6，RSD=1.57 %）、杨梅素的平均含量为（n=6，RSD=1.64 %）、槲皮素的平均含量为（n=6，RSD=1.15 %）和山奈酚的平均含量为（n=6，RSD=1.86 %），表明方法的重复性良好。
2.7 稳定性试验 同一批次龙须藤药材，按“2.3”项下方法得到乙酸乙酯部位并制备供试品溶液，分别于制备好后的0、2、4、8、12、24 h测定峰面积，得供试品溶液中4种黄酮类成分（3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素、山奈酚）在24h内的峰面积RSD分别为1.98 %、1.57 %、1.01 %、1.57 %，表明供试品溶液在制备好后的24 h内稳定。
2.8 加样回收率试验 取已知3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素和山奈酚浓度的龙须藤乙酸乙酯部位粉末0.35g，共6份，精确称定，置入100mL容量瓶中，分别精确加入质量浓度4.98mg/mL的3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮对照品溶液2.70mL、质量浓度0.08mg/mL的杨梅素对照品溶液0.8mL、质量浓度为0.96mg/mL的槲皮素对照瓶溶液2.00mL及质量浓度0.23mg/mL的山奈酚对照品溶液1mL。加甲醇溶解并稀释至刻度，按“2.1”项下色谱条件，注入高效液相色谱仪测定，计算4 种成分的平均回收率。
2.9 样品的测定 分别称取不同产地龙须藤药材2 kg，按“2.3”项下方法操作，按“2.1”项下色谱条件测定，计算这4种黄酮类成分的含量，结果表明，不同产地龙须藤乙酸乙酯部位中黄酮类成分含量均有一定差异。
3 讨论
3.1 供试样品溶液的配制 对龙须藤中4种黄酮类成分的提取，实验中曾采用超聲提取、浸渍法和回流提取这3种方法，结果超声提取法重复性较差，浸渍法提取法提取效果较回流提取差，综合评定，最终选用回流提取。
3.2 流动相的选择 实验比较了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水以及乙腈-0.1 %磷酸，结果表明乙腈-0.1 %磷酸溶液对黄酮类成分的分离较好，保留时间适宜，峰型好，加入0.1 %磷酸能有效改善拖尾效应；采用梯度洗脱可明显改善特征峰的分离度，使其与其他杂质成分有效分离，故本实验用乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相。
3.3 不同产地龙须藤药材的质量差异 实验通过考察龙须藤乙酸乙酯部位中四种黄酮类成分的含量，对不同产地的龙须藤进行测定。经测定：福建闽侯所产龙须藤中的3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮和槲皮素含量最高，3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮含量为广东清远所产龙须藤的1.57倍；槲皮素含量为福建永泰所产龙须藤的1.39倍。福建永泰所产龙须藤中杨梅素含量最高，含量为广东清远所产龙须藤的1.27倍。福建连江所产龙须藤中的山奈酚含量最高，含量为广东清远所产龙须藤的2.53倍。综上，四种黄酮类成分中，产地差异最明显的为山奈酚。
参考文献
[1]南京中医药大学.中药大辞典（上）[M].2版.上海：上海科学技术出版社，2006：878.
[2]广东省食品药品监督管理局.广东省中药材标准（第2册）[M].广州：广东科技出版社，2011：114.
[3]郑海音，徐伟，李煌，等.龙须藤抗类风湿关节炎有效部位的研究[J].浙江中医药大学学报，2013，03：321-325.
[4]BAI H Y， ZHAN Q F， XIA Z H， et al. Studies on the chemical constituents of Baubinia championii Benth[J]. Nat Prod Res Dev（天然产物研究与开发）， 2004， 16（4）： 312-313.
[5]张玉琴.龙须藤抗类风湿关节炎的药效物质基础研究及作用机制研究[J].福州：福建中医药大学，2013.
[6]易荆丽，张嘉家，周毅生，等.龙须藤提取物的镇痛抗炎作用[J].广东药学院学报，2012，28（6）：647.
[7]林丽微，周毅生，周臻，等.龙须藤总黄酮对膝关节炎模型大鼠的抗炎作用[J].广东药学院学报，2014（05）：608-611.
（收稿日期：2017-03-06 编辑：陶希睿）