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摘要 对临沂市兰陵县苍山大蒜贮藏期病害情况进行了调查，采用柯赫氏法则和病斑显微观察法对病原菌株lyu20170012进行了验证，并通过形态学特征和rDNA ITS序列分析对其进行了鉴定。结果表明，从病斑上分离得到4种真菌和1种细菌，经致病性检测发现菌株lyu20170012具有致病性，将lyu20170012菌株鉴定为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。
关键词 尖孢镰刀菌；大蒜鳞茎病害；柯赫氏法则；病原菌
中图分类号 S432.4+2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）21-0140-05
Abstract The investigation on Cangshan garlic storage diseases in Lanling County of Linyi City was carried out. The pathogenity of pathogenic strain lyu20170012 was detected and verified by the Koch and the microscopic observation. Results showed as followed： four kinds of fungi and one kind of bacteria were isolated from the Cangshan garlic lesion；the lyu20170012 strain was identified as Fusarium oxysporum by morphological characteristics and rDNA ITS sequence analysis.
Key words Fusarium oxysporum；Garlic diseases；Koch；Pathogenic fungi
大蒜（Allium sativum），是著名的兼有药效的蔬菜，属百合科多年生草本植物，以鳞茎入药，具止痢、止咳、健胃、杀菌、驱虫之功效，南、北各省均有栽植，原产中亚，栽培历史悠久[1]。苍山大蒜也称作“兰陵大蒜”，亦称“葫”或“葫蒜”，产于“中国蒜乡”山东省临沂市兰陵县。苍山大蒜历史悠久，是在兰陵县特定的生态环境条件下，经过长期的自然选择和人为定向培育而形成的兰陵特有品种，为山东省传统名特蔬菜之一，是中国出口的优质大蒜。
苍山大蒜随着种植面积的逐年扩大，大蒜有害生物亦呈快速增加趋势，危害越来越大。在大蒜生长期间和仓储期间，有害生物的危害造成蒜薹、蒜头减产和霉烂[2]。蒜头（大蒜鳞茎）在贮藏调运期间可发生多种病害，引起蒜头腐烂和污损，严重降低其商品价值和种用价值。大蒜鳞茎（蒜头）是重要的市场和产地检疫农产品，蒜头病害还是出境植物检疫的重要对象，鳞茎腐烂是引起大蒜减产的主要因素[3]。因此，进一步加强大蒜贮藏期鳞茎病害的研究有着重要意义。
目前国内外有很多关于大蒜病害的研究报道。Matuo等[4]报道尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.cepae）可以导致大蒜鳞茎基腐病。Kwon[5]研究报道，齿梗孢属真菌（Sclerotium rolfsii）可以引起大蒜茎腐烂病。Lee等[6]研究报道，埃里格孢（Embellisia allii）可引起大蒜鳞茎溃疡病和黑斑病，而且常常与病原菌（Fusarium oxysporum f.sp.cepae）混合互作、共同为害。群体效应是近来日益受到广泛关注的一种细菌群体行为调控机制，是一种信号介导的细胞-细胞的通讯系统。QQ效应化合物和酶可在胡萝卜、大豆、豌豆苗、辣椒、大蒜等植物中天然存在[7]。Pontin等[8]研究表明，大蒜感染白腐病Sclerotium cepivorum病原后，可产生萜烯类抗真菌物质。Chand等[9]研究表明，miRNA394可调控大蒜病原菌[F.oxysporum f.sp.cepae（FOC）]的感染机制。Gálvez等[10]报道引起西班牙贮藏期大蒜鳞茎腐烂病的病原是层生镰刀菌（F.proliferatum），它是一种世界性广泛分布种，还可为害其他一些作物。葛芸英等[3]报道了尖孢镰刀菌是引起江苏太仓及南京周边大蒜鳞茎腐烂病的病原之一。张军高等[11]报道了甘肃省大蒜干腐病病原菌是尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌和茄病镰刀菌。商鸿生等[12]对大蒜鳞茎病害进行了系统调查，包括灰霉病、曲霉病、青霉病、红腐病、炭疽病、白腐病（黑腐小核菌病）、红粉病、黑斑病、软腐病、病毒病害11种病害。盛红梅等[13]报道甘肃省大蒜主要产区的病害调查和病原鉴定，共发现大蒜病害14种，其中真菌性病害9种，细菌性病害1种，主要包括白腐病、白斑病、紫斑病、花叶病、黑头病、叶霉病、青霉病、煤斑病、锈病、软腐病等[14]。有关苍山大蒜鳞茎病害的致病菌鲜见报道。笔者对山东省苍山大蒜鳞茎病原菌进行了调查与研究，旨在为大蒜的防控提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 病害調查
2016年1月至2017年11月对临沂市兰陵县大蒜贮藏期病害情况进行了调查，调查发现苍山大蒜在贮藏期间发生较为严重的病害，对感病情况、病原种类及发生症状进行了观察、记录和拍照。
1.2 病原菌的鉴定
1.2.1 病原菌的分离和纯化。
采用常规的组织分离方法，将病原菌置于PDA培养基上，25 ℃恒温培养7～14 d。在体视镜下挑取适量孢子和菌丝，制成临时玻片，在显微镜下观察，待菌丝和孢子形态特征完全一致时，即可利用单孢分离法再次转接到PDA培养基上进行培养，得到的菌株为纯菌株。
1.2.2
致病性测定。
分别以病原菌的菌丝块作为接种体对其在蒜瓣上的致病性进行测定。选择健康的蒜瓣进行接种，蒜瓣先用75%乙醇进行表面消毒，再分有伤口（用无菌毛笔在叶片表面刷3次）接种和无伤口接种，以有伤口不接种和无伤口不接种为对照，接种后保湿24 h，每隔1～2 d观察症状。发病后，从病斑再次分离病原菌，并与原接种菌进行比较。 1.2.3 病原菌的确认。
1.2.3.1 柯赫氏法则验证。
将纯化后的菌株重新接种到健康的大蒜蒜瓣上，回接7～9 d，接种菌丝块观察有刺伤的和无刺伤的蒜瓣发病症状与田间观察到的是否相同，并设置不接种作为对照。用发病的病斑进行常规分离，证明发病菌是否为大蒜病原菌。
1.2.3.2
蒜瓣组织解剖观察验证。
选取含有病斑的大蒜蒜瓣，用清水冲洗干净，然后再用无菌水洗1～3次，保证蒜瓣表面未附着其他微生物和尘土颗粒。利用徒手切法，切取病斑及其周围的组织，选取合适材料制成玻片，进行病原菌的显微观察和验证。
1.2.4 病原菌形态学的特征观察。
1.2.4.1 病原菌的培养性状观察。将病原菌移接于PDA平板上，25 ℃培养7～8 d，记录菌落形态和颜色，观察分生孢子的形状和大小等形态学特征。
1.2.4.2
病原菌的显微特征观察。在培养后的样品菌落上，挑取菌丝和孢子，制片观察其显微特征，同时参照有关资料进行菌种的形态学鉴定。
1.2.5 病原菌rDNA-ITS的扩增与序列分析。
1.2.5.1
病原菌总DNA的提取。选择试验菌株，采用马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB），28 ℃、150 r/min振荡培养3～4 d，离心收集菌丝体，经冷冻干燥后置于-20 ℃冰箱保存。利用OMEGA公司试剂盒提取DNA。
1.2.5.2
rDNA-ITS的扩增与序列测定。采用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增该病原菌的ITS和5.8S rDNA。PCR反应采用50 μL反应体系，包括2 μL（约10 ng）模板DNA溶液、5.0 μL 10×PCR buffer、4.0 μL 2.5 mmol/L dNTP、7.5 pmol/μL ITS1和ITS4引物各1.5 μL、0.5 μL 5 U/μL Taq酶（含MgCl2），加ddH2O至50 μL。扩增反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min，35个循环；最后72 ℃延伸8 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测以后，直接委托山东省农业科学院测序中心进行纯化和序列测定。
1.2.5.3
病原菌rDNA ITS序列同源性比较。将供试菌株的rDNA ITS序列在NCBI网站上用Blast软件与GenBank中已知种属的rDNA进行序列比对和同源性分析，再结合DNAMAN和mega 6.0软件进行同源性比较分析，从而对供试菌株进行分子鉴定。
2 结果与分析
2.1 蒜瓣的危害与症状特点
对苍山县采收的新鲜大蒜、市售大蒜和仓储大蒜进行了抽样调查。调查发现，蒜头病害种类复杂，其发生规律不尽相同。初侵染菌源有的来自田间，有的来自贮藏处所。有些病害在田间已经发生，在贮运期间进一步发展。有些病原菌在田间侵害蒜株部，造成根部腐烂，在贮运期间由根部蔓延到蒜头基部，蒜瓣变黄褐色，干枯。调查表明，蒜头内在质量较差、生活力降低或收获贮运期间受到机械损伤，是贮运病害发生的主要内在因素。大部分贮蒜病害的病原菌腐生性较强，分布很广，蒜头不论在田间还是在贮运过程中都要被病原菌污染。贮藏期间通风不畅，蒜头受潮发热，则是主要的外部条件。做好田间病害防治，保持贮运环境卫生，尽量减少菌原很重要。贮运条件对蒜头病害的发生起着关键作用。在随机抽样调查的蒜头中，蒜瓣感病率达6%～10%，表明大蒜仓储期病害发生较严重，严重影响大蒜的质量和蒜农的收益。
大蒜鳞莖受害后，感病蒜瓣，病斑颜色呈褐色、黑色或青色，凹陷，变硬或者变软、收缩或者湿润状，有时可见表面长出黑色粉状物、青色粉状物或者白色绒毛，有时呈半透明淡褐色等。总之，大蒜鳞茎受害后的症状因病原物的不同而各有不同。
2.2 病原菌的鉴定
2.2.1 病原菌的分离和纯化。
从兰陵县苍山大蒜基地采集样品500份，从中选取代表性感病蒜瓣，于PDA培养基平板上分离病原菌，25 ℃下培养，各标样均长出不同的菌落，通过菌落特征和显微特征观察，参照有关资料，将大蒜蒜瓣病斑分离物初步鉴定为以下5种：A曲霉（Aspergilus sp.），B青霉（Penicillium sp.），C枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.），D、E镰刀菌（Fusarium sp.）。以上分离物的属种归属和致病性需要进一步验证，其菌落形态见图1。该研究只对致病较强的镰刀菌进行了深入研究，其他分分离物的致病性尚未研究。
2.2.2 病原菌的确认。
采用柯赫氏法则验证，将分离得到的菌株重新接种到健康的大蒜蒜瓣上，回接7～9 d，接种菌丝块的大蒜蒜瓣全部发病，有刺伤的叶片发病比无刺伤的叶片早1～2 d，症状与田间观察
到的相同，对照不发病；用发病的病斑进行常规分离，再次获得与原分离菌基本一致的病原菌，根据柯赫氏法则，证明接种菌即为大蒜蒜瓣的病原菌。经验证5种分离物中，致病性为尖孢镰刀菌>枯草芽孢杆菌>变红镰刀菌>曲霉>青霉。该研究只对尖孢镰刀菌进行了测序和鉴定等。大蒜病原菌尖孢镰刀菌验证性试验结果见图2。
2.2.3 病原菌的形态特征。
2.2.3.1
分离物的培养性状观察。将大蒜蒜瓣的病斑分离物培养后，其菌落形态特征见图3。在PDA培养基平板上，25 ℃培养7 d，直径达9 mm，菌落平展，绒毛状，灰白色，背观淡褐色。培养14 d后菌落为粉色。
2.2.3.2 显微特征观察及形态学鉴定。 （1）自然基质上的显微特征观察。选取含有病斑的大蒜蒜瓣，用清水冲洗干净，再用70%乙醇浸泡1～3 min，无菌水洗1～3次，保证叶片表面未附着其他微生物和尘土颗粒。利用徒手切法，采用纵向和横向的方法切取病斑及其周围的叶片组织，选取合适材料制成玻片，用于病原菌的显微观察和验证。由图4可知，大蒜蒜瓣内部未见病原菌的菌丝分布等，只能观察到大蒜变褐部分有病原孢和菌丝孢子的存在，孢子和菌丝在蒜瓣表面分布多聚集在伤口周围，其他部分偶有零星分布；菌丝淡褐色，有分枝，偶见膨大厚垣细胞和褐色细胞的集合体，菌丝体整体与分离培养物的状态较为一致，菌丝宽度2～10 μm，膨大端部细胞宽度达18 μm。病斑上发现的其他真菌在病原深层组织中分布较少，表明其他真菌可能是空气中的污染菌。
（2）PDA培养基上的显微特征。在25 ℃PDA培养基上培养14 d，形成圆形菌落。菌落平展，生长速度快，菌落灰白色，菌丝部分埋生，部分表生。背面淡褐色。菌丝淡色，有分枝，表面光滑，有隔膜，菌丝宽度3～13 μm（图5-B）。产孢梗多对生，偶见轮生和其他着生方式，柱状或者倒棒状，有时为产包瓶体直接侧生于菌丝上或者端生。分生孢子卵形、梭形，大小不等，（3～12）μm×（1～3）μm，极少见弯曲镰刀型孢子，表面光滑，淡褐色，无隔膜，两端尖细，产孢量较大（图5-A和图5-C）。
2.2.4 病原菌rDNA-ITS的序列分析及同源性。
因为真菌形态学特征受培养基和基质的影响较大，所以单纯进行形态学分类还缺乏一定的科学性。为保证病原菌鉴定的准确性，该研究对分离得到的几种病原物进行了分子生物学辅助鉴定。对1～5号菌分别进行了rDNA-ITS序列分析，对7号细菌进行了16S rRNA序列测定。其中，5号菌株lyu20170012的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测（图6），得到1个约507 bp的片段基因序列。
将菌株lyu20170012的rDNA ITS基因序列与GenBank中已有的DNA序列进行同源性比较，构建系统进化树，结果见表1。结果表明，与其同源性100%的菌株种类均为Fusarium oxysporum，这些同源性菌株登录号为MF435932.1、MF435931.1、KY090780.1、KY090783.1、KX343149.1、KX343146.1、MF355380.1、MF355379.1、MF305836.1、LT841236.1、LT841222.1、MF136593.1、KX276606.1。再结合其形态学特征，最终将该病原菌为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。
3 结论与讨论
通过对苍山大蒜贮藏期鳞茎感病情况调查，发现蒜瓣感病率在10%以上。对病斑菌群进行了分析，发现了5种微生物，其中1种为枯草芽孢杆菌，其他为真菌，它们分别为青霉、曲霉、根霉、变红镰刀菌、尖孢镰刀菌、匐柄霉。根据致病性测定，发病最严重的是尖孢镰刀菌，其次为解淀粉芽孢杆菌，其他依次为变红镰刀菌、黑曲霉、青霉和匐柄霉。該研究只对尖孢镰刀菌进行了详细研究。结合形态学特征和分子生物学技术，最后确定病原为尖孢镰刀菌，该菌在苍山大蒜上首次发现。其他真菌的致病性正在陆续研究之中。由此看出，仓储期大蒜蒜瓣病害的病原菌不是单一的，有时是混合菌群，而且每个蒜瓣的病原菌群可能有所差别。
大蒜真菌类疾病，主要为害近地面假茎基部或贮存的鳞茎，严重时影响大蒜的产量和质量。大蒜病害主要有大蒜叶枯病、大蒜茎腐病、大蒜紫斑病、大蒜细菌性软腐病、大蒜灰霉病、大蒜锈病及大蒜病毒病等[7]。该研究首次报道苍山大蒜鳞茎病原物为尖孢镰刀菌。
大蒜为百合科葱属多年生草本植物，是各国人民喜爱的香辛类蔬菜，在世界各地普遍种植。大蒜不仅是人们常用的安全无毒、无公害、无残留的调味品，而且是成本低、无毒、无副作用、具有独特的药理和营养保健功能。大蒜由于具有较高的营养保健和药用价值而成为国际研究的热点[15]。摸清苍山大蒜仓储期病害种类，开发研制防控贮藏期大蒜病害新技术具有广阔的前景。
参考文献
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关键词 尖孢镰刀菌；大蒜鳞茎病害；柯赫氏法则；病原菌
中图分类号 S432.4+2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）21-0140-05
Abstract The investigation on Cangshan garlic storage diseases in Lanling County of Linyi City was carried out. The pathogenity of pathogenic strain lyu20170012 was detected and verified by the Koch and the microscopic observation. Results showed as followed： four kinds of fungi and one kind of bacteria were isolated from the Cangshan garlic lesion；the lyu20170012 strain was identified as Fusarium oxysporum by morphological characteristics and rDNA ITS sequence analysis.
Key words Fusarium oxysporum；Garlic diseases；Koch；Pathogenic fungi
大蒜（Allium sativum），是著名的兼有药效的蔬菜，属百合科多年生草本植物，以鳞茎入药，具止痢、止咳、健胃、杀菌、驱虫之功效，南、北各省均有栽植，原产中亚，栽培历史悠久[1]。苍山大蒜也称作“兰陵大蒜”，亦称“葫”或“葫蒜”，产于“中国蒜乡”山东省临沂市兰陵县。苍山大蒜历史悠久，是在兰陵县特定的生态环境条件下，经过长期的自然选择和人为定向培育而形成的兰陵特有品种，为山东省传统名特蔬菜之一，是中国出口的优质大蒜。
苍山大蒜随着种植面积的逐年扩大，大蒜有害生物亦呈快速增加趋势，危害越来越大。在大蒜生长期间和仓储期间，有害生物的危害造成蒜薹、蒜头减产和霉烂[2]。蒜头（大蒜鳞茎）在贮藏调运期间可发生多种病害，引起蒜头腐烂和污损，严重降低其商品价值和种用价值。大蒜鳞茎（蒜头）是重要的市场和产地检疫农产品，蒜头病害还是出境植物检疫的重要对象，鳞茎腐烂是引起大蒜减产的主要因素[3]。因此，进一步加强大蒜贮藏期鳞茎病害的研究有着重要意义。
目前国内外有很多关于大蒜病害的研究报道。Matuo等[4]报道尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.cepae）可以导致大蒜鳞茎基腐病。Kwon[5]研究报道，齿梗孢属真菌（Sclerotium rolfsii）可以引起大蒜茎腐烂病。Lee等[6]研究报道，埃里格孢（Embellisia allii）可引起大蒜鳞茎溃疡病和黑斑病，而且常常与病原菌（Fusarium oxysporum f.sp.cepae）混合互作、共同为害。群体效应是近来日益受到广泛关注的一种细菌群体行为调控机制，是一种信号介导的细胞-细胞的通讯系统。QQ效应化合物和酶可在胡萝卜、大豆、豌豆苗、辣椒、大蒜等植物中天然存在[7]。Pontin等[8]研究表明，大蒜感染白腐病Sclerotium cepivorum病原后，可产生萜烯类抗真菌物质。Chand等[9]研究表明，miRNA394可调控大蒜病原菌[F.oxysporum f.sp.cepae（FOC）]的感染机制。Gálvez等[10]报道引起西班牙贮藏期大蒜鳞茎腐烂病的病原是层生镰刀菌（F.proliferatum），它是一种世界性广泛分布种，还可为害其他一些作物。葛芸英等[3]报道了尖孢镰刀菌是引起江苏太仓及南京周边大蒜鳞茎腐烂病的病原之一。张军高等[11]报道了甘肃省大蒜干腐病病原菌是尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌和茄病镰刀菌。商鸿生等[12]对大蒜鳞茎病害进行了系统调查，包括灰霉病、曲霉病、青霉病、红腐病、炭疽病、白腐病（黑腐小核菌病）、红粉病、黑斑病、软腐病、病毒病害11种病害。盛红梅等[13]报道甘肃省大蒜主要产区的病害调查和病原鉴定，共发现大蒜病害14种，其中真菌性病害9种，细菌性病害1种，主要包括白腐病、白斑病、紫斑病、花叶病、黑头病、叶霉病、青霉病、煤斑病、锈病、软腐病等[14]。有关苍山大蒜鳞茎病害的致病菌鲜见报道。笔者对山东省苍山大蒜鳞茎病原菌进行了调查与研究，旨在为大蒜的防控提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 病害調查
2016年1月至2017年11月对临沂市兰陵县大蒜贮藏期病害情况进行了调查，调查发现苍山大蒜在贮藏期间发生较为严重的病害，对感病情况、病原种类及发生症状进行了观察、记录和拍照。
1.2 病原菌的鉴定
1.2.1 病原菌的分离和纯化。
采用常规的组织分离方法，将病原菌置于PDA培养基上，25 ℃恒温培养7～14 d。在体视镜下挑取适量孢子和菌丝，制成临时玻片，在显微镜下观察，待菌丝和孢子形态特征完全一致时，即可利用单孢分离法再次转接到PDA培养基上进行培养，得到的菌株为纯菌株。
1.2.2
致病性测定。
分别以病原菌的菌丝块作为接种体对其在蒜瓣上的致病性进行测定。选择健康的蒜瓣进行接种，蒜瓣先用75%乙醇进行表面消毒，再分有伤口（用无菌毛笔在叶片表面刷3次）接种和无伤口接种，以有伤口不接种和无伤口不接种为对照，接种后保湿24 h，每隔1～2 d观察症状。发病后，从病斑再次分离病原菌，并与原接种菌进行比较。 1.2.3 病原菌的确认。
1.2.3.1 柯赫氏法则验证。
将纯化后的菌株重新接种到健康的大蒜蒜瓣上，回接7～9 d，接种菌丝块观察有刺伤的和无刺伤的蒜瓣发病症状与田间观察到的是否相同，并设置不接种作为对照。用发病的病斑进行常规分离，证明发病菌是否为大蒜病原菌。
1.2.3.2
蒜瓣组织解剖观察验证。
选取含有病斑的大蒜蒜瓣，用清水冲洗干净，然后再用无菌水洗1～3次，保证蒜瓣表面未附着其他微生物和尘土颗粒。利用徒手切法，切取病斑及其周围的组织，选取合适材料制成玻片，进行病原菌的显微观察和验证。
1.2.4 病原菌形态学的特征观察。
1.2.4.1 病原菌的培养性状观察。将病原菌移接于PDA平板上，25 ℃培养7～8 d，记录菌落形态和颜色，观察分生孢子的形状和大小等形态学特征。
1.2.4.2
病原菌的显微特征观察。在培养后的样品菌落上，挑取菌丝和孢子，制片观察其显微特征，同时参照有关资料进行菌种的形态学鉴定。
1.2.5 病原菌rDNA-ITS的扩增与序列分析。
1.2.5.1
病原菌总DNA的提取。选择试验菌株，采用马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB），28 ℃、150 r/min振荡培养3～4 d，离心收集菌丝体，经冷冻干燥后置于-20 ℃冰箱保存。利用OMEGA公司试剂盒提取DNA。
1.2.5.2
rDNA-ITS的扩增与序列测定。采用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增该病原菌的ITS和5.8S rDNA。PCR反应采用50 μL反应体系，包括2 μL（约10 ng）模板DNA溶液、5.0 μL 10×PCR buffer、4.0 μL 2.5 mmol/L dNTP、7.5 pmol/μL ITS1和ITS4引物各1.5 μL、0.5 μL 5 U/μL Taq酶（含MgCl2），加ddH2O至50 μL。扩增反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min，35个循环；最后72 ℃延伸8 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测以后，直接委托山东省农业科学院测序中心进行纯化和序列测定。
1.2.5.3
病原菌rDNA ITS序列同源性比较。将供试菌株的rDNA ITS序列在NCBI网站上用Blast软件与GenBank中已知种属的rDNA进行序列比对和同源性分析，再结合DNAMAN和mega 6.0软件进行同源性比较分析，从而对供试菌株进行分子鉴定。
2 结果与分析
2.1 蒜瓣的危害与症状特点
对苍山县采收的新鲜大蒜、市售大蒜和仓储大蒜进行了抽样调查。调查发现，蒜头病害种类复杂，其发生规律不尽相同。初侵染菌源有的来自田间，有的来自贮藏处所。有些病害在田间已经发生，在贮运期间进一步发展。有些病原菌在田间侵害蒜株部，造成根部腐烂，在贮运期间由根部蔓延到蒜头基部，蒜瓣变黄褐色，干枯。调查表明，蒜头内在质量较差、生活力降低或收获贮运期间受到机械损伤，是贮运病害发生的主要内在因素。大部分贮蒜病害的病原菌腐生性较强，分布很广，蒜头不论在田间还是在贮运过程中都要被病原菌污染。贮藏期间通风不畅，蒜头受潮发热，则是主要的外部条件。做好田间病害防治，保持贮运环境卫生，尽量减少菌原很重要。贮运条件对蒜头病害的发生起着关键作用。在随机抽样调查的蒜头中，蒜瓣感病率达6%～10%，表明大蒜仓储期病害发生较严重，严重影响大蒜的质量和蒜农的收益。
大蒜鳞莖受害后，感病蒜瓣，病斑颜色呈褐色、黑色或青色，凹陷，变硬或者变软、收缩或者湿润状，有时可见表面长出黑色粉状物、青色粉状物或者白色绒毛，有时呈半透明淡褐色等。总之，大蒜鳞茎受害后的症状因病原物的不同而各有不同。
2.2 病原菌的鉴定
2.2.1 病原菌的分离和纯化。
从兰陵县苍山大蒜基地采集样品500份，从中选取代表性感病蒜瓣，于PDA培养基平板上分离病原菌，25 ℃下培养，各标样均长出不同的菌落，通过菌落特征和显微特征观察，参照有关资料，将大蒜蒜瓣病斑分离物初步鉴定为以下5种：A曲霉（Aspergilus sp.），B青霉（Penicillium sp.），C枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.），D、E镰刀菌（Fusarium sp.）。以上分离物的属种归属和致病性需要进一步验证，其菌落形态见图1。该研究只对致病较强的镰刀菌进行了深入研究，其他分分离物的致病性尚未研究。
2.2.2 病原菌的确认。
采用柯赫氏法则验证，将分离得到的菌株重新接种到健康的大蒜蒜瓣上，回接7～9 d，接种菌丝块的大蒜蒜瓣全部发病，有刺伤的叶片发病比无刺伤的叶片早1～2 d，症状与田间观察
到的相同，对照不发病；用发病的病斑进行常规分离，再次获得与原分离菌基本一致的病原菌，根据柯赫氏法则，证明接种菌即为大蒜蒜瓣的病原菌。经验证5种分离物中，致病性为尖孢镰刀菌>枯草芽孢杆菌>变红镰刀菌>曲霉>青霉。该研究只对尖孢镰刀菌进行了测序和鉴定等。大蒜病原菌尖孢镰刀菌验证性试验结果见图2。
2.2.3 病原菌的形态特征。
2.2.3.1
分离物的培养性状观察。将大蒜蒜瓣的病斑分离物培养后，其菌落形态特征见图3。在PDA培养基平板上，25 ℃培养7 d，直径达9 mm，菌落平展，绒毛状，灰白色，背观淡褐色。培养14 d后菌落为粉色。
2.2.3.2 显微特征观察及形态学鉴定。 （1）自然基质上的显微特征观察。选取含有病斑的大蒜蒜瓣，用清水冲洗干净，再用70%乙醇浸泡1～3 min，无菌水洗1～3次，保证叶片表面未附着其他微生物和尘土颗粒。利用徒手切法，采用纵向和横向的方法切取病斑及其周围的叶片组织，选取合适材料制成玻片，用于病原菌的显微观察和验证。由图4可知，大蒜蒜瓣内部未见病原菌的菌丝分布等，只能观察到大蒜变褐部分有病原孢和菌丝孢子的存在，孢子和菌丝在蒜瓣表面分布多聚集在伤口周围，其他部分偶有零星分布；菌丝淡褐色，有分枝，偶见膨大厚垣细胞和褐色细胞的集合体，菌丝体整体与分离培养物的状态较为一致，菌丝宽度2～10 μm，膨大端部细胞宽度达18 μm。病斑上发现的其他真菌在病原深层组织中分布较少，表明其他真菌可能是空气中的污染菌。
（2）PDA培养基上的显微特征。在25 ℃PDA培养基上培养14 d，形成圆形菌落。菌落平展，生长速度快，菌落灰白色，菌丝部分埋生，部分表生。背面淡褐色。菌丝淡色，有分枝，表面光滑，有隔膜，菌丝宽度3～13 μm（图5-B）。产孢梗多对生，偶见轮生和其他着生方式，柱状或者倒棒状，有时为产包瓶体直接侧生于菌丝上或者端生。分生孢子卵形、梭形，大小不等，（3～12）μm×（1～3）μm，极少见弯曲镰刀型孢子，表面光滑，淡褐色，无隔膜，两端尖细，产孢量较大（图5-A和图5-C）。
2.2.4 病原菌rDNA-ITS的序列分析及同源性。
因为真菌形态学特征受培养基和基质的影响较大，所以单纯进行形态学分类还缺乏一定的科学性。为保证病原菌鉴定的准确性，该研究对分离得到的几种病原物进行了分子生物学辅助鉴定。对1～5号菌分别进行了rDNA-ITS序列分析，对7号细菌进行了16S rRNA序列测定。其中，5号菌株lyu20170012的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测（图6），得到1个约507 bp的片段基因序列。
将菌株lyu20170012的rDNA ITS基因序列与GenBank中已有的DNA序列进行同源性比较，构建系统进化树，结果见表1。结果表明，与其同源性100%的菌株种类均为Fusarium oxysporum，这些同源性菌株登录号为MF435932.1、MF435931.1、KY090780.1、KY090783.1、KX343149.1、KX343146.1、MF355380.1、MF355379.1、MF305836.1、LT841236.1、LT841222.1、MF136593.1、KX276606.1。再结合其形态学特征，最终将该病原菌为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。
3 结论与讨论
通过对苍山大蒜贮藏期鳞茎感病情况调查，发现蒜瓣感病率在10%以上。对病斑菌群进行了分析，发现了5种微生物，其中1种为枯草芽孢杆菌，其他为真菌，它们分别为青霉、曲霉、根霉、变红镰刀菌、尖孢镰刀菌、匐柄霉。根据致病性测定，发病最严重的是尖孢镰刀菌，其次为解淀粉芽孢杆菌，其他依次为变红镰刀菌、黑曲霉、青霉和匐柄霉。該研究只对尖孢镰刀菌进行了详细研究。结合形态学特征和分子生物学技术，最后确定病原为尖孢镰刀菌，该菌在苍山大蒜上首次发现。其他真菌的致病性正在陆续研究之中。由此看出，仓储期大蒜蒜瓣病害的病原菌不是单一的，有时是混合菌群，而且每个蒜瓣的病原菌群可能有所差别。
大蒜真菌类疾病，主要为害近地面假茎基部或贮存的鳞茎，严重时影响大蒜的产量和质量。大蒜病害主要有大蒜叶枯病、大蒜茎腐病、大蒜紫斑病、大蒜细菌性软腐病、大蒜灰霉病、大蒜锈病及大蒜病毒病等[7]。该研究首次报道苍山大蒜鳞茎病原物为尖孢镰刀菌。
大蒜为百合科葱属多年生草本植物，是各国人民喜爱的香辛类蔬菜，在世界各地普遍种植。大蒜不仅是人们常用的安全无毒、无公害、无残留的调味品，而且是成本低、无毒、无副作用、具有独特的药理和营养保健功能。大蒜由于具有较高的营养保健和药用价值而成为国际研究的热点[15]。摸清苍山大蒜仓储期病害种类，开发研制防控贮藏期大蒜病害新技术具有广阔的前景。
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