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摘 要：建立了一种高效液相色谱-串联质谱法测定烟叶中甲胺磷、乙酰甲胺磷、乐果，敌百虫、毒死蜱五种有机磷农药的方法。样品经水和乙腈混合液提取，以石墨化炭黑（GCB）和N-丙基乙二胺（PSA）萃取净化，应用高效液相色谱-串联质谱法在多反应监测模式下进行定性和定量分析。结果表明：该方法性范围在5 ～ 200g/mL之间，线性关系良好（R ≥0.9984），回收率在88.4-106.2%之间，相对标准偏差（RSD）在3.9-6.9%之间，适用于烟叶中5种有机磷农药的检测。
关键词：高效液相色谱；串联质谱法；烟叶；有机磷农药
一、串联质谱法分析烟草中有机磷农药残留的意义概述
农药残留不仅关系到烟草制品的质量安全，还会对坏境和消费者健康造成影响。有机磷农药是一类广谱性杀虫剂，具有药效高、用途广、易分解等特点，在烟草中有着广泛的应用。有机磷农药残留的检测方法有气相色谱法（GC）和气相色谱 - 质谱法（GC-MS）。近年来，随着农药新品种的不断出现，加上各种农药理化性质差异较大，分析基质复杂，气相色谱法越来越不适应。LC/MS具有很好的抗基质干扰能力，且灵敏度较高，因此，有关LC-MS 法分析农药残留的报道越来越多。本文建立高效液相色谱-串联质谱法检测乐果，敌百虫、毒死蜱等5种有机磷农药残留，该方法前处理简便、选择性和灵敏度高，可满足烟草中有机磷农药残留检测的需要。
二、材料和方法
1.材料试剂和仪器
20个国内烤烟烟叶样品。
乙腈、甲醇 、 甲胺磷、乙酰甲胺磷、乐果，敌百虫、毒死蜱、氘代-4-甲基亚硝氨基吡啶基丁酮、PSA和GCB。
Agilent 1200高效液相色谱仪；API5500质谱仪）；Milli-Q超纯水仪；Sigma3-30K高速离心机；VX200 涡旋振荡仪。
2.样品的提取与净化
准确称取研磨过得烟叶样品2.00g于50ml具塞離心管中，加入10ml水充分浸润样品，静置10min。加入10mL乙腈和100μL混合内标溶液，置于涡旋振荡器以3000r/min振荡3min。加入4g无水硫酸镁、1g氯化钠和1g柠檬酸钠，在涡旋振荡器以3000r/min振荡3min。在10000rpm速度下离心5min，取1 mL清液放于1.5mL离心管中，加入200mg无水MgSO4、30mgPSA和30mgGCB，置于涡旋振荡器上以3000r/min振荡3min，再以10000r/min的速率离心5min。取上清液经有机相滤膜过滤后进行LC-MS/MS 分析。
3.分析条件
液相色谱条件：
AtlantisdC18柱；柱温：30℃；流速：0.2mL/min；进样量：10μL；流动相A为0.1%乙酸铵水溶液，流动相B为0.1%乙酸铵水溶液 和甲醇 。在10min内，流动相A的比例从15%升至85%，于5min内降至10%，保持5min。
质谱条件：
离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描模式：正离子扫描；监测模式：多反应监测模式；电喷雾电压：5500V；离子源温度：500℃；碰撞气：40kPa；气帘气：124kPa；雾化气：324kPa；辅助气：324kPa；采集时间：25s。
三、结果与讨论
1.流动相的选择
液相色谱中常用的流动相是甲醇和水，本实验选择甲醇-水（含0.1%乙酸铵 ）体系做流动相。采用正离子模式检测，在流动相中加入乙酸铵有助于有机磷农药的离子化，提高分析的灵敏度，保持良好的峰形。实验显示，甲醇-水（含0.1%乙酸铵）洗脱效果最佳。
2.质谱条件选择
用液相色谱法定量分析固体基质中农药残留时，基质成分复杂，为消除干扰，实验采用串联质谱的多反应监测技术。本实验同时分析了甲胺磷、乙酰甲胺磷、乐果、敌百虫、毒死蜱等5种有机磷化合物的标准品，比较了各分析物的单标和混标的信号强度及峰面积，单标和混标的响应值基本一致，表明这5种有机磷农药离子间的抑制作用很弱，在实验过程中可以采用多反应监测方法共同检测。
采用流动往射分析，以不同的锥孔电压进行正负离子扫描，发现在正离子模式下有较高的灵敏度，而且能得到丰度较高的准分子离子峰和子离子峰。选择子离子时，以丰度最大的碎片离子作为各化合物的子离子，发现去簇电压和碰撞电压对子离子峰的信号及丰度有显著影响。调节各有机磷化合物及内标物的去簇电压和碰撞电压，以子离子的信号最强时所得的去簇电压和碰撞电压值作为最佳实验条件。5种有机磷农药的分子离子峰及选定的子离子峰见表1，5种化合物的混合标准品见图1。
3.线性范围和检出限
以甲醇为溶剂，用不含这几种农药的烟草提取液配制质量浓度为5、10、15、30、50、100、200ng/mL的混合标准系列溶液，均含20ng/mL d4 -NNK（ （内标）。以质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，获得校准曲线。以信噪比的3倍计算检出限。结果表明在 5～200g/mL范围内该方法线性关系良好，方法灵敏度高，相关系数（R）值均大于0.9984，具有较低检测限，可满足实际工作的需要。
4.方法的精确度和精密度
在空白烟样中添加3个水平的5种农药混合标样，分别进行6次平行测定，计算其加标回收率和重复性，结果表明，回收率在88.4-106.2%之间，相对标准偏差在3.9-6.9%之间，可以满足定量需要。
5.实际样品测定
测定了20种不同产地的烟叶样品中5种有机磷农药的含量，结果表明乐果、甲胺磷以及乙酰甲胺磷未检出，仅一种烟叶样品中含有毒死蜱，含量为1.84ug/kg；在20种烟草样品中均含有敌百虫，平均含量为8.26ug/kg。
四、结论
本文建立了烟叶中五种有机磷农药残留的高效液相色谱-串联质谱的分析方法，方法线性范围在5～200ng/mL之间，线性关系好（R≥0.9984），回收率在88.4-106.2%之间，相对标准偏差在3.9-6.9%之间，该方法快速、简单、灵敏度高。
参考文献：
[1]吴春英， 谷风， 白鹭，等.固相萃取-超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪同时测定水中有机磷农药残留[J]. 化学试剂， 2016， 38（6）：528-532.
[2]郑远利， 马莉莉， 吴晓波，等. 固相萃取-高效液相色谱法测定水中3种有机磷农药残留[J]. 理化检验-化学分册， 2017， 53（3）：355-358.
[3] 于鸿，陈安，李晓晶，等.固相萃取结合气相色谱法测定蔬菜中 33 种有机磷农药的残留量[J].中国食品卫生杂志，2011，23（4）：330-335.
关键词：高效液相色谱；串联质谱法；烟叶；有机磷农药
一、串联质谱法分析烟草中有机磷农药残留的意义概述
农药残留不仅关系到烟草制品的质量安全，还会对坏境和消费者健康造成影响。有机磷农药是一类广谱性杀虫剂，具有药效高、用途广、易分解等特点，在烟草中有着广泛的应用。有机磷农药残留的检测方法有气相色谱法（GC）和气相色谱 - 质谱法（GC-MS）。近年来，随着农药新品种的不断出现，加上各种农药理化性质差异较大，分析基质复杂，气相色谱法越来越不适应。LC/MS具有很好的抗基质干扰能力，且灵敏度较高，因此，有关LC-MS 法分析农药残留的报道越来越多。本文建立高效液相色谱-串联质谱法检测乐果，敌百虫、毒死蜱等5种有机磷农药残留，该方法前处理简便、选择性和灵敏度高，可满足烟草中有机磷农药残留检测的需要。
二、材料和方法
1.材料试剂和仪器
20个国内烤烟烟叶样品。
乙腈、甲醇 、 甲胺磷、乙酰甲胺磷、乐果，敌百虫、毒死蜱、氘代-4-甲基亚硝氨基吡啶基丁酮、PSA和GCB。
Agilent 1200高效液相色谱仪；API5500质谱仪）；Milli-Q超纯水仪；Sigma3-30K高速离心机；VX200 涡旋振荡仪。
2.样品的提取与净化
准确称取研磨过得烟叶样品2.00g于50ml具塞離心管中，加入10ml水充分浸润样品，静置10min。加入10mL乙腈和100μL混合内标溶液，置于涡旋振荡器以3000r/min振荡3min。加入4g无水硫酸镁、1g氯化钠和1g柠檬酸钠，在涡旋振荡器以3000r/min振荡3min。在10000rpm速度下离心5min，取1 mL清液放于1.5mL离心管中，加入200mg无水MgSO4、30mgPSA和30mgGCB，置于涡旋振荡器上以3000r/min振荡3min，再以10000r/min的速率离心5min。取上清液经有机相滤膜过滤后进行LC-MS/MS 分析。
3.分析条件
液相色谱条件：
AtlantisdC18柱；柱温：30℃；流速：0.2mL/min；进样量：10μL；流动相A为0.1%乙酸铵水溶液，流动相B为0.1%乙酸铵水溶液 和甲醇 。在10min内，流动相A的比例从15%升至85%，于5min内降至10%，保持5min。
质谱条件：
离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描模式：正离子扫描；监测模式：多反应监测模式；电喷雾电压：5500V；离子源温度：500℃；碰撞气：40kPa；气帘气：124kPa；雾化气：324kPa；辅助气：324kPa；采集时间：25s。
三、结果与讨论
1.流动相的选择
液相色谱中常用的流动相是甲醇和水，本实验选择甲醇-水（含0.1%乙酸铵 ）体系做流动相。采用正离子模式检测，在流动相中加入乙酸铵有助于有机磷农药的离子化，提高分析的灵敏度，保持良好的峰形。实验显示，甲醇-水（含0.1%乙酸铵）洗脱效果最佳。
2.质谱条件选择
用液相色谱法定量分析固体基质中农药残留时，基质成分复杂，为消除干扰，实验采用串联质谱的多反应监测技术。本实验同时分析了甲胺磷、乙酰甲胺磷、乐果、敌百虫、毒死蜱等5种有机磷化合物的标准品，比较了各分析物的单标和混标的信号强度及峰面积，单标和混标的响应值基本一致，表明这5种有机磷农药离子间的抑制作用很弱，在实验过程中可以采用多反应监测方法共同检测。
采用流动往射分析，以不同的锥孔电压进行正负离子扫描，发现在正离子模式下有较高的灵敏度，而且能得到丰度较高的准分子离子峰和子离子峰。选择子离子时，以丰度最大的碎片离子作为各化合物的子离子，发现去簇电压和碰撞电压对子离子峰的信号及丰度有显著影响。调节各有机磷化合物及内标物的去簇电压和碰撞电压，以子离子的信号最强时所得的去簇电压和碰撞电压值作为最佳实验条件。5种有机磷农药的分子离子峰及选定的子离子峰见表1，5种化合物的混合标准品见图1。
3.线性范围和检出限
以甲醇为溶剂，用不含这几种农药的烟草提取液配制质量浓度为5、10、15、30、50、100、200ng/mL的混合标准系列溶液，均含20ng/mL d4 -NNK（ （内标）。以质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，获得校准曲线。以信噪比的3倍计算检出限。结果表明在 5～200g/mL范围内该方法线性关系良好，方法灵敏度高，相关系数（R）值均大于0.9984，具有较低检测限，可满足实际工作的需要。
4.方法的精确度和精密度
在空白烟样中添加3个水平的5种农药混合标样，分别进行6次平行测定，计算其加标回收率和重复性，结果表明，回收率在88.4-106.2%之间，相对标准偏差在3.9-6.9%之间，可以满足定量需要。
5.实际样品测定
测定了20种不同产地的烟叶样品中5种有机磷农药的含量，结果表明乐果、甲胺磷以及乙酰甲胺磷未检出，仅一种烟叶样品中含有毒死蜱，含量为1.84ug/kg；在20种烟草样品中均含有敌百虫，平均含量为8.26ug/kg。
四、结论
本文建立了烟叶中五种有机磷农药残留的高效液相色谱-串联质谱的分析方法，方法线性范围在5～200ng/mL之间，线性关系好（R≥0.9984），回收率在88.4-106.2%之间，相对标准偏差在3.9-6.9%之间，该方法快速、简单、灵敏度高。
参考文献：
[1]吴春英， 谷风， 白鹭，等.固相萃取-超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪同时测定水中有机磷农药残留[J]. 化学试剂， 2016， 38（6）：528-532.
[2]郑远利， 马莉莉， 吴晓波，等. 固相萃取-高效液相色谱法测定水中3种有机磷农药残留[J]. 理化检验-化学分册， 2017， 53（3）：355-358.
[3] 于鸿，陈安，李晓晶，等.固相萃取结合气相色谱法测定蔬菜中 33 种有机磷农药的残留量[J].中国食品卫生杂志，2011，23（4）：330-335.