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【中图分类号】R285【文献标识码】A【文章编号】1632-5281（2016）2
【关键词】 肺癌；miRNA； 基因
肺癌是影响人类健康的常见恶性肿瘤之一，其发病率一直居高不下，在一些欧美发达国家、地区以及我国大城市中，已经位于男性肿瘤首位[1]。肺癌侵袭性转移（IMLC）与肺癌的病理基础、分化类型和临床分期相关。IMLC是肺癌发展至恶性阶段的特征与标志，也常预示着患者生活质量的降低和生命周期的缩短，是衡量肺癌患者抗癌治疗成功与否的重要因素。IMLC是一个由多种因素调控且步骤繁杂的生物学行为过程，是肿瘤细胞由肺部病灶转移至非肺部远端组织而形成癌细胞的过程。微小核糖核酸（miRNA）是一类高保守且长度短的内源性小分子非编码单链核糖核酸，由18～26个核苷酸构成，经碱基配对作用于对应靶mRNA，导致mRNA降解或抑制转录后翻译进而诱导基因沉默，对细胞增殖、分化与凋亡进行调节，广泛参与机体发育、代谢以及肿瘤发生与发展等生理过程。近年来研究发现，miRNA与人类多种癌症的发生发展及侵袭转移密切相关[2]，而有关miRNA与IMLC的研究也有诸多报道，但确切的作用机制尚未阐明。本文对近年来miRNA在肿瘤侵袭性转移中的分子作用机制以及与IMLC相关研究进展作一综述，以进一步提高人们对miRNA在IMLC中研究中的认识。
1 miRNA在肿瘤侵袭性转移中的分子作用机制
1.1 miRNA对癌基因及抑癌基因的表达的调节
miRNA通过促进抑癌基因表达的下调进而使得癌细胞的侵袭转移加速。文献[3]报道结肠癌患者肿瘤细胞cob206f中PDCD4为miRNA-21的靶基因，且两者关系呈负相关，并指出miRNA-21通过抑制PDCD4的表达而影响了结肠肿瘤细胞的侵袭性转移。Meng等[4]对肝肿瘤细胞与周围正常细胞中197种miRNA的表达进行了检测与分析，结果显示病灶组织细胞中miRNA含量远高于癌旁组织，提示miRNA-21可能通过下调PTEN基因的表达而影响PI3K信号传导通路，进而使肿瘤细胞加速增殖与侵袭转移。此外，miRNAs还可下调癌基因的表达而对癌细胞侵袭性转移产生抑制作用。文献[5]报道原癌基因中的c-MET的mRNA水平及其蛋白水平表达可受到miRNA-34a的作用而下调，进而抑制了c-MET诱导的细胞外信号调节信使ERK1/2的活性，阻滞癌细胞的侵袭性转移。
1.2 miRNA对癌细胞相关转移基因表达的调节
miRNA调控癌细胞的侵袭性转移中相关基因如RhoA、RDX及SOX4等的表达而对癌细胞的侵袭性转移进行调控[6]。Sievers等[7]研究发现miRNA-335在乳腺癌细胞中可通过对细胞外基质成分钙粘蛋白C及转录因子SOX4的抑制作用而抑制乳腺肿瘤细胞的侵袭与转运。相关研究[8]证实，透明质烷表面受体CD44是一种癌细胞侵袭性转移的抑制基因，而miRNA 373和520c通过调控其靶分子透明质烷表面受体CD44的表达而加快癌细胞的侵袭性转移。
1.3 miRNA对癌细胞血管生成的调节
癌细胞的血管生成主要是指癌细胞通过分泌更多地促血管生成因子进而对静息状态内皮细胞产生激活作用，使激活的内皮细胞发生增殖并迁移至癌症病灶附近，形成了毛细血管网对肿瘤细胞进行包绕，为肿瘤细胞的生长增殖提供了赖以生存的血液灌注，带来了营养与氧气。新生的毛细血管网壁基膜尚未发育成熟，较为薄弱，通透性高，为肿瘤细胞的侵袭性转移提供了通道。Fus-1与Sufu对癌细胞的侵袭性转运具有抑制作用；GAX与HOXA5的过度表达也具有抑制癌细胞侵袭转移的作用。Lee等[9]报道miRNA-378对Fus-1与Sufu具有靶向抑制作用，对癌细胞表面毛细血管网的形成具有促进作用，加速了癌细胞的侵袭性转移。Chen等[10]研究报道使用反义寡核苷酸技术下调miRNA的表达后，GAX和HOXA5过表达，使得低氧诱导因子-1、血管内皮生长因子受体等促血管生成因子或受体的表达受到抑制，肿瘤细胞侵袭性转移受阻。
2 miRNA在肿瘤侵袭性转移中的调节功能
2.1 let-7家族的调节功能
let-7家族是在秀丽隐杆线虫中发现的miRNA，let-7家族由let-7、miRNA-48、miRNA-84和miRNA-241等成员组成[11]。let-7与靶mRNA的3R非翻译区3翻译区序列以不完全配对结合，阻遏转录后翻译。据报道let-7在肺组织中大量表达，肺癌肿瘤病灶组织中let-7的表达水平显著低于正常肺组织，let7表达下降可以推断肺癌患者预后更差[12]，let7表达水平与癌细胞增殖密切相关，何晓燕等[13]研究发现，通过实验手段使let-7高表达，能够抑制肺癌细胞增殖，同时在肺癌细胞的体外实验中发现Let-7a能够负性调节肺癌A549细胞中NIRF基因的表达，而NIRF基因的表达与细胞增殖密切相关，在肿瘤中持续高表达，而NIRF基因的3’-UTR含有的let-7的结合位点，let-7表达量的显著降低和NIRF蛋白的高表达同时存在，因此推测let-7通过负性调节NIRF表达，调控肺癌细胞的增殖[14]，因此推断Let-7 miRNA家族可作为肺癌潜在的诊断靶点。
2.2 miRNA-133b的调节功能
miRNA-133b最早被发现于心肌细胞，被认为是一种心肌特异性的miRNA，可靶向调节一些关键的与心肌发育及肌信号通路相关的基因。近年来，Chen等[15]报道miRNA-133家族参与了骨骼肌的发育，发挥相互拮抗的作用，调节骨骼肌的增殖和分化。国内关于miRNA-133b与肺癌诊断之间关联的研究，尚处于起步阶段，近年来，应用基因芯片对结直肠癌的miRNA表达谱进行分析后现，miRNA-133b在结直肠癌中的表达水平发生了显著的下调，并与结直肠癌的分化程度等一些病理指标密切相关，同时能够抑制人横纹肌肉瘤癌细胞的迁移[16]。功能上，目前研究限于miRNA-133b在几个肿瘤中可以靶向于少数几个与增殖、侵袭转移等相关的基因[17]。这些文献提示miRNA-133b在不同肿瘤中尽管作用靶点不尽相同，但在肿瘤的不同病理过程中均发挥调节作用。由此可见，miRNA-133b参与肺癌等肿瘤疾病的病理过程已得到基础研究的证实，但目前尚缺乏关于miRNA-133b与临床肺癌诊断之间关联的研究，值得深入探讨。 2.3 miRNA-31的调节功能
miRNA-31最早发现于Hela细胞中，其编码基因定位在9p21.3染色体，种子序列单一且在果蝇及脊柱动物中高度保守[18]。miRNA-31在多种肿瘤的发生、侵袭及转移中发挥重要调节作用[19]。miRNA-31在肺癌组织中呈高表达，其癌基因的作用也已经被初步证实[20]。王生等[21]通过实验表明，miRNA-31作为一个致癌基因，以LATS2和PPP2R2A作为其负调控肿瘤生长的靶点，从而促进肺癌的发生及肿瘤的生长，同时研究[22]证实，这样的抑制效果同样适用于人和鼠类，因此推断miRNA-31的表达水平可能可以用来预测肿块大小，了解肿瘤发展的态势[23]。
2.4 miRNA-21的调节功能
miRNA-21是一种位于17q23.2染色体FRA17B脆性区域上，且具有自主转录单位miRNA长度约22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，主要通过降解靶miRNA或抑制其翻译来调节靶基因的表达[24]。大量哺乳动物实验[25]证明在多种肿瘤细胞中miRNA-21的表达均出现显著异常，参与调控多种抑癌基因的表达；提示miRNA-21作为一个致癌miRNA，在多种肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。印洁等[26]报道miRNA-21的异常表达与肿瘤细胞系的化学抗药性表型显著相关，而肺癌细胞中miRNA-21处于较低的表达状态，因此提示，miRNA-21可以成为临床诊断肺癌的相关基因。
2.5 miRNA-451的调节功能
近年来，在肾癌、胃肠道肿瘤及胶质瘤中均有关于miRNA-451的报道研究[27]，而在肺癌方面报道较少。Wang等[28]报道miRNA-451与非小细胞肺癌的临床病理特点及患者预后紧密相关。随着实验技术进步与发展，姚莉实验室应用转染和G418稳定筛选技术，获得了稳定表达的人A549肺癌细胞株，这为后续的实验研究提供了可靠的细胞模型[29]。有实验研究报道，miRNA-451在胶质瘤、肺癌细胞、胃肠癌细胞中低表达；同时研究发现miRNA-451高表达可抑制非小细胞肺癌的侵入和转移能力[30]，上述研究结果表明miRNA-451可能成为临床诊断肺癌的特异性指标。
2.6 miRNA-126的调节功能
miRNA-126的成熟体是发挥生物学功能的重要片段，能在内皮细胞血管生成过程中发挥重要调控作用[31]。而在肺癌相关的实验研究中发现，miRNA-126的高表达能够影响肺癌细胞周期，使肺癌细胞更多的停留于G1期，同时大量减少处于S期的肺癌细胞，从而实现抑制肺癌细胞的增殖作用[32]。而在非小细胞肺癌患者中研究发现[33]，非小细胞肺癌细胞中miRNA-126基因的低表达状态，使细胞增殖能力增强；提高miRNA-126的表达水平，则能抑制癌细胞的增殖。综合所述，miRNA-126表达水平的高低与肺癌患者的预后密切相关。
3 展望
目前miRNA的检测技术已日渐成熟，RT-PCR技术，即逆转录和实时荧光定量PCR技术已广泛应用于各种标本的miRNA检测。使用RT-PCR方法对采集的血浆样本进行分析，将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合，具有灵敏度高、重复性和特异性好的优点，已成为当下国际公认的核酸分子定量检测金标准。实时荧光定量PCR主要用于DNA或RNA的绝对定量分析，基因表达差异分析及基因分型，技术灵敏而且用途广泛，可用于检测血清中miRNA基因表达水平。检测技术的不断进步，使miRNA作为新的肿瘤标志物应用于包括肺癌在内的多种癌症的临床诊断与治疗，已逐渐成为可能。
参考文献
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通讯联系人：王晓芝
通信地址：滨州医学院附属医院呼吸和重症医学科。
作者简介：高圣红，女，安徽芜湖人，烟台市福山区人民医院呼吸肿瘤内科，滨州医学院呼吸专业在职研究生。
【关键词】 肺癌；miRNA； 基因
肺癌是影响人类健康的常见恶性肿瘤之一，其发病率一直居高不下，在一些欧美发达国家、地区以及我国大城市中，已经位于男性肿瘤首位[1]。肺癌侵袭性转移（IMLC）与肺癌的病理基础、分化类型和临床分期相关。IMLC是肺癌发展至恶性阶段的特征与标志，也常预示着患者生活质量的降低和生命周期的缩短，是衡量肺癌患者抗癌治疗成功与否的重要因素。IMLC是一个由多种因素调控且步骤繁杂的生物学行为过程，是肿瘤细胞由肺部病灶转移至非肺部远端组织而形成癌细胞的过程。微小核糖核酸（miRNA）是一类高保守且长度短的内源性小分子非编码单链核糖核酸，由18～26个核苷酸构成，经碱基配对作用于对应靶mRNA，导致mRNA降解或抑制转录后翻译进而诱导基因沉默，对细胞增殖、分化与凋亡进行调节，广泛参与机体发育、代谢以及肿瘤发生与发展等生理过程。近年来研究发现，miRNA与人类多种癌症的发生发展及侵袭转移密切相关[2]，而有关miRNA与IMLC的研究也有诸多报道，但确切的作用机制尚未阐明。本文对近年来miRNA在肿瘤侵袭性转移中的分子作用机制以及与IMLC相关研究进展作一综述，以进一步提高人们对miRNA在IMLC中研究中的认识。
1 miRNA在肿瘤侵袭性转移中的分子作用机制
1.1 miRNA对癌基因及抑癌基因的表达的调节
miRNA通过促进抑癌基因表达的下调进而使得癌细胞的侵袭转移加速。文献[3]报道结肠癌患者肿瘤细胞cob206f中PDCD4为miRNA-21的靶基因，且两者关系呈负相关，并指出miRNA-21通过抑制PDCD4的表达而影响了结肠肿瘤细胞的侵袭性转移。Meng等[4]对肝肿瘤细胞与周围正常细胞中197种miRNA的表达进行了检测与分析，结果显示病灶组织细胞中miRNA含量远高于癌旁组织，提示miRNA-21可能通过下调PTEN基因的表达而影响PI3K信号传导通路，进而使肿瘤细胞加速增殖与侵袭转移。此外，miRNAs还可下调癌基因的表达而对癌细胞侵袭性转移产生抑制作用。文献[5]报道原癌基因中的c-MET的mRNA水平及其蛋白水平表达可受到miRNA-34a的作用而下调，进而抑制了c-MET诱导的细胞外信号调节信使ERK1/2的活性，阻滞癌细胞的侵袭性转移。
1.2 miRNA对癌细胞相关转移基因表达的调节
miRNA调控癌细胞的侵袭性转移中相关基因如RhoA、RDX及SOX4等的表达而对癌细胞的侵袭性转移进行调控[6]。Sievers等[7]研究发现miRNA-335在乳腺癌细胞中可通过对细胞外基质成分钙粘蛋白C及转录因子SOX4的抑制作用而抑制乳腺肿瘤细胞的侵袭与转运。相关研究[8]证实，透明质烷表面受体CD44是一种癌细胞侵袭性转移的抑制基因，而miRNA 373和520c通过调控其靶分子透明质烷表面受体CD44的表达而加快癌细胞的侵袭性转移。
1.3 miRNA对癌细胞血管生成的调节
癌细胞的血管生成主要是指癌细胞通过分泌更多地促血管生成因子进而对静息状态内皮细胞产生激活作用，使激活的内皮细胞发生增殖并迁移至癌症病灶附近，形成了毛细血管网对肿瘤细胞进行包绕，为肿瘤细胞的生长增殖提供了赖以生存的血液灌注，带来了营养与氧气。新生的毛细血管网壁基膜尚未发育成熟，较为薄弱，通透性高，为肿瘤细胞的侵袭性转移提供了通道。Fus-1与Sufu对癌细胞的侵袭性转运具有抑制作用；GAX与HOXA5的过度表达也具有抑制癌细胞侵袭转移的作用。Lee等[9]报道miRNA-378对Fus-1与Sufu具有靶向抑制作用，对癌细胞表面毛细血管网的形成具有促进作用，加速了癌细胞的侵袭性转移。Chen等[10]研究报道使用反义寡核苷酸技术下调miRNA的表达后，GAX和HOXA5过表达，使得低氧诱导因子-1、血管内皮生长因子受体等促血管生成因子或受体的表达受到抑制，肿瘤细胞侵袭性转移受阻。
2 miRNA在肿瘤侵袭性转移中的调节功能
2.1 let-7家族的调节功能
let-7家族是在秀丽隐杆线虫中发现的miRNA，let-7家族由let-7、miRNA-48、miRNA-84和miRNA-241等成员组成[11]。let-7与靶mRNA的3R非翻译区3翻译区序列以不完全配对结合，阻遏转录后翻译。据报道let-7在肺组织中大量表达，肺癌肿瘤病灶组织中let-7的表达水平显著低于正常肺组织，let7表达下降可以推断肺癌患者预后更差[12]，let7表达水平与癌细胞增殖密切相关，何晓燕等[13]研究发现，通过实验手段使let-7高表达，能够抑制肺癌细胞增殖，同时在肺癌细胞的体外实验中发现Let-7a能够负性调节肺癌A549细胞中NIRF基因的表达，而NIRF基因的表达与细胞增殖密切相关，在肿瘤中持续高表达，而NIRF基因的3’-UTR含有的let-7的结合位点，let-7表达量的显著降低和NIRF蛋白的高表达同时存在，因此推测let-7通过负性调节NIRF表达，调控肺癌细胞的增殖[14]，因此推断Let-7 miRNA家族可作为肺癌潜在的诊断靶点。
2.2 miRNA-133b的调节功能
miRNA-133b最早被发现于心肌细胞，被认为是一种心肌特异性的miRNA，可靶向调节一些关键的与心肌发育及肌信号通路相关的基因。近年来，Chen等[15]报道miRNA-133家族参与了骨骼肌的发育，发挥相互拮抗的作用，调节骨骼肌的增殖和分化。国内关于miRNA-133b与肺癌诊断之间关联的研究，尚处于起步阶段，近年来，应用基因芯片对结直肠癌的miRNA表达谱进行分析后现，miRNA-133b在结直肠癌中的表达水平发生了显著的下调，并与结直肠癌的分化程度等一些病理指标密切相关，同时能够抑制人横纹肌肉瘤癌细胞的迁移[16]。功能上，目前研究限于miRNA-133b在几个肿瘤中可以靶向于少数几个与增殖、侵袭转移等相关的基因[17]。这些文献提示miRNA-133b在不同肿瘤中尽管作用靶点不尽相同，但在肿瘤的不同病理过程中均发挥调节作用。由此可见，miRNA-133b参与肺癌等肿瘤疾病的病理过程已得到基础研究的证实，但目前尚缺乏关于miRNA-133b与临床肺癌诊断之间关联的研究，值得深入探讨。 2.3 miRNA-31的调节功能
miRNA-31最早发现于Hela细胞中，其编码基因定位在9p21.3染色体，种子序列单一且在果蝇及脊柱动物中高度保守[18]。miRNA-31在多种肿瘤的发生、侵袭及转移中发挥重要调节作用[19]。miRNA-31在肺癌组织中呈高表达，其癌基因的作用也已经被初步证实[20]。王生等[21]通过实验表明，miRNA-31作为一个致癌基因，以LATS2和PPP2R2A作为其负调控肿瘤生长的靶点，从而促进肺癌的发生及肿瘤的生长，同时研究[22]证实，这样的抑制效果同样适用于人和鼠类，因此推断miRNA-31的表达水平可能可以用来预测肿块大小，了解肿瘤发展的态势[23]。
2.4 miRNA-21的调节功能
miRNA-21是一种位于17q23.2染色体FRA17B脆性区域上，且具有自主转录单位miRNA长度约22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，主要通过降解靶miRNA或抑制其翻译来调节靶基因的表达[24]。大量哺乳动物实验[25]证明在多种肿瘤细胞中miRNA-21的表达均出现显著异常，参与调控多种抑癌基因的表达；提示miRNA-21作为一个致癌miRNA，在多种肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。印洁等[26]报道miRNA-21的异常表达与肿瘤细胞系的化学抗药性表型显著相关，而肺癌细胞中miRNA-21处于较低的表达状态，因此提示，miRNA-21可以成为临床诊断肺癌的相关基因。
2.5 miRNA-451的调节功能
近年来，在肾癌、胃肠道肿瘤及胶质瘤中均有关于miRNA-451的报道研究[27]，而在肺癌方面报道较少。Wang等[28]报道miRNA-451与非小细胞肺癌的临床病理特点及患者预后紧密相关。随着实验技术进步与发展，姚莉实验室应用转染和G418稳定筛选技术，获得了稳定表达的人A549肺癌细胞株，这为后续的实验研究提供了可靠的细胞模型[29]。有实验研究报道，miRNA-451在胶质瘤、肺癌细胞、胃肠癌细胞中低表达；同时研究发现miRNA-451高表达可抑制非小细胞肺癌的侵入和转移能力[30]，上述研究结果表明miRNA-451可能成为临床诊断肺癌的特异性指标。
2.6 miRNA-126的调节功能
miRNA-126的成熟体是发挥生物学功能的重要片段，能在内皮细胞血管生成过程中发挥重要调控作用[31]。而在肺癌相关的实验研究中发现，miRNA-126的高表达能够影响肺癌细胞周期，使肺癌细胞更多的停留于G1期，同时大量减少处于S期的肺癌细胞，从而实现抑制肺癌细胞的增殖作用[32]。而在非小细胞肺癌患者中研究发现[33]，非小细胞肺癌细胞中miRNA-126基因的低表达状态，使细胞增殖能力增强；提高miRNA-126的表达水平，则能抑制癌细胞的增殖。综合所述，miRNA-126表达水平的高低与肺癌患者的预后密切相关。
3 展望
目前miRNA的检测技术已日渐成熟，RT-PCR技术，即逆转录和实时荧光定量PCR技术已广泛应用于各种标本的miRNA检测。使用RT-PCR方法对采集的血浆样本进行分析，将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合，具有灵敏度高、重复性和特异性好的优点，已成为当下国际公认的核酸分子定量检测金标准。实时荧光定量PCR主要用于DNA或RNA的绝对定量分析，基因表达差异分析及基因分型，技术灵敏而且用途广泛，可用于检测血清中miRNA基因表达水平。检测技术的不断进步，使miRNA作为新的肿瘤标志物应用于包括肺癌在内的多种癌症的临床诊断与治疗，已逐渐成为可能。
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通讯联系人：王晓芝
通信地址：滨州医学院附属医院呼吸和重症医学科。
作者简介：高圣红，女，安徽芜湖人，烟台市福山区人民医院呼吸肿瘤内科，滨州医学院呼吸专业在职研究生。