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摘要：恩替卡韦是目前最常用的抗乙肝病毒治疗药物之一，是高效、低耐药抑制乙肝病毒的一线核苷类药物，是人类控制慢性乙型肝炎的重要武器。其合成工艺及生产工艺中用到了重金属作为催化剂，监测和控制金属杂质含量是控制产品质量的重点。美国药典、欧洲药典、英国药典和中国药典均未收录恩替卡韦的检测方法，进口注册标准中重金属采用目视法，根据样品溶液颜色与标准溶液比较判定重金属的含量，属于半定量不准确。本文论述新开发的恩替卡韦原料中重金属的ICP-MS检测方法，并探讨三种不同消解方式（电热板消解、全自动石墨消解和微波消解）对结果的影响，最后确定的检测方法灵敏度高，检出限低，准确度和精密度均较好，适合恩替卡韦中残留重金属钛和钒的测定。
关键词： ICP-MS;恩替卡韦;残留重金属检测
【中图分类号】F763 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2021）06-021-02
监测和控制药物制剂中的金属杂质是制药行业的重点，因为药物合成及生产工艺中往往会涉及直接添加金属（作为催化剂），或者通过受污染的试剂、生产过程中药物成分接触金属表面等原因无意引入金属。大多数法规中重金属检测主要采用比色法，通过样品溶液颜色与标准颜色较，是半定量分析方法。不过这种方法现已确认是不准确的，且不能全面检测出所有相关金属成分。电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）具有灵敏度高、线性范围宽、选择性好、可测元素覆盖面广、检出限低、能进行多元素同时检测和同位素比测定等优点。是一种具有广阔前景的痕量或超痕量无机多元素分析技术。
恩替卡韦是一种用于治疗慢性乙肝的应用于临床治疗的特效药，是一种选择性鸟嘌呤核苷类似物，其药效良好，并且病人不容易对此产生耐药性，治疗效果好且副作用小，且疗效明显，所以在临床中应用广泛，受到了業内的一致好评。其合成工艺及生产工艺中用到了重金属钛和钒[1]。为准确考察原料中钛和钒的残留量，企业开发了ICP-MS定量测定方法，其中前处理消解方式是ICP-MS检测的重要影响因素。在已经研究确定了仪器参数的情况下，本文对比电热板消解、全自动石墨消解法和微波消解三种消解方法对金属钛和钒元素含量的测定结果的影响，最后得到最优的检测线、重复性、准确度、回收率等。
1、实验过程
1.1仪器
1.2 试药试剂及样品
1.3试验方法
1.3.1 试样溶液的制备
溶剂：5%硝酸溶液;
标准品储备液：取国家标准样品稀释至浓度5μg/mL;
内标溶液：取内标原液稀释成0.2mg/L。
系列标准品线性溶液：精密量取标准品储备液，用溶剂配制成含钒和钛分别为0ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL及150 ng/mL的标准溶液。
1.3.2 样品前处理
电热板消解法：精密称取恩替卡韦约0.1 g，置100ml锥形瓶中，放入玻璃珠，加溶剂10ml后低温加热（95±5℃），待蒸发至约剩2-3ml，冷却到50℃以下，加入3ml硝酸、3ml氢氟酸、1ml高氯酸，加盖，120±5℃加热1h，然后降温到150℃，开盖，直至变为淡黄色透明液体约2-3ml。视消解情况，加适量硝酸、氢氟酸及高氯酸，重复以上步骤。消解完成溶液移至10ml容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，备用。
全自动石墨消解法：精密称取恩替卡韦约0.1 g置于特氟隆消解管中，依次加入4ml盐酸，2ml硝酸，3ml氢氟酸、1ml高氯酸，在自动消解仪中震动（高度100%及强度50%）15s，加回流盖150℃恒温加热2h，赶酸，直至变为淡黄色透明液体约2-3ml，取下冷却，消解完成，溶液移至10ml容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，备用。
微波消解法：精密称取恩替卡韦约0.1 g，置消解罐中，加硝酸1 mL，加盖密封，置微波消解仪中。程序升温：在10min里匀速由室温升至120℃，保持10min，继续在10min里匀速由120℃升至160℃，保持10min，然后在10min里匀速由160℃升至180℃，保持10min，待消解完成后，将消解罐置于可调温电热板上加热赶酸，直至消解罐内溶液至近干，放冷，将内容物转入10mL容量瓶中，并用超纯水冲洗消解罐2～3次，再用超纯水稀释至刻度，摇匀，即得。
1.3.3仪器工作条件
采用Hehe模式中的高灵敏度等离子体模式进行调谐，调谐后的参数如下，均满足仪器安装标准要求的各项指标。[2] [3]
1.3.4测定方法
采用外标标准曲线法进行测定。取上述空白及标准品系列溶液进行直接测定，以内标溶液作校正，记录各响应值。以待测元素浓度（ng/mL）为横坐标，以各溶液待测元素响应值与内标元素响应值之比（比率）为纵坐标，作图，用最小二乘法进行线性回归分析，计算线性方程及相关系数r。元素47Ti线性：y=0.00703+0.00064，r值0.99995;51V线性：y=0.16708+0.0113，r值0.99992，线性结果均达到标准。样品数据代入方程，得出样品重金属含量结果。
2结果与讨论
2.1 三种不同消解方法检出限对比
取同供试品配制方法一致的样品空白溶液连续测定10次，记录响应值。计算空白响应值标准偏差（SD）。以连续测定空白样品溶液响应值的3倍标准偏差（3SD）所对应的待测元素浓度作为检测限，结果见表5。
如表5所示，三种消解方法中微波消解方法检出限最低，石墨消解其次，电热板消解最高。也就是说明微波消解方法可以检出更低浓度的样品中钛和钒的含量，检测灵敏度最高。 2.2 三种不同消解方法重复性对比
按1.3.2步骤，采用三种消解方法进行样品处理，平均测定6次，计算RSD，结果如表6。
如表6所示，微波消解与全自动石墨消解的重复性结果差不多，电热板消解结果重复性更差。分析其原因，跟电热板消解过程中为敞口消解，人为影响多有关，比如加酸、混匀、加热消解、赶酸、定容都需要人工进行，加大了污染及损样风险。
2.3 三种不同消解方法准确度加标回收结果对比
精密称取恩替卡韦约0.1 g，置三种消解方法各自容器中，分别加入浓度（50 ng/mL）的标准溶液，按步骤1.3.2前处理，溶液平行配制3份。按照已经确定的检测方法，取上述溶液进行测定，记录响应值。用标准曲线法计算溶液中钒及钛的回收率，见表7。
从上表可以看出微波消解的平均回收率为98.1%（钛元素）及96.9%（钒元素），高于全自动石墨消解法的94.4%（钛元素）以及91.6%（钒元素），电热板消解法回收率最低为83.7%（钛元素）及84.5%（钒元素），说明样品用微波消解法前处理，准确度最高。
3 结论
从实验结果可以看出，三种不同消解方式（电热板消解、全自动石墨消解和微波消解）各有特点。
电热板消解法为敞开式消解，优点是所用仪器设备比较简单容易上手，设备比较便宜，缺点是整个过程受外界影响很大，容易污染。且酸的用量很大，耗时长，受人为影响很大，容易损样，检测灵敏度，重现性和准确度均较低。另外消解过程中产生的酸雾，对实验室环境污染，有害健康。
全自动石墨消解法全过程不需人工参与，比如可自动加酸、消解、赶酸、定容，减少了人为因素的影响，同时因消解仪上有至少60个消化管孔，同时可进行大批量的样品消解，效率很高。但因也是敞开式消解，仍然有污染及损样风险，不太适合超痕量的样品检测。从实验结果看出，该方法检测灵敏度，重现性和准确度均优于电热板消解法。
微波消解是封闭性消解，损样小，受外界影响小，且使用的样品和用酸量可以很少，大幅减少消化时间，交叉污染风险，消解过程产生的酸雾由仪器通风系统排出室外，对实验室环境污染小，消解结果重现性好，准确度高。缺点就是属于高温高压密闭系统，消解管是耗材，需要定期更换，成本相对比较高。
总之，恩替卡韦为有机高分子化合物，合成和工艺流程中加入钛和钒的量很少，属于痕量级别的检测。在儀器参数已经确定的情况下，前处理方式直接影响数据的准确性，根据实验结果得出：开发的ICP-MS方法若使用微波消解前处理，灵敏度高，检出限低，准确度和精密度均较好，适用于恩替卡韦原料药中钛和钒的含量检测。在设计其他品种的ICP-MS方法时切忌。
参考文献：
[1] 杨守宁，张磊，胡文浩，等. 恩替卡韦的合成[J]. 中国医药工业杂志，2013，44（7）：657-659.
[2] 符传武，韦瑶瑶等，ICP-MS测定食品中的二氧化钛，分析与检测，2014年第33卷第10期： 145～147.
[3] 张兰，龙智翔等，ICP-MS 法测定兰索拉唑中钒残留，现代仪器，2012年第18卷第6期。
关键词： ICP-MS;恩替卡韦;残留重金属检测
【中图分类号】F763 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2021）06-021-02
监测和控制药物制剂中的金属杂质是制药行业的重点，因为药物合成及生产工艺中往往会涉及直接添加金属（作为催化剂），或者通过受污染的试剂、生产过程中药物成分接触金属表面等原因无意引入金属。大多数法规中重金属检测主要采用比色法，通过样品溶液颜色与标准颜色较，是半定量分析方法。不过这种方法现已确认是不准确的，且不能全面检测出所有相关金属成分。电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）具有灵敏度高、线性范围宽、选择性好、可测元素覆盖面广、检出限低、能进行多元素同时检测和同位素比测定等优点。是一种具有广阔前景的痕量或超痕量无机多元素分析技术。
恩替卡韦是一种用于治疗慢性乙肝的应用于临床治疗的特效药，是一种选择性鸟嘌呤核苷类似物，其药效良好，并且病人不容易对此产生耐药性，治疗效果好且副作用小，且疗效明显，所以在临床中应用广泛，受到了業内的一致好评。其合成工艺及生产工艺中用到了重金属钛和钒[1]。为准确考察原料中钛和钒的残留量，企业开发了ICP-MS定量测定方法，其中前处理消解方式是ICP-MS检测的重要影响因素。在已经研究确定了仪器参数的情况下，本文对比电热板消解、全自动石墨消解法和微波消解三种消解方法对金属钛和钒元素含量的测定结果的影响，最后得到最优的检测线、重复性、准确度、回收率等。
1、实验过程
1.1仪器
1.2 试药试剂及样品
1.3试验方法
1.3.1 试样溶液的制备
溶剂：5%硝酸溶液;
标准品储备液：取国家标准样品稀释至浓度5μg/mL;
内标溶液：取内标原液稀释成0.2mg/L。
系列标准品线性溶液：精密量取标准品储备液，用溶剂配制成含钒和钛分别为0ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL及150 ng/mL的标准溶液。
1.3.2 样品前处理
电热板消解法：精密称取恩替卡韦约0.1 g，置100ml锥形瓶中，放入玻璃珠，加溶剂10ml后低温加热（95±5℃），待蒸发至约剩2-3ml，冷却到50℃以下，加入3ml硝酸、3ml氢氟酸、1ml高氯酸，加盖，120±5℃加热1h，然后降温到150℃，开盖，直至变为淡黄色透明液体约2-3ml。视消解情况，加适量硝酸、氢氟酸及高氯酸，重复以上步骤。消解完成溶液移至10ml容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，备用。
全自动石墨消解法：精密称取恩替卡韦约0.1 g置于特氟隆消解管中，依次加入4ml盐酸，2ml硝酸，3ml氢氟酸、1ml高氯酸，在自动消解仪中震动（高度100%及强度50%）15s，加回流盖150℃恒温加热2h，赶酸，直至变为淡黄色透明液体约2-3ml，取下冷却，消解完成，溶液移至10ml容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，备用。
微波消解法：精密称取恩替卡韦约0.1 g，置消解罐中，加硝酸1 mL，加盖密封，置微波消解仪中。程序升温：在10min里匀速由室温升至120℃，保持10min，继续在10min里匀速由120℃升至160℃，保持10min，然后在10min里匀速由160℃升至180℃，保持10min，待消解完成后，将消解罐置于可调温电热板上加热赶酸，直至消解罐内溶液至近干，放冷，将内容物转入10mL容量瓶中，并用超纯水冲洗消解罐2～3次，再用超纯水稀释至刻度，摇匀，即得。
1.3.3仪器工作条件
采用Hehe模式中的高灵敏度等离子体模式进行调谐，调谐后的参数如下，均满足仪器安装标准要求的各项指标。[2] [3]
1.3.4测定方法
采用外标标准曲线法进行测定。取上述空白及标准品系列溶液进行直接测定，以内标溶液作校正，记录各响应值。以待测元素浓度（ng/mL）为横坐标，以各溶液待测元素响应值与内标元素响应值之比（比率）为纵坐标，作图，用最小二乘法进行线性回归分析，计算线性方程及相关系数r。元素47Ti线性：y=0.00703+0.00064，r值0.99995;51V线性：y=0.16708+0.0113，r值0.99992，线性结果均达到标准。样品数据代入方程，得出样品重金属含量结果。
2结果与讨论
2.1 三种不同消解方法检出限对比
取同供试品配制方法一致的样品空白溶液连续测定10次，记录响应值。计算空白响应值标准偏差（SD）。以连续测定空白样品溶液响应值的3倍标准偏差（3SD）所对应的待测元素浓度作为检测限，结果见表5。
如表5所示，三种消解方法中微波消解方法检出限最低，石墨消解其次，电热板消解最高。也就是说明微波消解方法可以检出更低浓度的样品中钛和钒的含量，检测灵敏度最高。 2.2 三种不同消解方法重复性对比
按1.3.2步骤，采用三种消解方法进行样品处理，平均测定6次，计算RSD，结果如表6。
如表6所示，微波消解与全自动石墨消解的重复性结果差不多，电热板消解结果重复性更差。分析其原因，跟电热板消解过程中为敞口消解，人为影响多有关，比如加酸、混匀、加热消解、赶酸、定容都需要人工进行，加大了污染及损样风险。
2.3 三种不同消解方法准确度加标回收结果对比
精密称取恩替卡韦约0.1 g，置三种消解方法各自容器中，分别加入浓度（50 ng/mL）的标准溶液，按步骤1.3.2前处理，溶液平行配制3份。按照已经确定的检测方法，取上述溶液进行测定，记录响应值。用标准曲线法计算溶液中钒及钛的回收率，见表7。
从上表可以看出微波消解的平均回收率为98.1%（钛元素）及96.9%（钒元素），高于全自动石墨消解法的94.4%（钛元素）以及91.6%（钒元素），电热板消解法回收率最低为83.7%（钛元素）及84.5%（钒元素），说明样品用微波消解法前处理，准确度最高。
3 结论
从实验结果可以看出，三种不同消解方式（电热板消解、全自动石墨消解和微波消解）各有特点。
电热板消解法为敞开式消解，优点是所用仪器设备比较简单容易上手，设备比较便宜，缺点是整个过程受外界影响很大，容易污染。且酸的用量很大，耗时长，受人为影响很大，容易损样，检测灵敏度，重现性和准确度均较低。另外消解过程中产生的酸雾，对实验室环境污染，有害健康。
全自动石墨消解法全过程不需人工参与，比如可自动加酸、消解、赶酸、定容，减少了人为因素的影响，同时因消解仪上有至少60个消化管孔，同时可进行大批量的样品消解，效率很高。但因也是敞开式消解，仍然有污染及损样风险，不太适合超痕量的样品检测。从实验结果看出，该方法检测灵敏度，重现性和准确度均优于电热板消解法。
微波消解是封闭性消解，损样小，受外界影响小，且使用的样品和用酸量可以很少，大幅减少消化时间，交叉污染风险，消解过程产生的酸雾由仪器通风系统排出室外，对实验室环境污染小，消解结果重现性好，准确度高。缺点就是属于高温高压密闭系统，消解管是耗材，需要定期更换，成本相对比较高。
总之，恩替卡韦为有机高分子化合物，合成和工艺流程中加入钛和钒的量很少，属于痕量级别的检测。在儀器参数已经确定的情况下，前处理方式直接影响数据的准确性，根据实验结果得出：开发的ICP-MS方法若使用微波消解前处理，灵敏度高，检出限低，准确度和精密度均较好，适用于恩替卡韦原料药中钛和钒的含量检测。在设计其他品种的ICP-MS方法时切忌。
参考文献：
[1] 杨守宁，张磊，胡文浩，等. 恩替卡韦的合成[J]. 中国医药工业杂志，2013，44（7）：657-659.
[2] 符传武，韦瑶瑶等，ICP-MS测定食品中的二氧化钛，分析与检测，2014年第33卷第10期： 145～147.
[3] 张兰，龙智翔等，ICP-MS 法测定兰索拉唑中钒残留，现代仪器，2012年第18卷第6期。