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摘 要：该研究用小米种替代传统斜面工艺，测定其对盐霉素生产水平的影响，结果表明，通过摇瓶培养表达，盐霉素单位水平比对照斜面培养基提高了17.9%。
关键词：盐霉素；小米种；斜面工艺
中图分类号 TS262.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）08-0032-03
盐霉素（salinomycin）[1]是从白色链霉菌（Streptomyces albus）的深层培养液中分离得到的一种聚醚类抗生素，由6分子乙酸，6分子丙酸和3分子丁酸提供的相应酰基缩合而成。由于其广谱高效、不易产生耐药性的特点，国内外广泛用来防治牛、羊、鸡、兔的球虫病，同时可以作为饲料添加剂使用，促进了畜禽生长发育，提高了饲料利用率[2-3]。
盐霉素发酵水平的提高，主要取决于菌种选育和培养条件的优化[4-6]。国内外对如何提高盐霉素的发酵水平一直在不断的探索[7-8]。传统工艺采用斜面接种，种子质量的好坏主要取决于斜面质量，如何提高斜面产孢量是关键。小米种是根据菌株的生理特性，通过在一定配方营养液的基础上加入一定量的小米，以其独特的制备方法，制成表面积大、易于菌株繁殖的培养基。小米种富含丰富的维生素及微量元素，有利于孢子产生。为此，本研究设计小米种替代传统斜面工艺，以期待提高盐霉素的生产水平。
1 材料与方法
1.1 菌种 供试菌株为白色链霉菌（Streptomyces albus）SLF2-075。
1.2 培养基组成
1.2.1 斜面培养基 丙三醇2%，蛋白胨0.2%，酵母膏0.2%，氯化钾0.1%，磷酸二氢钾0.1%，琼脂2%，消前调pH7.0。
1.2.2 小米培养基 用小米替代1.2.1中的斜面培养基中琼脂，其他不变。
1.2.3 摇瓶种子培养基 丙三醇2%，酵母粉0.2%，牛肉膏0.2%，蛋白胨0.2%，氯化钾0.2%，消前调pH7.0。
1.2.4 摇瓶发酵培养基 酒石酸铵0.5%，黄豆饼粉0.5%，氯化钾0.5%，氯化钠0.2%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.01%，小麦胚芽0.5%，豆油20%，轻质碳酸钙1%，pH自然。
1.3 试验方法
1.3.1 试验工艺流程 凍管→一代试管斜面活化（33℃，培养10d）→二代茄瓶斜面或小米（33℃，培养10d）→摇瓶种子（33℃，培养25±5h）→摇瓶发酵（33℃，培养10d）→摇瓶检测。
1.3.2 一代试管斜面 用接种环刮取一环接18×180试管斜面，均匀涂布后置于恒温培养箱33℃培养，控制湿度40%～60%。
1.3.3 二代茄瓶斜面 试管斜面加5mL无菌水，取0.2mL接入空白茄瓶斜面，均匀涂布后置于恒温培养箱33℃培养，控制湿度40%～60%。
1.3.4 小米种制备 （1）小米：美农美季精选小米（要求小米粘性弱，水份含量较低，蒸熟后不结团）。（2）小米种培养基组成：100g小米+150mL斜面营养液（除去琼脂）。（3）小米种制备（茄子瓶）：150mL营养液加到100g小米中，隔水蒸30min，蒸完摊开冷却后，称取25g至茄子瓶，121℃灭菌25min后即为小米种茄瓶培养基（注：灭菌后马上趁热摇散小米，小米种在茄子瓶中呈均匀分散状态）。（4）接种：试管斜面加5ml无菌水，取0.2ml接入小米种茄瓶斜面，平摊充分振拌，使种液充分分散于小米种。
1.3.5 摇瓶种子 （1）摇瓶种子装量100mL/500mL三角瓶。（2）斜面接摇瓶种子：刮取4cm2斜面接到摇瓶种子，置于恒温摇床33℃、220r培养。（3）小米种斜面接摇瓶种子：取10～15粒小米种，约0.1g接摇瓶种子，置于恒温摇床33℃、220r培养。
1.3.6 摇瓶发酵 （1）摇瓶发酵装量100mL/500mL三角瓶。（2）接种培养：接种10%摇瓶种子，置于恒温摇床33℃、220rpm培养。
1.3.7 摇瓶检测 （1）摇瓶种子及摇瓶发酵OD检测：检测原液稀释100倍后562nm测吸光值。（2）摇瓶发酵固含量检测：称取固定量发酵液，105℃恒温4h干燥，前后称重即可得出固形物含量。（3）摇瓶发酵单位检测：用HPLC方法[9]。
2 结果与分析
2.1 斜面和小米种斜面培养结果
2.1.1 成熟斜面孢子情况 小米种斜面颜色更深，表面均匀分布孢子，呈疏松状态。斜面孢子起皱，分布不均匀（具体见图1、2）。
2.1.2 产孢量以斜面为对照 分别加入10mL无菌水，将孢子充分洗脱振荡，测OD562。从检测OD值结果来看，小米种斜面孢子量为对照斜面9.5倍，产孢量大幅度提高（表1）。
2.2 摇瓶种子培养结果 以斜面为对照，3组结果显示：小米种摇瓶种子pH比对照偏低，OD562值都比对照高60%左右，表明小米种的菌量生长更理想（表2）。
2.3 摇瓶发酵培养结果 以斜面为对照，通过4组对比试验，小米种工艺表现pH偏低，固含量和OD都较对照高，表现为菌丝体活性好。同比单位，小米种平均48 940U/mL，对照41 102U/mL，盐霉素产量提高了17.9%（表3）。
3 结论
（1）小米本身富含丰富的氨基酸和微量元素，有利于孢子萌芽生长。小米本身颗粒的均匀度，呈规则圆颗粒状，蒸熟后的小米种粘性小，水分含量低，成舒散状态，原斜面培养基营养成分充分被吸收在小米表面，为菌丝体生长提供充分的营养，且通气状态好，表面积大，为孢子增殖提供了更好的生长环境。
（2）小米种斜面充分保障了菌体的活性，使菌体在摇瓶培养过程中衰退期推迟，无论pH、OD值及固含量，均比对照显示了优势，有利于后续提取处理。同等条件下，摇瓶单位比对照有很大幅度的提高，提高了17.9%。
（3）小米种适用于实际发酵生产。生产过程中，种子一般需要经过2～3阶段的培养，由于小米种本身产孢子量大，是否可以减少种子罐培养级数及优化工艺，还有待于进一步试验研究。
参考文献
[1]戚风娥.盐霉素的应用与生产技术研究[J].试验研究，2005（5）：45-46.
[2]徐奇友，许红.盐霉素及其在饲料中的应用[J].饲料博览，2002（6）：31-32.
[3]刘秀全.高效多功能饲料添加剂-盐霉素[J].饲料工业，1997，18（4）：9-11.
[4]李艳伟.白色链霉菌盐霉素生产工艺分析[J].健康必读杂志，2011（3）：337-339.
[5]吴健，戴桂馥，李宗伟，等.利用抗药性选育盐霉素高产菌株[J].郑州大学学报，理学版.2005，37（4）：92-95.
[6]储消和，王普，宋友礼.盐霉素高产菌的推理选育[J].中国抗生物杂志，2008，33（1）：11-13.
[7]曹廷弼，宋中枢.盐霉素发酵工艺的研究[J].中兽医医药杂志，1998，17（5）：3-5.
[8]杨亚勇，蒋顺进.提高白色链霉菌盐霉素产量的工艺研究[J].中国抗生素杂志，2006，31（11）：661—664.
[9]Miller TW，Chaiet L，Cole DJ，et a1.Avermeetins，newfamily of potent anthelimitic agents：Isolation and chroma-tographic properties[J].Antimicrob Agents Chemother，1979，15（3）：368.
（责编：张宏民）
关键词：盐霉素；小米种；斜面工艺
中图分类号 TS262.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）08-0032-03
盐霉素（salinomycin）[1]是从白色链霉菌（Streptomyces albus）的深层培养液中分离得到的一种聚醚类抗生素，由6分子乙酸，6分子丙酸和3分子丁酸提供的相应酰基缩合而成。由于其广谱高效、不易产生耐药性的特点，国内外广泛用来防治牛、羊、鸡、兔的球虫病，同时可以作为饲料添加剂使用，促进了畜禽生长发育，提高了饲料利用率[2-3]。
盐霉素发酵水平的提高，主要取决于菌种选育和培养条件的优化[4-6]。国内外对如何提高盐霉素的发酵水平一直在不断的探索[7-8]。传统工艺采用斜面接种，种子质量的好坏主要取决于斜面质量，如何提高斜面产孢量是关键。小米种是根据菌株的生理特性，通过在一定配方营养液的基础上加入一定量的小米，以其独特的制备方法，制成表面积大、易于菌株繁殖的培养基。小米种富含丰富的维生素及微量元素，有利于孢子产生。为此，本研究设计小米种替代传统斜面工艺，以期待提高盐霉素的生产水平。
1 材料与方法
1.1 菌种 供试菌株为白色链霉菌（Streptomyces albus）SLF2-075。
1.2 培养基组成
1.2.1 斜面培养基 丙三醇2%，蛋白胨0.2%，酵母膏0.2%，氯化钾0.1%，磷酸二氢钾0.1%，琼脂2%，消前调pH7.0。
1.2.2 小米培养基 用小米替代1.2.1中的斜面培养基中琼脂，其他不变。
1.2.3 摇瓶种子培养基 丙三醇2%，酵母粉0.2%，牛肉膏0.2%，蛋白胨0.2%，氯化钾0.2%，消前调pH7.0。
1.2.4 摇瓶发酵培养基 酒石酸铵0.5%，黄豆饼粉0.5%，氯化钾0.5%，氯化钠0.2%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.01%，小麦胚芽0.5%，豆油20%，轻质碳酸钙1%，pH自然。
1.3 试验方法
1.3.1 试验工艺流程 凍管→一代试管斜面活化（33℃，培养10d）→二代茄瓶斜面或小米（33℃，培养10d）→摇瓶种子（33℃，培养25±5h）→摇瓶发酵（33℃，培养10d）→摇瓶检测。
1.3.2 一代试管斜面 用接种环刮取一环接18×180试管斜面，均匀涂布后置于恒温培养箱33℃培养，控制湿度40%～60%。
1.3.3 二代茄瓶斜面 试管斜面加5mL无菌水，取0.2mL接入空白茄瓶斜面，均匀涂布后置于恒温培养箱33℃培养，控制湿度40%～60%。
1.3.4 小米种制备 （1）小米：美农美季精选小米（要求小米粘性弱，水份含量较低，蒸熟后不结团）。（2）小米种培养基组成：100g小米+150mL斜面营养液（除去琼脂）。（3）小米种制备（茄子瓶）：150mL营养液加到100g小米中，隔水蒸30min，蒸完摊开冷却后，称取25g至茄子瓶，121℃灭菌25min后即为小米种茄瓶培养基（注：灭菌后马上趁热摇散小米，小米种在茄子瓶中呈均匀分散状态）。（4）接种：试管斜面加5ml无菌水，取0.2ml接入小米种茄瓶斜面，平摊充分振拌，使种液充分分散于小米种。
1.3.5 摇瓶种子 （1）摇瓶种子装量100mL/500mL三角瓶。（2）斜面接摇瓶种子：刮取4cm2斜面接到摇瓶种子，置于恒温摇床33℃、220r培养。（3）小米种斜面接摇瓶种子：取10～15粒小米种，约0.1g接摇瓶种子，置于恒温摇床33℃、220r培养。
1.3.6 摇瓶发酵 （1）摇瓶发酵装量100mL/500mL三角瓶。（2）接种培养：接种10%摇瓶种子，置于恒温摇床33℃、220rpm培养。
1.3.7 摇瓶检测 （1）摇瓶种子及摇瓶发酵OD检测：检测原液稀释100倍后562nm测吸光值。（2）摇瓶发酵固含量检测：称取固定量发酵液，105℃恒温4h干燥，前后称重即可得出固形物含量。（3）摇瓶发酵单位检测：用HPLC方法[9]。
2 结果与分析
2.1 斜面和小米种斜面培养结果
2.1.1 成熟斜面孢子情况 小米种斜面颜色更深，表面均匀分布孢子，呈疏松状态。斜面孢子起皱，分布不均匀（具体见图1、2）。
2.1.2 产孢量以斜面为对照 分别加入10mL无菌水，将孢子充分洗脱振荡，测OD562。从检测OD值结果来看，小米种斜面孢子量为对照斜面9.5倍，产孢量大幅度提高（表1）。
2.2 摇瓶种子培养结果 以斜面为对照，3组结果显示：小米种摇瓶种子pH比对照偏低，OD562值都比对照高60%左右，表明小米种的菌量生长更理想（表2）。
2.3 摇瓶发酵培养结果 以斜面为对照，通过4组对比试验，小米种工艺表现pH偏低，固含量和OD都较对照高，表现为菌丝体活性好。同比单位，小米种平均48 940U/mL，对照41 102U/mL，盐霉素产量提高了17.9%（表3）。
3 结论
（1）小米本身富含丰富的氨基酸和微量元素，有利于孢子萌芽生长。小米本身颗粒的均匀度，呈规则圆颗粒状，蒸熟后的小米种粘性小，水分含量低，成舒散状态，原斜面培养基营养成分充分被吸收在小米表面，为菌丝体生长提供充分的营养，且通气状态好，表面积大，为孢子增殖提供了更好的生长环境。
（2）小米种斜面充分保障了菌体的活性，使菌体在摇瓶培养过程中衰退期推迟，无论pH、OD值及固含量，均比对照显示了优势，有利于后续提取处理。同等条件下，摇瓶单位比对照有很大幅度的提高，提高了17.9%。
（3）小米种适用于实际发酵生产。生产过程中，种子一般需要经过2～3阶段的培养，由于小米种本身产孢子量大，是否可以减少种子罐培养级数及优化工艺，还有待于进一步试验研究。
参考文献
[1]戚风娥.盐霉素的应用与生产技术研究[J].试验研究，2005（5）：45-46.
[2]徐奇友，许红.盐霉素及其在饲料中的应用[J].饲料博览，2002（6）：31-32.
[3]刘秀全.高效多功能饲料添加剂-盐霉素[J].饲料工业，1997，18（4）：9-11.
[4]李艳伟.白色链霉菌盐霉素生产工艺分析[J].健康必读杂志，2011（3）：337-339.
[5]吴健，戴桂馥，李宗伟，等.利用抗药性选育盐霉素高产菌株[J].郑州大学学报，理学版.2005，37（4）：92-95.
[6]储消和，王普，宋友礼.盐霉素高产菌的推理选育[J].中国抗生物杂志，2008，33（1）：11-13.
[7]曹廷弼，宋中枢.盐霉素发酵工艺的研究[J].中兽医医药杂志，1998，17（5）：3-5.
[8]杨亚勇，蒋顺进.提高白色链霉菌盐霉素产量的工艺研究[J].中国抗生素杂志，2006，31（11）：661—664.
[9]Miller TW，Chaiet L，Cole DJ，et a1.Avermeetins，newfamily of potent anthelimitic agents：Isolation and chroma-tographic properties[J].Antimicrob Agents Chemother，1979，15（3）：368.
（责编：张宏民）