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摘 要：角质蜡质是植物在长期抗性生理过程中形成的次生代谢产物，也是导致上部叶挂灰，烟叶可用性降低的重要原因。为保障烟叶原料水平和经济效益，解决上部叶挂灰问题成为一种必然需求。本研究报告了目前国内外上部叶挂灰烟形成机理、原因分析及蜡质层对其影响的研究现状，结合生产实际在已有研究文献的基础上总结出蜡质层厚度含量、化学组分、结构对烟叶挂灰造成的影响进行归纳总结。为调整烘烤工艺、揭示烟叶蜡质层调控机制、培育不易挂灰新品种提供参考。
关键词：上部叶;挂灰烟叶;蜡质层
中图分类号：S572 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.10.015
Research Progress on the Relationship between the Formation of Upper Browning Tobacco Leaves and the Wax
SUN Haoyue1， SHI Hongtao2， GU Huizhan2， XIE Liangwen3
（1.Henan Agricultural University， Zhengzhou，Henan 450000，China; 2.Guangyuan Tobacco Company of Sichuan Province，Guangyuan，
Sichuan 628000， China; 3. Sichuan Branch of China National Tobacco Company， Chengdu， Sichuan 610000， China）
Abstract： As a secondary metabolite generated by plants in the long-term resistance physiological process， cutin wax was considered an important factor in causing the browning on upper leaves and reducing usability of tobacco leaves. In order to guarantee the quality level and economic benefits of tobacco raw materials， it has become an inevitable demand to solve the problem of the browning on the upper tobacco leaves. This study reviewed the current status of domestic and foreign research on the formation mechanism， cause analysis， and the influence of waxy layer on the upper leaf browning. Then， combined with the actual production， based on the existing research literature， it summarized the influence of the thickness， content， chemical composition and structure of the waxy layer on the formation of the browning on tobacco leaves. The study aimed to provide references for adjusting the curing process， discovering the regulation mechanism of the waxy layer of tobacco leaves， and cultivating new varieties that are not prone to be browned.
Key words： upper leaves; browning tobacco; wax
上部葉占烤烟整株的1/3，其质量影响着烤烟总体产量。由于上部叶浓度厚实饱满，香气浓郁，为卷烟产品增质提香，改善吃味，对凸显与巩固卷烟牌号香型和品质起着非常重要的作用[1]。但我国上部叶生产中存在的问题较多，叶片组织密而厚，成熟慢，主要体现在青、杂、僵，尤其是上部叶杂色（以挂灰烟为主）和叶片僵硬等问题仍未得到有效地解决。目前，我国上部叶质量和可用性发展受到限制，与国外卷烟配方中上部烟叶占到整个烟叶使用率高达40%的比例相差较大[2]。
挂灰烟一直是烟叶烘烤的研究重点。在实际生产中，由褐变反应而导致的烟叶挂灰是制约烟叶可用性的重要原因之一[3]，同时烟叶颜色是烟草外观质量评价的重要指标，也是烟叶分级、烟叶评价标准、打叶配方质量控制等方面的重要依据。从国内烤烟生产一线研究人员发表的科技论文来看，挂灰烟的形成机制比较复杂，既与栽培条件有关，也受烟叶烘烤过程影响，具体表现为地域环境条件和微环境的变换;异常气候变化;烤烟品种和叶片着生部位的不同，尤其是上部叶最容易挂灰;栽培条件和烟农种植习惯的差异;烟叶成熟状态和编装烟的差异;烘烤工作人员对烘烤工艺和烘烤设施设备的熟悉掌握程度等。总的来说，这些复杂因素糅合在一起，导致对挂灰烟认识不足，发生机理不明，试验重复困难，更难以提出系统的挂灰烟消减技术与对策，指导生产困难。因此，有待对上部叶挂灰问题进行深入、系统的研究。 1 挂灰烟形成的机理
烘烤过程中由于褐变的发生导致烟叶正表面出现局部或全部的灰色、深褐色斑点，称之为挂灰。褐变是普遍存在的一种变色现象，在对食品、植物加工或贮藏的过程中，细胞不可避免受到损伤，酚类物质发生氧化，色泽变暗，这些颜色变化都属于褐变[4]。褐变按其发生的机理可分为酶促褐变与非酶促褐变。
1.1 烟叶的酶促褐变
在1883年Yoghid发现某种活性物质可以使漆树汁变硬后，由Betrand首次研究出这是一种酶蛋白，并在40年后由Keilind等研究出多酚氧化酶的分离过程，为酶促棕色化反应的研究打下基础[5]。酶促棕色化反应是绿色植物细胞的一种正常生理生化反应， 对提高植物抗性、调节光合作用等方面具有积极作用[6]。酶作为植物细胞中呼吸作用的转递介质，维持醌类与酚类化合物的动态平衡，当这种动态平衡被打破，酚类物质迅速转变成大量醌，醌的聚化或结合成黑褐色聚合物造成了褐变现象。由于多酚氧化酶、多酚类底物、氧3个条件同时具备才可能发生酶促褐变反应，所以一般发生在含有活性酶的组织或鲜活的植物组织中[7]。烟叶内富含多种酚类物质和多酚氧化酶，在调制、烘烤、陈化等加工过程中，内部酚、醌含量由于多酚氧化酶的作用下导致其失衡，烟叶外观呈现褐色细小斑块，如同蒙上一层灰一样，通常先出现在叶尖或叶基部。在烘烤过程中由于气候、成熟度、病害、烘烤工艺不完善等因素等造成烟叶挂灰等问题通常出现在烟叶变黄末期和定色期，变黄期烟叶变黄与失水不协调，定色期温度骤升骤降都易造成烟叶挂灰。烟叶中多酚类物质持续被氧化，氧化还原失衡，被氧化成的醌类物质聚合产生黑色沉淀[8]。此时由于烟叶内含物质的不断消耗，导致叶片变薄，重量减轻，烟叶柔韧性变差，光泽不鲜亮，烟叶底色微灰，质量下降。
1.2 烟叶的非酶促褐变
在植物、食品加工与贮存过程中，常发生与酶无关的褐变，称为非酶促褐变。非酶促褐变包括美拉德反应、抗坏血酸氧化分解、多元酚氧化缩合反应、焦糖化反应及金属离子引起的褐变等[10]。在烟叶的调制、发酵、醇化等加工过程中非酶促棕色化反应均有发生，均为美拉德反应。美拉德反应是烟草特征香味形成的主要来源之一，对烟草中美拉德反应的研究最早可追溯到20世纪末[11]。目前，美拉德反应机理以Hoge提出的初级阶段、高级阶段、终级阶段三阶段分类最为经典[12-13]。糖类和氨基酸缩合环化，经过海因式重排与阿马杜里重排形成阿马杜里中间产物，在不同pH值条件下发生，经过斯特雷科尔降解、分子脱氢、异构化等一系列复杂反应，最终形成黑色的大分子物质，称为类黑素[14-16]。在烟叶调制阶段，大分子物质的不断降解导致美拉德反应产物含量大量积累，且呈动态变化，其产物可以赋予烟叶特殊的香味，提升烟叶柔和度，改善烟气吃味。
2 上部叶挂灰的原因分析
根据国内外关于挂灰烟的研究和烘烤实践中的研究发现，烟叶以上部叶最易挂灰。一般来说上部烟叶片较厚，干物质积累多，束缚水含量高，叶绿素含量高，多酚类物质多，多酚氧化酶活性高，这些因素是上部烟难烤的物质基础，而且上部烟在田间时间长，易受到气候影响与病害的影响，遇到冷气候，形成“冷害烟叶”;遇到降水，形成“返青烟叶”;病害容易发生;形成“病害烟叶”;以上外因均是上部烟成为烘烤中“问题烟”的外部因素。
2.1 鲜烟叶素质是影响上部烟叶挂灰的首要因素
黑暴烟叶：韩锦峰等[17]研究发现黑暴烟含水量高，成熟时落黄差，田间鲜烟叶的多酚氧化酶活性较高，同时在烘烤过程的定色中后期失水率低，且多酚氧化酶依旧保持高活性并最终形成挂灰。也有研究发現黑暴烟在烘烤过程中前72 h含水率普遍偏高，叶片失水困难，且PPO活性显著高于正常烟叶，烘烤过程中极易变褐挂灰[18]。
冷害烟叶：张树堂[19]总结出在烟叶成熟期时气温下降使烟叶受冷害，烟叶内含物质转换被扰乱而产生田间“冷挂灰”。这是高海拔烟区上部烟叶产生灰色烟的主要原因，特别是9月中旬以后采收的烟叶，由于温度降低极易产生“冷挂灰”。在纬度高的烟区，影响更为明显。邹阳等[20]研究发现高海拔低气温导致烟叶在田间成熟度较低，成熟期推迟干物质积累减少，烘烤后期常出现严重挂灰和青黄烟。四川烟草所在近年的研究中也发现，四川高海拔地区广元和凉山，在9月份后，由于温度下降较快，上部叶挂灰现象严重，这和云南院的结果相一致。
过熟烟叶：何伟等[21]研究发现一旦烟叶过熟，在田间或者烤房过多地消耗叶片内部的营养物质，导致叶片的细胞间隙增大，组织疏松，如果变黄期稍长，容易造成“饥饿挂灰”。
未熟烟叶：未熟烟叶含水量高，导致烘烤过程中变黄末期至定色PPO活性增高，烟叶由于组织结构紧密变黄中后期失水速度较慢，多酚氧化酶的高活性导致未熟烟叶的烤后烟挂灰率明显高于成熟烟叶[22]。
病害烟叶：据部分烟区反映，染病烤烟，如根结线虫轻微发生的状态，即使鲜烟叶看不出症状，烘烤过程中可出现斑点状的挂灰现象，这与病害破坏烟叶细胞组织结构紧密相关。一般情况下开片好，大田抗病性较强病害发生情况较少的上部叶，挂灰程度也明显减轻[23-24]。
机械损伤烟叶：在加工过程中机械损伤破坏了膜的完整性， 促进了植物细胞的膜脂过氧化作用，导致H2O2等活性氧大量积累，破坏了细胞内活性氧的平衡，膜脂过氧化作用中的最主要产物MDA积累加速了植物的褐变[25]。采收与运输过程中，如果磨伤擦伤烟叶，造成机械损伤。损伤部分烟叶的细胞组织就会破裂，呼吸速率升高，膜脂过氧化造成多酚类物质流出，烘烤过程易造成挂灰杂色。
2.2 烘烤环节中叶片的水分散失和挂灰关系密切
主要体现在黄干不协调上，吕作新等[9]研究发现关键期的叶片含水量与烟叶挂灰问题紧密相关，指出烟叶进入干叶中后期时，叶片的脱水率一般不低于鲜烟叶饱和含水量的30%，如果没达到这一标准，干球温度超过46 ℃的话，可以在短时间形成挂灰。旱天烟叶的水分含量较少，束缚水比例相对增高，自由水比例降低，烟叶组织结构紧密，烘烤时易出现回青或挂灰[26]。尤其是上部叶，蜡质较多，气孔窄小，烟叶烘烤过程中排湿困难，烟叶支脉变黄顺利，但失水程度达不到勾尖卷边状态，即黄干不协调，失水达不到要求，此时快速升温易产生挂灰烟[27]。在烟叶烘烤过程中，不同成熟度烟叶水分含量的不同造成多酚氧化酶活性、多酚类物质积累规律的不同影响着烟叶在变黄末期到定色前期酶促棕色化反应[28]。一方面，也体现在装烟上，如果上部烟装烟量过大，水分难脱，挂灰烟叶时常出现[29]。近年来，在前期的研究中也发现，在烘烤过程中，当采摘的上部叶失水速度较慢，更容易形成挂灰烟。因此，叶片失水速率是影响挂灰烟形成的最重要因素之一。 3 蜡质层是影响上部叶挂灰的主要原因
覆盖于植物地上器官，用于抵御干旱、高温低温、病虫害等的保护屏障被称为角质膜。 植物角质膜从结构可分为3部分， 蜡质层位于最外层，由镶嵌于角质层内部的内层蜡质和覆盖于角质层外部的表皮蜡质组成，占整个角质膜的10%。植物蜡质的合成和运输需要不同细胞器和多种酶复合体的共同参与，是一个非常复杂的过程[30]。关于植物蜡质层的生物合成机制已有较完善的研究，主要集中在模式植物拟南芥上。研究表明，植物表皮蜡质的合成主要通过脱羰基化和酰基还原途径将超长链脂肪酸合成各种蜡质组分，这些蜡质组分通过ABC转运蛋白家族的活性蛋白由质膜输出至细胞外基质，释放蜡质化合物[31]。此外，徐静等[32]的研究表明温度、光照和水分等环境因子的变化在很大程度上会影响到植物表皮蜡质合成的生物过程，进而影响蜡质层各组分的含量与分布。
为更好适应陆地生活，表皮蜡质覆盖于所有陆生植物地上部分各器官和组织表面，介于自然环境与生物环境之间，是植物组织与外界自然环境的第一接触面，为植物适应环境、抵抗各种生物与非生物胁迫、进行自我防护提供重要保障[33]。由多种疏水有机物混合组成与疏水结构的保护层覆盖，形成了植物表皮蜡质，其最基本生理功能就是防止体内水分的非气孔性散失，以降低水分的蒸腾作用[34]。一般认为，表皮蜡质的含量与厚度会影响到植物的水分蒸腾，植物的蜡质含量高其耐旱能力也较强。叶小利等[35]对大豆的研究发现，在受到水分胁迫时，叶片表皮蜡质含量较高的品种，其表皮蒸腾速率也保持在相对较低水平;Premachandra等[36]对玉米叶片的研究表明，植物耐旱能力通常与其叶片表皮蜡质含量成正比;在张海禄等[37]的研究中，抗旱大麦品种叶片表皮的蜡质含量在其受干旱胁迫初期变化明显，推测表皮蜡质含量的迅速增加可能是植物为抵抗干旱而进行自身调节的重要表现。这些结果都表明叶片蜡质层的含量和厚度可能影响叶片水分的散失，从而调控植物的耐旱能力。目前，人们对于植物表皮蜡质层保水性能的研究不仅从表皮蜡质的厚薄程度与含量方面，蜡质组分与结构也起到了重要作用。
角质蜡质在植物长期的生态适应过程中，不仅在抗旱保水中具有重要的生态学功能，其组成成分与结构在植物逆境抵御、病虫害防卫等抵御恶劣生态环境及生物非生物胁迫中也起着关键性作用[38-39]。植物角质层蜡质主要包括脂肪族化合物和环状化合物，脂肪族化合物主要由长链（大于C18）脂肪酸、超长链（C24～C36）脂肪酸、烷烃类、酯类、醇类、醛类、酮类等一系列疏水性物质组成;环状化合物包括酚类、酯类、黄酮类等。其化学组成复杂，且其组分含量、形态结构随生育时期变化而有所差异[40-41]。角质蜡质能够有效阻止植物中水分非气孔性散失，其保水性功能的主导因素比较复杂。不仅与蜡质含量与厚度有关，蜡质的组成成分与结构也具有决定性作用。有研究表明蜡质中烷烃类物质与叶片保水性密切相关，在限制水分蒸腾上扮演重要角色[42]。Gerd V等[43]的研究发现，番茄果实中蜡质的化学成分对表皮水分散失程度起决定性作用，蜡质中脂肪族化合物是防止水分蒸腾的重要影响因素，而三萜类化合物等环状组分的保水性能相对较弱;Oliveira等[44]通过对比发现两地区植被中，蜡质的化学组分是决定蒸发阻力程度的一个重要因素。
作为植物面对环境的“第一保护层”，蜡质层会通过改变自身晶体结构形态与化学组分构建防御机制以减轻外界不利环境因子的胁迫。在烟草的表皮蜡质层组成成分中烷烃类物质占主导地位，初级醇与三萜类化合物含量较少，与果蔬等片状、小棒状、线状、管状等结构不同，烟叶上下表皮蜡质呈无裂纹、无晶体状且较平滑的薄膜状[33]。上部叶中蜡质含量较多，在烘烤过程中由于内部多酚类物质氧化成醌类物质，易出现浅灰色、灰褐色的褐变斑点，出现挂灰现象。烟叶在烘烤过程中随着温度的升高，蜡质的分泌不断增多，蜡质结构改变表面褶皱聚积[45]。Cgjuste等[46]发现，通过乙烯处理增加果实表皮蜡质层含量，并引起表皮蜡质形态变化，果实表皮蜡质形态结构的改变有助于减少非冷害果皮的褐斑。李生娥等[47]通过对苹果梨研究发现，使用HWD处理后果实表皮蜡质溶化，减少了网状裂纹的蜡质结构，降低组织中的通氧量来延缓了苹果梨的成熟和衰老，并减少表皮褐变现象。在储存过程中，蜡质层结构的改变影响着果皮的褐变面积[48]，套袋处理可以降低蜡质含量，改变蜡质结构，影响果实抗逆性与褐变程度[49]。另外，套袋與否对蜡质的化学组分种类和链长有明显的影响，经套袋处理的果实表皮蜡质C30饱和链烷酸丰度明显减少，从而改变果实衰老进程[50]。可见蜡质层不仅能够通过非气孔性散失影响植物的褐变与衰老，化学组分与结构也参与了植物的防御反应。
随着分子生物学的发展，人们对植物角质蜡质对褐变影响的认知也不断深入。有研究发现褐变处理后的茶树新梢组织，物理防御可能被激活，通过渗透调节角质蜡质以抵御逆境胁迫[51]。关于改善上部叶挂灰的研究，主要涉及烤烟品种、成熟度、采收方式、烘烤工艺等方面，从蜡质层方面研究仍然很不完善。至今关于烤烟蜡质层的研究多基于烤烟蜡质层本身结构、成分的研究，对于改善烤烟蜡质层来调控烟叶失水特性以及蜡质层化学组分和结构对挂灰影响的研究还未见报道。而在实际烘烤生产过程中，蜡质层严重阻碍了烟叶变黄与失水协调性，单从烘烤工艺、烤房环境等方面进行探索研究并不能改善烟叶本身的失水特性。
4 结 语
综上所述，虽然国内外已对挂灰形成机理和技术进行了探索，对挂灰烟的“酶促棕色化反应”进行了丰富的研究，并结合实际生产中遇到的情况进行了解释，但鉴于生产中挂灰烟形成原因的复杂性，叶片蜡质层含量、化学组分与结构怎样影响烟叶的失水速率，导致叶片挂灰的理论方面还缺乏深入系统的研究。因此，笔者认为应加强以下3个方面的研究。
（1）加强烤烟表皮蜡质层的组成成分、厚度与形态结构方面的研究，明确蜡质层影响烟叶失水特性途径、方式，探究蜡质层与烘烤特性的关系，为调整烘烤工艺打下基础。 （2）一方面加强成熟期蜡质层的变化规律及其影响因素的研究，蜡质通过应对干旱、温度等多种非生物胁迫来适应环境的变化。探明环境因子对蜡质层形成的影响，明确主效因。例如，四川凉山烟区，海拔较高，上部叶发育后期温度的降低是影响叶片蜡质层形成的主要因素;另一方面，探索采后烟叶蜡质层变化规律与温度和时间的关系，为烤烟后熟技术提供理论参考。
（3）开展对烟叶表皮蜡质层合成调控机制的研究。不同品种植物蜡质层转录途径也不相同，目前在拟南芥、水稻、水果等植物中角质蜡质物理抗性与化学抗性作用已有较完善研究，但烟草中哪些蜡质组分诱导提高了烟叶的抗性，哪些转录因子参与了烟叶蜡质代谢调控，其作用机制仍未完全阐明，仅仅研究这些蜡质基因的调控是不够的。因此，需要认识到蜡质合成的复杂性，寻找筛选其调控因子，随着现代分子技术手段的发展和蜡质相关基因的克隆，利用瞬时表达和转基因技术研究果实蜡质合成关键基因的功能，进一步揭示这些基因对果实表皮蜡质合成的调控机制，从而培育出不易挂灰的烤烟新品种，对未来农业生产具有深远的科学意义和应用前景。
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关键词：上部叶;挂灰烟叶;蜡质层
中图分类号：S572 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.10.015
Research Progress on the Relationship between the Formation of Upper Browning Tobacco Leaves and the Wax
SUN Haoyue1， SHI Hongtao2， GU Huizhan2， XIE Liangwen3
（1.Henan Agricultural University， Zhengzhou，Henan 450000，China; 2.Guangyuan Tobacco Company of Sichuan Province，Guangyuan，
Sichuan 628000， China; 3. Sichuan Branch of China National Tobacco Company， Chengdu， Sichuan 610000， China）
Abstract： As a secondary metabolite generated by plants in the long-term resistance physiological process， cutin wax was considered an important factor in causing the browning on upper leaves and reducing usability of tobacco leaves. In order to guarantee the quality level and economic benefits of tobacco raw materials， it has become an inevitable demand to solve the problem of the browning on the upper tobacco leaves. This study reviewed the current status of domestic and foreign research on the formation mechanism， cause analysis， and the influence of waxy layer on the upper leaf browning. Then， combined with the actual production， based on the existing research literature， it summarized the influence of the thickness， content， chemical composition and structure of the waxy layer on the formation of the browning on tobacco leaves. The study aimed to provide references for adjusting the curing process， discovering the regulation mechanism of the waxy layer of tobacco leaves， and cultivating new varieties that are not prone to be browned.
Key words： upper leaves; browning tobacco; wax
上部葉占烤烟整株的1/3，其质量影响着烤烟总体产量。由于上部叶浓度厚实饱满，香气浓郁，为卷烟产品增质提香，改善吃味，对凸显与巩固卷烟牌号香型和品质起着非常重要的作用[1]。但我国上部叶生产中存在的问题较多，叶片组织密而厚，成熟慢，主要体现在青、杂、僵，尤其是上部叶杂色（以挂灰烟为主）和叶片僵硬等问题仍未得到有效地解决。目前，我国上部叶质量和可用性发展受到限制，与国外卷烟配方中上部烟叶占到整个烟叶使用率高达40%的比例相差较大[2]。
挂灰烟一直是烟叶烘烤的研究重点。在实际生产中，由褐变反应而导致的烟叶挂灰是制约烟叶可用性的重要原因之一[3]，同时烟叶颜色是烟草外观质量评价的重要指标，也是烟叶分级、烟叶评价标准、打叶配方质量控制等方面的重要依据。从国内烤烟生产一线研究人员发表的科技论文来看，挂灰烟的形成机制比较复杂，既与栽培条件有关，也受烟叶烘烤过程影响，具体表现为地域环境条件和微环境的变换;异常气候变化;烤烟品种和叶片着生部位的不同，尤其是上部叶最容易挂灰;栽培条件和烟农种植习惯的差异;烟叶成熟状态和编装烟的差异;烘烤工作人员对烘烤工艺和烘烤设施设备的熟悉掌握程度等。总的来说，这些复杂因素糅合在一起，导致对挂灰烟认识不足，发生机理不明，试验重复困难，更难以提出系统的挂灰烟消减技术与对策，指导生产困难。因此，有待对上部叶挂灰问题进行深入、系统的研究。 1 挂灰烟形成的机理
烘烤过程中由于褐变的发生导致烟叶正表面出现局部或全部的灰色、深褐色斑点，称之为挂灰。褐变是普遍存在的一种变色现象，在对食品、植物加工或贮藏的过程中，细胞不可避免受到损伤，酚类物质发生氧化，色泽变暗，这些颜色变化都属于褐变[4]。褐变按其发生的机理可分为酶促褐变与非酶促褐变。
1.1 烟叶的酶促褐变
在1883年Yoghid发现某种活性物质可以使漆树汁变硬后，由Betrand首次研究出这是一种酶蛋白，并在40年后由Keilind等研究出多酚氧化酶的分离过程，为酶促棕色化反应的研究打下基础[5]。酶促棕色化反应是绿色植物细胞的一种正常生理生化反应， 对提高植物抗性、调节光合作用等方面具有积极作用[6]。酶作为植物细胞中呼吸作用的转递介质，维持醌类与酚类化合物的动态平衡，当这种动态平衡被打破，酚类物质迅速转变成大量醌，醌的聚化或结合成黑褐色聚合物造成了褐变现象。由于多酚氧化酶、多酚类底物、氧3个条件同时具备才可能发生酶促褐变反应，所以一般发生在含有活性酶的组织或鲜活的植物组织中[7]。烟叶内富含多种酚类物质和多酚氧化酶，在调制、烘烤、陈化等加工过程中，内部酚、醌含量由于多酚氧化酶的作用下导致其失衡，烟叶外观呈现褐色细小斑块，如同蒙上一层灰一样，通常先出现在叶尖或叶基部。在烘烤过程中由于气候、成熟度、病害、烘烤工艺不完善等因素等造成烟叶挂灰等问题通常出现在烟叶变黄末期和定色期，变黄期烟叶变黄与失水不协调，定色期温度骤升骤降都易造成烟叶挂灰。烟叶中多酚类物质持续被氧化，氧化还原失衡，被氧化成的醌类物质聚合产生黑色沉淀[8]。此时由于烟叶内含物质的不断消耗，导致叶片变薄，重量减轻，烟叶柔韧性变差，光泽不鲜亮，烟叶底色微灰，质量下降。
1.2 烟叶的非酶促褐变
在植物、食品加工与贮存过程中，常发生与酶无关的褐变，称为非酶促褐变。非酶促褐变包括美拉德反应、抗坏血酸氧化分解、多元酚氧化缩合反应、焦糖化反应及金属离子引起的褐变等[10]。在烟叶的调制、发酵、醇化等加工过程中非酶促棕色化反应均有发生，均为美拉德反应。美拉德反应是烟草特征香味形成的主要来源之一，对烟草中美拉德反应的研究最早可追溯到20世纪末[11]。目前，美拉德反应机理以Hoge提出的初级阶段、高级阶段、终级阶段三阶段分类最为经典[12-13]。糖类和氨基酸缩合环化，经过海因式重排与阿马杜里重排形成阿马杜里中间产物，在不同pH值条件下发生，经过斯特雷科尔降解、分子脱氢、异构化等一系列复杂反应，最终形成黑色的大分子物质，称为类黑素[14-16]。在烟叶调制阶段，大分子物质的不断降解导致美拉德反应产物含量大量积累，且呈动态变化，其产物可以赋予烟叶特殊的香味，提升烟叶柔和度，改善烟气吃味。
2 上部叶挂灰的原因分析
根据国内外关于挂灰烟的研究和烘烤实践中的研究发现，烟叶以上部叶最易挂灰。一般来说上部烟叶片较厚，干物质积累多，束缚水含量高，叶绿素含量高，多酚类物质多，多酚氧化酶活性高，这些因素是上部烟难烤的物质基础，而且上部烟在田间时间长，易受到气候影响与病害的影响，遇到冷气候，形成“冷害烟叶”;遇到降水，形成“返青烟叶”;病害容易发生;形成“病害烟叶”;以上外因均是上部烟成为烘烤中“问题烟”的外部因素。
2.1 鲜烟叶素质是影响上部烟叶挂灰的首要因素
黑暴烟叶：韩锦峰等[17]研究发现黑暴烟含水量高，成熟时落黄差，田间鲜烟叶的多酚氧化酶活性较高，同时在烘烤过程的定色中后期失水率低，且多酚氧化酶依旧保持高活性并最终形成挂灰。也有研究发現黑暴烟在烘烤过程中前72 h含水率普遍偏高，叶片失水困难，且PPO活性显著高于正常烟叶，烘烤过程中极易变褐挂灰[18]。
冷害烟叶：张树堂[19]总结出在烟叶成熟期时气温下降使烟叶受冷害，烟叶内含物质转换被扰乱而产生田间“冷挂灰”。这是高海拔烟区上部烟叶产生灰色烟的主要原因，特别是9月中旬以后采收的烟叶，由于温度降低极易产生“冷挂灰”。在纬度高的烟区，影响更为明显。邹阳等[20]研究发现高海拔低气温导致烟叶在田间成熟度较低，成熟期推迟干物质积累减少，烘烤后期常出现严重挂灰和青黄烟。四川烟草所在近年的研究中也发现，四川高海拔地区广元和凉山，在9月份后，由于温度下降较快，上部叶挂灰现象严重，这和云南院的结果相一致。
过熟烟叶：何伟等[21]研究发现一旦烟叶过熟，在田间或者烤房过多地消耗叶片内部的营养物质，导致叶片的细胞间隙增大，组织疏松，如果变黄期稍长，容易造成“饥饿挂灰”。
未熟烟叶：未熟烟叶含水量高，导致烘烤过程中变黄末期至定色PPO活性增高，烟叶由于组织结构紧密变黄中后期失水速度较慢，多酚氧化酶的高活性导致未熟烟叶的烤后烟挂灰率明显高于成熟烟叶[22]。
病害烟叶：据部分烟区反映，染病烤烟，如根结线虫轻微发生的状态，即使鲜烟叶看不出症状，烘烤过程中可出现斑点状的挂灰现象，这与病害破坏烟叶细胞组织结构紧密相关。一般情况下开片好，大田抗病性较强病害发生情况较少的上部叶，挂灰程度也明显减轻[23-24]。
机械损伤烟叶：在加工过程中机械损伤破坏了膜的完整性， 促进了植物细胞的膜脂过氧化作用，导致H2O2等活性氧大量积累，破坏了细胞内活性氧的平衡，膜脂过氧化作用中的最主要产物MDA积累加速了植物的褐变[25]。采收与运输过程中，如果磨伤擦伤烟叶，造成机械损伤。损伤部分烟叶的细胞组织就会破裂，呼吸速率升高，膜脂过氧化造成多酚类物质流出，烘烤过程易造成挂灰杂色。
2.2 烘烤环节中叶片的水分散失和挂灰关系密切
主要体现在黄干不协调上，吕作新等[9]研究发现关键期的叶片含水量与烟叶挂灰问题紧密相关，指出烟叶进入干叶中后期时，叶片的脱水率一般不低于鲜烟叶饱和含水量的30%，如果没达到这一标准，干球温度超过46 ℃的话，可以在短时间形成挂灰。旱天烟叶的水分含量较少，束缚水比例相对增高，自由水比例降低，烟叶组织结构紧密，烘烤时易出现回青或挂灰[26]。尤其是上部叶，蜡质较多，气孔窄小，烟叶烘烤过程中排湿困难，烟叶支脉变黄顺利，但失水程度达不到勾尖卷边状态，即黄干不协调，失水达不到要求，此时快速升温易产生挂灰烟[27]。在烟叶烘烤过程中，不同成熟度烟叶水分含量的不同造成多酚氧化酶活性、多酚类物质积累规律的不同影响着烟叶在变黄末期到定色前期酶促棕色化反应[28]。一方面，也体现在装烟上，如果上部烟装烟量过大，水分难脱，挂灰烟叶时常出现[29]。近年来，在前期的研究中也发现，在烘烤过程中，当采摘的上部叶失水速度较慢，更容易形成挂灰烟。因此，叶片失水速率是影响挂灰烟形成的最重要因素之一。 3 蜡质层是影响上部叶挂灰的主要原因
覆盖于植物地上器官，用于抵御干旱、高温低温、病虫害等的保护屏障被称为角质膜。 植物角质膜从结构可分为3部分， 蜡质层位于最外层，由镶嵌于角质层内部的内层蜡质和覆盖于角质层外部的表皮蜡质组成，占整个角质膜的10%。植物蜡质的合成和运输需要不同细胞器和多种酶复合体的共同参与，是一个非常复杂的过程[30]。关于植物蜡质层的生物合成机制已有较完善的研究，主要集中在模式植物拟南芥上。研究表明，植物表皮蜡质的合成主要通过脱羰基化和酰基还原途径将超长链脂肪酸合成各种蜡质组分，这些蜡质组分通过ABC转运蛋白家族的活性蛋白由质膜输出至细胞外基质，释放蜡质化合物[31]。此外，徐静等[32]的研究表明温度、光照和水分等环境因子的变化在很大程度上会影响到植物表皮蜡质合成的生物过程，进而影响蜡质层各组分的含量与分布。
为更好适应陆地生活，表皮蜡质覆盖于所有陆生植物地上部分各器官和组织表面，介于自然环境与生物环境之间，是植物组织与外界自然环境的第一接触面，为植物适应环境、抵抗各种生物与非生物胁迫、进行自我防护提供重要保障[33]。由多种疏水有机物混合组成与疏水结构的保护层覆盖，形成了植物表皮蜡质，其最基本生理功能就是防止体内水分的非气孔性散失，以降低水分的蒸腾作用[34]。一般认为，表皮蜡质的含量与厚度会影响到植物的水分蒸腾，植物的蜡质含量高其耐旱能力也较强。叶小利等[35]对大豆的研究发现，在受到水分胁迫时，叶片表皮蜡质含量较高的品种，其表皮蒸腾速率也保持在相对较低水平;Premachandra等[36]对玉米叶片的研究表明，植物耐旱能力通常与其叶片表皮蜡质含量成正比;在张海禄等[37]的研究中，抗旱大麦品种叶片表皮的蜡质含量在其受干旱胁迫初期变化明显，推测表皮蜡质含量的迅速增加可能是植物为抵抗干旱而进行自身调节的重要表现。这些结果都表明叶片蜡质层的含量和厚度可能影响叶片水分的散失，从而调控植物的耐旱能力。目前，人们对于植物表皮蜡质层保水性能的研究不仅从表皮蜡质的厚薄程度与含量方面，蜡质组分与结构也起到了重要作用。
角质蜡质在植物长期的生态适应过程中，不仅在抗旱保水中具有重要的生态学功能，其组成成分与结构在植物逆境抵御、病虫害防卫等抵御恶劣生态环境及生物非生物胁迫中也起着关键性作用[38-39]。植物角质层蜡质主要包括脂肪族化合物和环状化合物，脂肪族化合物主要由长链（大于C18）脂肪酸、超长链（C24～C36）脂肪酸、烷烃类、酯类、醇类、醛类、酮类等一系列疏水性物质组成;环状化合物包括酚类、酯类、黄酮类等。其化学组成复杂，且其组分含量、形态结构随生育时期变化而有所差异[40-41]。角质蜡质能够有效阻止植物中水分非气孔性散失，其保水性功能的主导因素比较复杂。不仅与蜡质含量与厚度有关，蜡质的组成成分与结构也具有决定性作用。有研究表明蜡质中烷烃类物质与叶片保水性密切相关，在限制水分蒸腾上扮演重要角色[42]。Gerd V等[43]的研究发现，番茄果实中蜡质的化学成分对表皮水分散失程度起决定性作用，蜡质中脂肪族化合物是防止水分蒸腾的重要影响因素，而三萜类化合物等环状组分的保水性能相对较弱;Oliveira等[44]通过对比发现两地区植被中，蜡质的化学组分是决定蒸发阻力程度的一个重要因素。
作为植物面对环境的“第一保护层”，蜡质层会通过改变自身晶体结构形态与化学组分构建防御机制以减轻外界不利环境因子的胁迫。在烟草的表皮蜡质层组成成分中烷烃类物质占主导地位，初级醇与三萜类化合物含量较少，与果蔬等片状、小棒状、线状、管状等结构不同，烟叶上下表皮蜡质呈无裂纹、无晶体状且较平滑的薄膜状[33]。上部叶中蜡质含量较多，在烘烤过程中由于内部多酚类物质氧化成醌类物质，易出现浅灰色、灰褐色的褐变斑点，出现挂灰现象。烟叶在烘烤过程中随着温度的升高，蜡质的分泌不断增多，蜡质结构改变表面褶皱聚积[45]。Cgjuste等[46]发现，通过乙烯处理增加果实表皮蜡质层含量，并引起表皮蜡质形态变化，果实表皮蜡质形态结构的改变有助于减少非冷害果皮的褐斑。李生娥等[47]通过对苹果梨研究发现，使用HWD处理后果实表皮蜡质溶化，减少了网状裂纹的蜡质结构，降低组织中的通氧量来延缓了苹果梨的成熟和衰老，并减少表皮褐变现象。在储存过程中，蜡质层结构的改变影响着果皮的褐变面积[48]，套袋处理可以降低蜡质含量，改变蜡质结构，影响果实抗逆性与褐变程度[49]。另外，套袋與否对蜡质的化学组分种类和链长有明显的影响，经套袋处理的果实表皮蜡质C30饱和链烷酸丰度明显减少，从而改变果实衰老进程[50]。可见蜡质层不仅能够通过非气孔性散失影响植物的褐变与衰老，化学组分与结构也参与了植物的防御反应。
随着分子生物学的发展，人们对植物角质蜡质对褐变影响的认知也不断深入。有研究发现褐变处理后的茶树新梢组织，物理防御可能被激活，通过渗透调节角质蜡质以抵御逆境胁迫[51]。关于改善上部叶挂灰的研究，主要涉及烤烟品种、成熟度、采收方式、烘烤工艺等方面，从蜡质层方面研究仍然很不完善。至今关于烤烟蜡质层的研究多基于烤烟蜡质层本身结构、成分的研究，对于改善烤烟蜡质层来调控烟叶失水特性以及蜡质层化学组分和结构对挂灰影响的研究还未见报道。而在实际烘烤生产过程中，蜡质层严重阻碍了烟叶变黄与失水协调性，单从烘烤工艺、烤房环境等方面进行探索研究并不能改善烟叶本身的失水特性。
4 结 语
综上所述，虽然国内外已对挂灰形成机理和技术进行了探索，对挂灰烟的“酶促棕色化反应”进行了丰富的研究，并结合实际生产中遇到的情况进行了解释，但鉴于生产中挂灰烟形成原因的复杂性，叶片蜡质层含量、化学组分与结构怎样影响烟叶的失水速率，导致叶片挂灰的理论方面还缺乏深入系统的研究。因此，笔者认为应加强以下3个方面的研究。
（1）加强烤烟表皮蜡质层的组成成分、厚度与形态结构方面的研究，明确蜡质层影响烟叶失水特性途径、方式，探究蜡质层与烘烤特性的关系，为调整烘烤工艺打下基础。 （2）一方面加强成熟期蜡质层的变化规律及其影响因素的研究，蜡质通过应对干旱、温度等多种非生物胁迫来适应环境的变化。探明环境因子对蜡质层形成的影响，明确主效因。例如，四川凉山烟区，海拔较高，上部叶发育后期温度的降低是影响叶片蜡质层形成的主要因素;另一方面，探索采后烟叶蜡质层变化规律与温度和时间的关系，为烤烟后熟技术提供理论参考。
（3）开展对烟叶表皮蜡质层合成调控机制的研究。不同品种植物蜡质层转录途径也不相同，目前在拟南芥、水稻、水果等植物中角质蜡质物理抗性与化学抗性作用已有较完善研究，但烟草中哪些蜡质组分诱导提高了烟叶的抗性，哪些转录因子参与了烟叶蜡质代谢调控，其作用机制仍未完全阐明，仅仅研究这些蜡质基因的调控是不够的。因此，需要认识到蜡质合成的复杂性，寻找筛选其调控因子，随着现代分子技术手段的发展和蜡质相关基因的克隆，利用瞬时表达和转基因技术研究果实蜡质合成关键基因的功能，进一步揭示这些基因对果实表皮蜡质合成的调控机制，从而培育出不易挂灰的烤烟新品种，对未来农业生产具有深远的科学意义和应用前景。
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