摘 要 目的:观察联合应用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和干细胞因子(SCF)对急性肾小管坏死的修复作用。方法:160只8～10周龄雄性SD大鼠随机分为4组:空白对照组(A组)、缺血再灌注组(I/R,B组)、I/RG-CSF+SCF治疗组(C组)、G-CSF+SCF对照组(D组)。C、D组于手术后予G-CSF 50μg/(kg•日)和SCF 200μg /(kg•日),1次/日×5皮下注射,于术后第5、10、17、24、31天每组分别取8只大鼠处死,流式细胞仪检测静脉血CD34+细胞百分比的变化和免疫组化法检测肾组织CD34+细胞表达变化,光镜下观察肾脏组织病理学改变。结果:C组和D组外周血中CD34+细胞百分比于第5天达高峰,与A组、B组相比,差异有显著性(P<005);C组肾组织内CD34+细胞较A组、B组也明显增多(P<005);术后第5、10、17天C组肾脏病理学改变均明显好于B组(P<005),第24天C组肾脏病理学改变恢复正常,而B组仍异常。结论:粒细胞集落刺激因子和干细胞因子联合应用能加速肾小管坏死的修复。
　　关键词 急性肾小管坏死 骨髓干细胞 粒细胞集落刺激因子 干细胞因子
　　
　　资料与方法
　　实验动物及试剂:选用8～10周龄健康雄性SD大鼠160只,体重250～280g。G-CSF由金坦生物技术股份有限公司提供,SCF由成都地奥九泓制药厂提供。
　　分组及I/R ATN模型建立:160只SD大鼠随机分为4组:空白对照组(A组)、I/R组(B组)、I/R G-CSF+SCF治疗组(C组)、G-CSF+SCF对照组(D组),每组40只。A组:选用正常同龄大鼠,正常饮食和管理。B组:单纯I/R。C组:给I/R ATN模型大鼠G-CSF 50μg/(kg•日)及SCF 200μg/(kg•日),1次/日×5皮下注射。D组:给正常大鼠与C组相同剂量的G-CSF及SCF。参照Supavekin S等[1]的报道制备在体肾I/R模型。
　　标本采集:术后第5、10、17、24、31天每组随机取出8只大鼠处死。腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉成功后,用注射器直接从心脏抽取血液3ml,注入肝素抗凝管中,用流式细胞仪检测外周血单个核细胞中CD34+细胞。抽取血液后迅速摘除左肾,生理盐水冲洗,用手术刀片切成10cm×10cm×02cm大小的组织块,置于10%多聚甲醛溶液中固定,石蜡包埋,组织切片后行HE染色,同时采用Miller等[2]的方法对所有切片进行分级。SABC法检测肾组织中CD34+及光镜下计数阳性细胞。
　　统计学分析:所有数值均采用均数±标准差(X ±S)表示,组间比较采用t检验,利用SPSS130进行数据统计。
　　结 果
　　四组大鼠不同时间点CD34+细胞百分比变化:术后第5天,C、D组CD34+细胞百分比达高峰,与A、B组相比,差异有显著性(P<005),以后逐渐下降。第10天C组与B组相比,差异仍有显著性(P<005)。之后各组间差异均无统计学意义。
　　四组大鼠不同时间点光镜下肾组织形态学改变及病理评分:HE染色A组及D组大鼠左侧肾脏无明显病理改变。B组和C组大鼠在术后第5天可见部分肾小管上皮细胞核固缩破碎、细胞质浓缩、嗜酸性增强、坏死脱落于管腔內,随着时间延长,肾小管损害程度逐渐减轻。第24天,C组病理改变基本消失,而B组第31天才恢复正常。病理学评分结果与肾组织学改变相一致,见表1。
　　四组大鼠不同时间点肾组织CD34+细胞表达:术后第5天、10天及17天,B组和C组肾组织CD34+细胞较A组和D组显著增多(P<005),并且同时间点C组较B组增多更明显(P<005)。术后第24天C组肾组织CD34+细胞恢复正常,而B组仍偏高,但与其他各组比较,其差异无统计学意义。
　　讨 论
　　本实验证实G-CSF和SCF可使外周血中的干细胞数量明显增加,与张建江[3]等研究结果类似。动员出的干细胞需要向缺血区定向迁移,才可能完成对损伤的修复。本实验研究显示,骨髓干细胞可定向迁移到受损伤的肾小管,并且迁移到肾小管的量与外周血中CD34+细胞数量具有高度一致性,从免疫组化结果可以看出,I/R组和I/R G-CSF+SCF治疗组肾组织CD34+细胞均增多,并且I/R G-CSF+SCF治疗组较I/R组增多更明显,而空白对照组和G-CSF+SCF对照组肾组织CD34+细胞无增加。
　　从本实验四组大鼠不同时间点肾小管形态学改变及病理评分中可以看出,肾缺血再灌注后肾小管坏死程度随着时间的推移,可自行缓慢恢复,而给予G-CSF和SCF治疗的大鼠,恢复的速度较I/R组明显增快。提示粒细胞集落刺激因子和干细胞因子联合应用能加速急性肾小管坏死的修复。
　　总之,联合应用G-CSF和SCF可动员I/R大鼠的骨髓干细胞释放到外周血中,并能定向迁移到损伤的肾小管,从而参与肾小管的修复。但是骨髓干细胞是如何动员的、动员出的骨髓干细胞是如何迁移到受损的肾小管以及通过什么机制参与肾小管修复的,有待进一步研究探讨。
　　
　　参考文献
　　1 Supavekin S, Zhang W, Kucherlapati R, et al.Differential gene expression following early renal ischemia/reperfusion.KidneyInt,2003,63:1714-1724.
　　2 Miller SB,Martin DR,Kissane J,et al.Hepatocyte growth factor accelerates recovery from acute ischemic renal injury in rats.AM J Physiol,1994,266:129-134.
　　3 张建江,易著文,党西强,等.干细胞因子联合粒细胞集落刺激因子对单侧输尿管梗阻大鼠骨髓干细胞及内皮祖细胞的动员作用.中国当代儿科杂志,2007,9(2):144-148.