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摘要：目的：使用抗PDL1抗体阻断PDL1/PD1通路，研究负性共刺激分子PDL1与胶质瘤细胞对化疗药物抵抗的相关性及免疫逃逸机制。方法 分离并活化人外周血淋巴细胞与胶质瘤细胞混合培养，同时加入化疗药物，流式细胞术检测淋巴细胞及胶质瘤细胞的增殖情况。结果 抗PDL1抗体可以显著活化淋巴细胞，同时促进胶质瘤细胞的凋亡。结论 阻断PDL1/PD1通路可诱导淋巴细胞活化并促进致敏淋巴细胞介导的抗瘤效应。
关键词：PDL1;胶质瘤;化疗药物
Abstract： Objective To use anti-PDL1 antibody to block the PDL1/PD1 pathway to study the correlation between the negative costimulatory molecule PDL1 and the resistance of glioma cells to chemotherapy drugs and the immune escape mechanism. Methods The mixed culture of human peripheral blood lymphocytes and glioma cells was separated and activated， and chemotherapy drugs were added at the same time. The proliferation of lymphocytes and glioma cells was detected by flow cytometry. Results Anti-PDL1 antibody can significantly activate lymphocytes and promote the apoptosis of glioma cells. Conclusion Blocking the PDL1/PD1 pathway can induce lymphocyte activation and promote the anti-tumor effect mediated by sensitized lymphocytes.
Keywords： PDL1; glioma; chemotherapy drugs
膠质瘤占所有原发性脑肿瘤的 51.4%，是成人中最常见的原发性脑肿瘤 [1]。然而，采用全手术切除继以放疗和辅助化疗的标准治疗，胶质瘤患者的生存率任然较低[2]。胶质瘤诱导局部和全身免疫抑制的能力限制了对肿瘤生长的先天防御和适应性免疫疗法的功效，因此对新疗法的开发提出了重大挑战[3]。
程序性细胞死亡（PD）1受体及其配体（PDL1），可以抑制T淋巴细胞的活性[4]。在过去的 5 年中，使用 PD1 和 PDL1 单克隆抗体 （mAb） 进行免疫治疗已产生显着益处，在多种类型的肿瘤中具有持久的反应和可接受的治疗相关毒性。本研究通过分离并活化人外周血淋巴细胞与胶质瘤细胞混合培养，同时加入化疗药物，通过体外实验，探讨负性共刺激分子PDL1在肿瘤逃避免疫攻击中的作用及其机制。
1 材料及方法
1.1细胞及试剂 U251 细胞系为本实验室冻存; DMEM培养基购自Gibco公司;胰酶购自Sigma公司;替莫唑胺（TMZ）购自先灵葆雅公司;抗PDL1抗体购自eBioscience公司;ConA购自Sigma公司;CFSE购自Sigma公司;凋亡试剂盒购自罗氏公司;替莫唑胺（TMZ）购自先灵葆雅公司。
1.2 细胞混合培养 分离并收集人外周血淋巴细胞，CFSE染色后，加入ConA（20ug/ml） 共孵育。48小时后，按照10：1的比例将淋巴细胞与U251 细胞种植于24孔板进行混合培养，分别加入TMZ（50μmol/L）和（或）抗PDL1抗体（30g/ml）共培养6天。分组如下：①淋巴细胞+ U251 ②淋巴细胞+ U251+ TMZ ③淋巴细胞+ U251+ TMZ+抗PDL1抗体。
1.3流式细胞术检测 收集上述各组肿瘤细胞，然后用冰冷的PBS洗涤，按照凋亡试剂盒说明加入染料，采用流式细胞术检测并分析凋亡结果。收集上述各组淋巴细胞，然后用冰冷的PBS洗涤，采用流式细胞术检测并分析增殖结果。
1.4统计分析 利用SPSS version 12·0软件进行t检验。
2 结果
①淋巴细胞增殖指数为6.3±2.4，U251凋亡率为12.8% ±5.3 ②淋巴细胞增殖指数为4.1±0.8，U251凋亡率为25.1% ±6.1 ③淋巴细胞增殖指数为10.2±3.3，U251凋亡率为45.6% ±4.7。结果表明，抗PDL1抗体能促进淋巴细胞活化并促进化疗药物的抗瘤效应。
3 讨论
PDL1 在神经胶质瘤细胞中表达，与肿瘤分级相关，并有助于产生免疫抗性。 PD1/PDL1 通路在胶质瘤生物学中起着重要作用。在胶质瘤的免疫治疗策略中使用抗 PD1/PDL1 抗体正引起越来越多的关注。为了提高抗PDL1免疫治疗的疗效，许多研究都集中在联合治疗上，包括靶向多种免疫抑制剂、放疗、消融、化疗等分子靶向治疗。本研究利用抗PDL1抗体阻断PDL1/PD1的同时联合化疗药物，探讨PDL1分子对活化淋巴细胞增殖以及肿瘤细胞凋亡的影响，结果证实阻断PDL1的表达可增强胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性。
参考文献：
[1]. Goodenberger ML， Jenkins RB. Genetics of adult glioma. Cancer Genet. 2012;205（12）：613–21.
[2]. Han F， Hu R， Yang H， Liu J， Sui J， Xiang X， Wang F， Chu L， Song S. PTEN gene mutations correlate to poor prognosis in glioma patients： a metaanalysis. Onco Targets Ther. 2016;9：3485–92.
[3]. Gousias K， Markou M， Arzoglou V， Voulgaris S， Vartholomatos G， Kostoula A， Voulgari P， Polyzoidis K， Kyritsis AP. Frequent abnormalities of the immune system in gliomas and correlation with the WHO grading system of malignancy. J Neuroimmunol. 2010;226（1–2）：136–42.
[4]. K?hnke T， Krupka C， Tischer J， Kn?sel T， Subklewe M. Increase of PD-L1 expressing B-precursor ALL cells in a patient resistant to the CD19/CD3-bispecific T cell engager antibody blinatumomab. J Hematol Oncol. 2015;8（1）：111.
基金项目：2020年度湖北省教育厅科学研究计划指导性项目（B2020389）
关键词：PDL1;胶质瘤;化疗药物
Abstract： Objective To use anti-PDL1 antibody to block the PDL1/PD1 pathway to study the correlation between the negative costimulatory molecule PDL1 and the resistance of glioma cells to chemotherapy drugs and the immune escape mechanism. Methods The mixed culture of human peripheral blood lymphocytes and glioma cells was separated and activated， and chemotherapy drugs were added at the same time. The proliferation of lymphocytes and glioma cells was detected by flow cytometry. Results Anti-PDL1 antibody can significantly activate lymphocytes and promote the apoptosis of glioma cells. Conclusion Blocking the PDL1/PD1 pathway can induce lymphocyte activation and promote the anti-tumor effect mediated by sensitized lymphocytes.
Keywords： PDL1; glioma; chemotherapy drugs
膠质瘤占所有原发性脑肿瘤的 51.4%，是成人中最常见的原发性脑肿瘤 [1]。然而，采用全手术切除继以放疗和辅助化疗的标准治疗，胶质瘤患者的生存率任然较低[2]。胶质瘤诱导局部和全身免疫抑制的能力限制了对肿瘤生长的先天防御和适应性免疫疗法的功效，因此对新疗法的开发提出了重大挑战[3]。
程序性细胞死亡（PD）1受体及其配体（PDL1），可以抑制T淋巴细胞的活性[4]。在过去的 5 年中，使用 PD1 和 PDL1 单克隆抗体 （mAb） 进行免疫治疗已产生显着益处，在多种类型的肿瘤中具有持久的反应和可接受的治疗相关毒性。本研究通过分离并活化人外周血淋巴细胞与胶质瘤细胞混合培养，同时加入化疗药物，通过体外实验，探讨负性共刺激分子PDL1在肿瘤逃避免疫攻击中的作用及其机制。
1 材料及方法
1.1细胞及试剂 U251 细胞系为本实验室冻存; DMEM培养基购自Gibco公司;胰酶购自Sigma公司;替莫唑胺（TMZ）购自先灵葆雅公司;抗PDL1抗体购自eBioscience公司;ConA购自Sigma公司;CFSE购自Sigma公司;凋亡试剂盒购自罗氏公司;替莫唑胺（TMZ）购自先灵葆雅公司。
1.2 细胞混合培养 分离并收集人外周血淋巴细胞，CFSE染色后，加入ConA（20ug/ml） 共孵育。48小时后，按照10：1的比例将淋巴细胞与U251 细胞种植于24孔板进行混合培养，分别加入TMZ（50μmol/L）和（或）抗PDL1抗体（30g/ml）共培养6天。分组如下：①淋巴细胞+ U251 ②淋巴细胞+ U251+ TMZ ③淋巴细胞+ U251+ TMZ+抗PDL1抗体。
1.3流式细胞术检测 收集上述各组肿瘤细胞，然后用冰冷的PBS洗涤，按照凋亡试剂盒说明加入染料，采用流式细胞术检测并分析凋亡结果。收集上述各组淋巴细胞，然后用冰冷的PBS洗涤，采用流式细胞术检测并分析增殖结果。
1.4统计分析 利用SPSS version 12·0软件进行t检验。
2 结果
①淋巴细胞增殖指数为6.3±2.4，U251凋亡率为12.8% ±5.3 ②淋巴细胞增殖指数为4.1±0.8，U251凋亡率为25.1% ±6.1 ③淋巴细胞增殖指数为10.2±3.3，U251凋亡率为45.6% ±4.7。结果表明，抗PDL1抗体能促进淋巴细胞活化并促进化疗药物的抗瘤效应。
3 讨论
PDL1 在神经胶质瘤细胞中表达，与肿瘤分级相关，并有助于产生免疫抗性。 PD1/PDL1 通路在胶质瘤生物学中起着重要作用。在胶质瘤的免疫治疗策略中使用抗 PD1/PDL1 抗体正引起越来越多的关注。为了提高抗PDL1免疫治疗的疗效，许多研究都集中在联合治疗上，包括靶向多种免疫抑制剂、放疗、消融、化疗等分子靶向治疗。本研究利用抗PDL1抗体阻断PDL1/PD1的同时联合化疗药物，探讨PDL1分子对活化淋巴细胞增殖以及肿瘤细胞凋亡的影响，结果证实阻断PDL1的表达可增强胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性。
参考文献：
[1]. Goodenberger ML， Jenkins RB. Genetics of adult glioma. Cancer Genet. 2012;205（12）：613–21.
[2]. Han F， Hu R， Yang H， Liu J， Sui J， Xiang X， Wang F， Chu L， Song S. PTEN gene mutations correlate to poor prognosis in glioma patients： a metaanalysis. Onco Targets Ther. 2016;9：3485–92.
[3]. Gousias K， Markou M， Arzoglou V， Voulgaris S， Vartholomatos G， Kostoula A， Voulgari P， Polyzoidis K， Kyritsis AP. Frequent abnormalities of the immune system in gliomas and correlation with the WHO grading system of malignancy. J Neuroimmunol. 2010;226（1–2）：136–42.
[4]. K?hnke T， Krupka C， Tischer J， Kn?sel T， Subklewe M. Increase of PD-L1 expressing B-precursor ALL cells in a patient resistant to the CD19/CD3-bispecific T cell engager antibody blinatumomab. J Hematol Oncol. 2015;8（1）：111.
基金项目：2020年度湖北省教育厅科学研究计划指导性项目（B2020389）