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摘 要 目的：通过阻断肝癌细胞中NF-kappaB(NF-κB)信号通路，研究它与肿瘤细胞增殖、耐药的关系。方法：利用RNA干扰(RNAi)技术阻断NF-κB亚单位p65的表达，RT-PCR和Western blotting法检测p65的mRNA及蛋白表达，MTT法检测细胞的增殖情况，以及联合应用不同浓度化疗药5-Fu对肿瘤细胞增殖的影响。结果：NF-κB的亚单位p65在肝癌细胞质中高表达，p65siRNA可有效地阻断蛋白表达。结论：应用RNAi 技术可以有效地干扰p65表达，抑制肝癌细胞增殖，增强对化疗药5-Fu的敏感性。
关键词 肝细胞 癌 NF-κB RNA干扰 siRNA
资料与方法
细胞系及细胞培养：肝癌细胞系HepG2购自中国科学院上海生化所。细胞在含有10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的1640培养液(Gibco公司)中于37℃、5%CO2条件下培养，实验细胞均处于对数生长期。
抗体和试剂：鼠抗人p65(sc-8008)单克隆抗体和NF-κB p65 siRNA干扰试剂盒购自Santa Cruz Biotechnology 公司，MTT购自Sigma公司。
siRNA的转染：按照Santa Cruz Biotechnology公司siRNA干擾试剂盒说明书的要求，进行转染。在转染前，HepG2(5×104)按一定细胞数铺于6孔板中，使用无抗生素的培养基培养24小时。将含有siRNA的转染试剂与细胞共孵育5小时后，加入新鲜培养基孵育24小时。再培养48小时后收集转染的和未转染的细胞，用RT-PCR和Western Blotting检测p65mRNA及蛋白水平的变化。
RT-PCR：分别合成p65和GAPDH的cDNA第一链。步骤如下：取总RNA1μg，随机六合引物1μl，5×AMV Buffer 4μl，Rnase Inhibitor(20U/μl)1μl，dNTP(10mmol/L)2μl，AMV RT 1μl，加DEPC处理水至20μl，稍离心后混匀，37℃水浴60分钟，70℃水浴10分钟。从上述反应体系中取2μl，加10×PCR Buffer 5μl，2mmol/LdNTP 1μl，25mmol/LMgCl2 3μl，50mmol/L的引物各0.5μl，1U/50μl Taq酶1μl，无菌水36μl，总体积为50μl。反应体系为：94℃预变性，2分钟后开始循环，95℃变性1分钟，57℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环，最后72℃延伸5分钟。
胞浆蛋白的制备：按照细胞质蛋白提取试剂盒说明书(Pierce 公司)，提取细胞质蛋白，Bradford 法检测蛋白质的含量，-70℃保存。
Western Blotting 测定蛋白的表达：从HepG2细胞中取胞质蛋白，与预染的蛋白质分子量标准一起上样。检测p65蛋白表达，经12%SDS-PAGE分离，电转到硝酸纤维膜上。5%脱脂奶粉TBST溶液封闭2小时，抗体按1∶100 孵育4℃过夜，TBST溶液洗涤10分钟×3次，硝酸纤维膜分别与辣根过氧化物酶标记的二抗(1：50000)室温孵育1小时后，TBST溶液洗涤10分钟×3次，DAB显色。实验重复3次。
细胞增殖实验的检测：转染后的HepG2细胞和未转染的对照细胞，将细胞浓度调为1×104/ml，接种于96孔板中，每孔200μl，平行5孔，置于37℃，CO2培养箱中培养。实验设空白对照组和siRNA干扰组，分别于24、48和72小时加入MTT20μl，继续培养4小时后弃上清，每孔加入200μlDMSO，震荡15分钟，在酶标仪上读出吸光值。
统计学处理：数据用X±S表示，用SPSS10.0进行t检验，检验水准α=0.05。
结 果
RT-PCR扩增HepG2细胞p65基因的cDNA片段：HepG2细胞总RNA经变性凝胶电泳和测260nmOD值检验，总RNA的提取质量较好。HepG2细胞转染siRNA 0和72小时后，RT-PCR法检测细胞中p65mRNA表达水平。结果显示，转染后的HepG2细胞，p65mRNA的表达水平下调，提示：在肝癌细胞中，p65siRNA可以特异性地降解p65mRNA。
细胞转染siRNA后各组p65蛋白的表达水平：HepG2细胞转染siRNA 48和72小时后，收集细胞提取蛋白，用Western Blotting 法检测细胞中p65的蛋白表达水平。实验结果表明，HepG2细胞转染后p65蛋白的表达水平下调，而非抑制蛋白MAPK的表达无影响。说明针对p65的siRNA可特异性地抑制p65的表达，对其他蛋白的表达无影响。
p65特异性siRNA对HepG2细胞增殖的影响：在转染后24、48和72小时分别检测转染组和未转染组细胞的生长情况，siRNA干扰组和对照组的A值在48和72小时均有显著性差异(P<0.05)。
讨 论
在本实验中，我们证实了在肝癌细胞系中，存在高表达的NF-κB亚单位p65，并且活化的NF-κB在肝癌细胞的生存和增殖中起着重要作用。p65siRNA可引起特异性的基因沉默，有效地阻断活化的NF-κB的信号通路，并增强肿瘤细胞对化疗药的敏感性。由于激活的NF-κB信号通路在肿瘤的发生发展及抗凋亡中起着重要的作用，因此阻断NF-κB的信号通路将为基因治疗提供一个较好的靶点。
参考文献
1 Pham LV，Tamyo AT，Yoshimura LC.Inhibition of constitutive NF-κB activation in mantle cell lymphoma B cells leads to induction of cell cycle arrest and apoptosis.J Immunol，2003，171：88-95.
关键词 肝细胞 癌 NF-κB RNA干扰 siRNA
资料与方法
细胞系及细胞培养：肝癌细胞系HepG2购自中国科学院上海生化所。细胞在含有10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的1640培养液(Gibco公司)中于37℃、5%CO2条件下培养，实验细胞均处于对数生长期。
抗体和试剂：鼠抗人p65(sc-8008)单克隆抗体和NF-κB p65 siRNA干扰试剂盒购自Santa Cruz Biotechnology 公司，MTT购自Sigma公司。
siRNA的转染：按照Santa Cruz Biotechnology公司siRNA干擾试剂盒说明书的要求，进行转染。在转染前，HepG2(5×104)按一定细胞数铺于6孔板中，使用无抗生素的培养基培养24小时。将含有siRNA的转染试剂与细胞共孵育5小时后，加入新鲜培养基孵育24小时。再培养48小时后收集转染的和未转染的细胞，用RT-PCR和Western Blotting检测p65mRNA及蛋白水平的变化。
RT-PCR：分别合成p65和GAPDH的cDNA第一链。步骤如下：取总RNA1μg，随机六合引物1μl，5×AMV Buffer 4μl，Rnase Inhibitor(20U/μl)1μl，dNTP(10mmol/L)2μl，AMV RT 1μl，加DEPC处理水至20μl，稍离心后混匀，37℃水浴60分钟，70℃水浴10分钟。从上述反应体系中取2μl，加10×PCR Buffer 5μl，2mmol/LdNTP 1μl，25mmol/LMgCl2 3μl，50mmol/L的引物各0.5μl，1U/50μl Taq酶1μl，无菌水36μl，总体积为50μl。反应体系为：94℃预变性，2分钟后开始循环，95℃变性1分钟，57℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环，最后72℃延伸5分钟。
胞浆蛋白的制备：按照细胞质蛋白提取试剂盒说明书(Pierce 公司)，提取细胞质蛋白，Bradford 法检测蛋白质的含量，-70℃保存。
Western Blotting 测定蛋白的表达：从HepG2细胞中取胞质蛋白，与预染的蛋白质分子量标准一起上样。检测p65蛋白表达，经12%SDS-PAGE分离，电转到硝酸纤维膜上。5%脱脂奶粉TBST溶液封闭2小时，抗体按1∶100 孵育4℃过夜，TBST溶液洗涤10分钟×3次，硝酸纤维膜分别与辣根过氧化物酶标记的二抗(1：50000)室温孵育1小时后，TBST溶液洗涤10分钟×3次，DAB显色。实验重复3次。
细胞增殖实验的检测：转染后的HepG2细胞和未转染的对照细胞，将细胞浓度调为1×104/ml，接种于96孔板中，每孔200μl，平行5孔，置于37℃，CO2培养箱中培养。实验设空白对照组和siRNA干扰组，分别于24、48和72小时加入MTT20μl，继续培养4小时后弃上清，每孔加入200μlDMSO，震荡15分钟，在酶标仪上读出吸光值。
统计学处理：数据用X±S表示，用SPSS10.0进行t检验，检验水准α=0.05。
结 果
RT-PCR扩增HepG2细胞p65基因的cDNA片段：HepG2细胞总RNA经变性凝胶电泳和测260nmOD值检验，总RNA的提取质量较好。HepG2细胞转染siRNA 0和72小时后，RT-PCR法检测细胞中p65mRNA表达水平。结果显示，转染后的HepG2细胞，p65mRNA的表达水平下调，提示：在肝癌细胞中，p65siRNA可以特异性地降解p65mRNA。
细胞转染siRNA后各组p65蛋白的表达水平：HepG2细胞转染siRNA 48和72小时后，收集细胞提取蛋白，用Western Blotting 法检测细胞中p65的蛋白表达水平。实验结果表明，HepG2细胞转染后p65蛋白的表达水平下调，而非抑制蛋白MAPK的表达无影响。说明针对p65的siRNA可特异性地抑制p65的表达，对其他蛋白的表达无影响。
p65特异性siRNA对HepG2细胞增殖的影响：在转染后24、48和72小时分别检测转染组和未转染组细胞的生长情况，siRNA干扰组和对照组的A值在48和72小时均有显著性差异(P<0.05)。
讨 论
在本实验中，我们证实了在肝癌细胞系中，存在高表达的NF-κB亚单位p65，并且活化的NF-κB在肝癌细胞的生存和增殖中起着重要作用。p65siRNA可引起特异性的基因沉默，有效地阻断活化的NF-κB的信号通路，并增强肿瘤细胞对化疗药的敏感性。由于激活的NF-κB信号通路在肿瘤的发生发展及抗凋亡中起着重要的作用，因此阻断NF-κB的信号通路将为基因治疗提供一个较好的靶点。
参考文献
1 Pham LV，Tamyo AT，Yoshimura LC.Inhibition of constitutive NF-κB activation in mantle cell lymphoma B cells leads to induction of cell cycle arrest and apoptosis.J Immunol，2003，171：88-95.